添加α-酮戊二酸脫氫酶抑制劑實現α-酮戊二酸過量積累的方法

2023-04-23 15:55:31

專利名稱：添加α-酮戊二酸脫氫酶抑制劑實現α-酮戊二酸過量積累的方法
技術領域：
本發明涉及一種添加a-酮戊二酸脫氫酶(KGDH)抑制劑實現a-酮戊二酸 (KG)過量積累的方法。通過研究KGDH抑制劑對代謝流流向及相應的代謝通 量的影響，達到a-酮戊二酸的大量積累。屬於蛋白質水平的代謝調控優化發酵 過程技術領域。
技術背景a-酮戊二酸，又稱a-膠酮酸，2-氧代戊二酸或a-羰基戊二酸，是三羧酸 (TCA)循環中重要的中間產物之一，在微生物細胞的代謝中起著重要的作用，也 是合成多種胺基酸、蛋白質的重要前體物質。其結構式為〇 Oa-酮戊二酸結構式a-酮戊二酸在醫藥、有機合成、營養強化劑等領域有著重要的應用前景， 目前主要應用領域為作為運動營養飲料的成分；有機中間體；生化試劑和測 肝功能的配套試劑；體格增強補劑；降低術後患者和長期病人的機體損耗；在 腦部作為酪氨酸和穀氨酸的前體；同時研究還表明，a-酮戊二酸具有抗氰作用， 與亞硝酸鈉、硫代硫酸鈉配合使用可提高抗氰能力，且有抗驚厥作用。oc-酮戊 二酸目前主要消費於醫療機構，用來診斷和對神經疾病進行治療。過氧化氫、甲氨蝶呤、次氯酸鈉和羥基硫氨對KGDH的抑制作用在人類神 經和心臟疾病中的研究廣泛，而在微生物尤其是酵母中的研究鮮見報導。本研 究確定了這四種物質對KGDH的抑制作用，同時明確了抑制濃度和添加時間， 為TCA循環中間代謝產物的發酵研究提供了一個新的思路。 發明內容本發明的目的是提供一種添加a-酮戊二酸脫氫酶抑制劑實現a-酮戊二酸過 量積累的方法。利用多重營養缺陷型的光滑球擬酵母(T. g/Wrato)CCTCC M202019發酵生產KG，在發酵過程中添加適量的KGDH抑制劑，有目的的抑 制KGDH活性，達到大量積累KG的目的。本發明的技術方案 一種添加a-酮戊二酸脫氫酶抑制劑實現ot-酮戊二酸過 量積累的方法，是利用多重維生素營養缺陷型的光滑球擬酵母(T. g/Wrato)CCTCCM202019為生產菌株，通過在培養基中添加KGDH抑制劑過氧化氫、 甲氨蝶呤、次氯酸鈉或羥基硫氨調節KGDH活性，有目的的減少KG的降解， 使碳流截止在KG這一節點上，實現oc-酮戊二酸過量積累；調控方法為發酵40h，在發酵培養基中添加過氧化氫達5mM時，a-酮戊二酸積累量達 到23.2g/L，比對照提高了 12.2%;或發酵初期Oh，在發酵培養基中添加甲氨蝶呤達0.08)LiM時，a-酮戊二酸 積累量達到22.7g/L，比對照提高了 10.1%;或發酵初期Oh，在發酵培養基中添加次氯酸鈉達0.4 mM時，oc-酮戊二酸 積累量達到22.2 g/L，比對照提高了 7.5%;或發酵初期Oh，在發酵培養基中添加羥基硫氨達0.48pM時，a-酮戊二酸 積累量達到22.0 g/L，比對照提高了 6.1%。1、 菌種光滑球擬酵母(7:g/a6rato) CCTCC NO. M 202019，為煙酸、生物素、硫 胺素、鹽酸吡哆醇4種維生素營養缺陷型菌株，且丙酮酸脫羧酶活性組成型降低， 為本研究室選育菌株，專利號ZL 02113142.2。2、 培養基和培養方法種子培養基種子和斜面培養基(g/L):葡萄糖30，蛋白腖10， KH2P041， MgSO(7H2O0.5;瓊脂20 (斜面培養基)，pH5.5。發酵培養基葡萄糖100 g/L; NH4C1 7 g/L; KH2P04 5 g/L; MgS04'7H20 0.8 g/L;煙酸8mg/L;鹽酸吡哆醇0.4mg/L;硫胺素0.02mg/L;生物素0.04mg/L; CaC03 60 g/L;根據實驗要求添加不同濃度的KGDH抑制劑。搖瓶培養將30'C、 200rpm下培養24h的種子以10%的接種量轉入發酵 培養基於3(TC、 200rpm條件下培養72h。3、 分析方法葡萄糖的測定3，5-二硝基水楊酸法。丙酮酸(PYR)和a-酮戊二酸(KG)的測定採用高效液相色譜(HPLC) 測定。參考Agillent有機酸測定方法。色譜條件為ZORBAXSB-Aq反相柱， 柱溫35 。C，檢測器UV210nm，流動相19.7 g/LNa2HP04 + 1.2°/。H3P04 + 1% 乙腈，pH2.0，流速1.0mL/min，進樣體積5 pL。細胞乾重(DCW)測定根據細胞乾重和對應OD值繪製標準曲線，得1 OD=0.29g/LDCW。本發明的有益效果本發明利用調控工業微生物中碳代謝和碳代謝流流向 分布，使碳代謝流截止在KG這一節點上，其中KG最大產量達到23.2g/L，比 對照提高了 12.2%。
具體實施方式
實施例1添加過氧化氫對對r g/"6rato CCTCC NO. M 202019發酵產酸的影響發酵初期添加過氧化氫，隨著過氧化氫添加量的增加，丙酮酸產量呈現上 升趨勢，當過氧化氫添加量為5 mM時，KG產量達到最大為21.8g/L，比對照 增加了5.6%，此時CKc/CpTO值為0.73。考察發酵不同階段添加5mM過氧化氫 對產酸的影響，KG產酸初期(40 h)添加過氧化氫，KG的積累量增加最大， 為23.2 g/L，比對照提高了 12.2%。由此得出過氧化氫的最佳添加量為5mM，添加時間為KG產酸初期(40h)。 實施例2添加甲氨蝶呤對CCTCC NO. M 202019發酵產酸的影響 發酵初期添加不同濃度甲氨喋呤(MTX)，隨著MTX添加量的增加，PYR 和KG產量均呈現先升後降的趨勢，當培養液中MTX濃度達到0.08 |iM時，PYR 和KG產量均達到最大值，分別為30.4 g/L和22.7 g/L，比對照分別增加了 8.9% 和10.1%,此時Cice/CpYK值為0.75。考察發酵不同階段添加MTX對產酸的影 響發現，隨著發酵的進行，MTX對發酵產KG的影響變小。由此得出MTX的最佳添加量為0.08 pM，添加時間為發酵初期(O h)。 實施例3添加次氯酸鈉對CCTCC NO. M 202019發酵產酸的影響 在培養基中添加次氯酸鈉發現，當添加濃度達到0.4 mM時，KG產量為22.2 g/L，比對照增加7.5%， Cp"Ckg值下降了 6%。考察發酵不同時期添加0.4 mM NaC103對產酸的影響發現，發酵初始(0h)為最佳添加時間。由此得出次氯酸鈉的最佳添加量為0.4 mM，添加時間為發酵初期(Oh)。 實施例4添加羥基硫氨對CCTCC NO. M 202019發酵產酸的影響 在培養基中添加羥基硫氨發現，當添加濃度達到0.48 |aM時，KG產量為22.0 g/L，比對照增加6.1%，而PYR產量下降了 13.7%， Cpy/Ckg值趨於定值，表明 隨著羥基硫胺濃度的增加，KG相對產量增加，進入TCA循環的碳代謝流流量 增加。由此得出羥基硫氨的最佳添加量為0.48 |aM，添加時間為發酵初期(0h)。
權利要求
1、一種添加α-酮戊二酸脫氫酶抑制劑實現α-酮戊二酸過量積累的方法，其特徵是利用多重維生素營養缺陷型的光滑球擬酵母(T.glabrata)CCTCCM202019為生產菌株，通過在培養基中添加α-酮戊二酸脫氫酶抑制劑過氧化氫、甲氨蝶呤、次氯酸鈉或羥基硫氨，調節α-酮戊二酸脫氫酶活性，有目的的減少α-酮戊二酸的降解，使碳流截止在α-酮戊二酸這一節點上，實現α-酮戊二酸過量積累；調控方法為發酵40h，在發酵培養基中添加過氧化氫達5mM時，α-酮戊二酸積累量達到23.2g/L；或發酵初期0h，在發酵培養基中添加甲氨蝶呤達0.08μM時，α-酮戊二酸積累量達到22.7g/L；或發酵初期0h，在發酵培養基中添加次氯酸鈉達0.4mM時，α-酮戊二酸積累量達到22.2g/L；或發酵初期0h，在發酵培養基中添加羥基硫氨達0.48μM時，α-酮戊二酸積累量達到22.0g/L。
全文摘要
一種添加α-酮戊二酸脫氫酶抑制劑實現α-酮戊二酸過量積累的方法，屬於蛋白質水平的代謝調控優化發酵過程技術領域。本發明利用多重維生素營養缺陷型的光滑球擬酵母CCTCC M202019為生產菌株，通過在培養基中添加α-酮戊二酸脫氫酶抑制劑過氧化氫、甲氨蝶呤、次氯酸鈉或羥基硫氨，調節α-酮戊二酸脫氫酶活性，有目的的降低α-酮戊二酸脫氫酶活性，減少代謝過程中α-酮戊二酸的降解，達到過量積累α-酮戊二酸的目的。本發明利用調控工業微生物中碳代謝和碳代謝流流向分布，使碳代謝流截止在α-酮戊二酸這一節點上，其中α-酮戊二酸最大產量達到23.2g/L，比對照提高了12.2％。本發明為TCA循環中間代謝產物的發酵研究提供了一個新的思路。
文檔編號C12R1/645GK101250563SQ200810020039
公開日2008年8月27日 申請日期2008年3月20日 優先權日2008年3月20日
發明者劉立明, 堵國成, 張旦旦, 堅 陳 申請人:江南大學