一種生產7-氨基頭孢烷酸的方法及其專用重組酶的製作方法
2023-04-24 08:46:56 3
專利名稱：一種生產7-氨基頭孢烷酸的方法及其專用重組酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術特別是生物工程領域中一種生產7-氨基頭孢烷酸的方法及其專用重組酶。
背景技術：
7-氨基頭孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)是目前半合成頭孢菌素的重要原料，主要由頭孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)通過化學法或酶法裂解脫去7-位的D-α-氨基己二醯側鏈得到的。
使用酶法替代傳統的化學法裂解頭孢菌素C生產7-ACA，具有工藝簡單、高效、安全、無汙染及產品質量穩定等優點，在經濟和保護環境上均有較大的競爭優勢。近年來，人們已對酶法生產半合成抗生素的研究和開發投入了大量人力和物力。用酶法裂解生產7-ACA，分為一步酶法和兩步酶法。其中一步酶法，利用頭孢菌素C醯化酶(Cephalosporin C acylase)直接催化頭孢菌素C，脫去7-位的D-α-氨基己二醯側鏈，生成7-ACA。雖然該法步驟簡單，但目前已發現的CPC醯化酶活力都十分低，遠不能滿足工業催化的需要。兩步酶法是利用來源不同的兩個酶進行兩步催化，首先，頭孢菌素C在D-胺基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，DAAO)的作用下，產生一個具有酮基的中間體，這個中間體較不穩定，很容易被同時生成的H2O2化學氧化脫羧，轉變成戊二醯基-7-氨基頭孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanicAcid，GL-7-ACA)；然後在GL-7-ACA醯化酶的作用下脫去其側鏈，生成7-ACA(如圖1所示)。
兩步酶法中用到的DAAO是一種典型的黃素蛋白(輔酶為黃素腺嘌呤二核苷酸)，廣泛存在於動物內臟及微生物中，如豬腎、三角酵母、紅酵母、腐皮鐮孢黴和麴黴等。DAAO的底物專一性較低，可以作用於幾乎所有的D-胺基酸和各種具有D-氨基的化合物(如頭孢菌素C)。
大部分產生GL-7-ACA醯化酶的菌株為假單胞菌(Pseudomonas sp.)。可把具有催化GL-7-ACA活性，生成7-ACA的酶分為5類，同一類酶的基因都有95％以上的同源性，且酶學性質幾乎完全相同。
目前，利用兩步酶法催化裂解頭孢菌素C製造7-ACA的技術在國外已經工業化，國內也已經引進國外技術進行7-ACA生產，但是從國外購買酶進行生產的成本高，經濟上缺乏與化學法的競爭力。隨著中國加入WTO，國外生產的頭孢菌素大量湧入中國，國內抗生素工業將面臨嚴峻的形勢。因此，加緊開發具有先進水平的酶法生產7-ACA的自主技術，滿足國內需求和增強國際市場競爭力已迫在眉睫。
隨著生物技術的發展，人們越來越重視用基因工程的方法來生產酶和改造酶。本發明的發明人所在實驗室從三角酵母中克隆得到了DAAO基因，並已將其成功構建了基因工程菌BL21(DE3)/pET-DAAO，實現了DAAO在大腸桿菌中的高效表達，DAAO酶活可達175U/mL，大大超過了文獻報導值。(D-胺基酸氧化酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達，微生物學報，已錄用；其物理圖譜如圖4所示)對於GL-7-ACA醯化酶，人們一般都是通過大量的篩選，得到具有GL-7-ACA醯化酶活性的野生菌株，然後再經過複雜的分子生物學操作，對GL-7-ACA醯化酶基因進行克隆和表達。但菌種篩選工作量大，耗時長，而且難度也大，往往需要幾年的時間才能取得一定的進展。本發明的發明人發明了一種快速獲取GL-7-ACA醯化酶基因的方法，即利用微生物學和分子生物學相結合的方法，經過微生物選擇性培養和特異性PCR擴增的方法從自然界中快速獲取目的基因，大大減少了篩選野生菌株及克隆目的基因的工作量，已申請中國專利(申請號03143198.4)。並已將所得基因用於構建基因工程菌BL21(DE3)/pET-ACY(GL-7-ACA醯化酶基因在大腸桿菌中的克隆與表達，微生物學通報，已錄用；其物理圖譜如圖4所示)，實現了GL-7-ACA醯化酶的快速表達。
在用D-胺基酸氧化酶和GL-7-ACA醯化酶催化生產7-ACA的研究中，人們通常都是先對兩個菌株分別培養和表達，然後分別進行酶的分離純化，接著再分別進行酶的固定化，最後，將固定化酶混合起來一步催化CPC或分兩步進行催化。幾十年來，人們的研究重點都集中在提高酶的活力和穩定性上，而對頭孢菌素C催化工藝改進的研究則相對較少，因此，在現有的催化工藝中，還有許多可以進行簡化和改進的地方。
在實際多步酶催化生產中，為了簡化工藝，人們常將兩個或多個酶進行共固定化，使多步反應可以同時進行。但仍需要對每個酶分別培養、分離純化，而且，每個酶的最佳固定化條件可能各不相同，需要對共固定化條件進行反覆優化。
近年來，結構生物學和基因工程技術的發展使得人們能夠對酶分子進行有效的改造，甚至可以有針對性地設計自然界中本來不存在的新酶，使其性能更加優良或賦予其新的功能，融合基因即是其中的一個重要研究方向。所謂融合基因，是指將兩個或多個基因的編碼區首尾相連，置於同一套調控序列(包括啟動子、增強子、核糖體結合序列、終止子等)控制之下構成的嵌合基因。現代DNA重組技術的發展使得不同基因或基因片段的融合可以方便地進行，融合基因經由合適的表達系統表達後，即可獲得由不同功能蛋白拼合在一起而形成的新型多功能蛋白，我們稱其為融合蛋白(Fusion protein)。
在利用基因融合所構建的融合蛋白分子中，如果各個酶分子的完整編碼序列保留在新的融合蛋白分子中，而且在表達過程中融合蛋白能夠正確摺疊，融合蛋白一般會保留所構成的酶分子各自的酶活性。與單個的酶相比，融合蛋白的酶比活可能會有所降低，但對於多酶順序催化的反應來說，由於「鄰近效應」(proximityeffect)，有可能提高多酶反應的總轉化效率。也即通過基因工程的手段對催化工藝進行改進，可以使之變得更為簡單、高效。因此，構建融合蛋白是繼幾種酶共固定化(co-immobilization)以及化學交聯等方法之後又一極具應用價值的新方法。
總之，無論是在基礎理論還是在工業應用方面，融合蛋白都有很高的研究價值，是生物技術領域大有發展前景的研究方向。
發明創造內容本發明的目的是提供一種具有戊二醯基-7-氨基頭孢烷酸醯化酶和D-胺基酸氧化酶活性的重組酶及其編碼基因。
本發明所提供的重組酶，是具有序列表中SEQ ID №6胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID №6的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №6的胺基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №6衍生的蛋白質。
序列表中的SEQ ID №6是由1060個胺基酸殘基組成的蛋白質。
一種上述重組酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №5的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №6蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №5限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中序列5的DNA序列由3183個鹼基組成，該基因的讀碼框為自5』端第1位到第3183位鹼基。
含有該重組酶編碼基因的表達載體和細胞系也屬於本發明的保護範圍，利用現有分子生物學的方法可以得到不同的表達載體和工程菌，如重組表達載體pET-ALD(圖譜如圖2所示)和工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-ALD。
本發明的第二個目的是提供一種生產7-氨基頭孢烷酸的方法。
本發明所提供的生產7-氨基頭孢烷酸的方法，是由上述重組酶催化頭孢菌素C生產7-氨基頭孢烷酸。
本發明的重組酶保留了GL-7-ACA醯化酶和DAAO的原本活力，並能用於頭孢菌素C直接催化生產7-ACA。本發明的方法與傳統的兩個基因分別表達和兩步催化的方法相比，可以使得基因工程菌的培養表達、酶的分離純化及頭孢菌素C的催化工藝都得到簡化，也即是通過基因工程的手段對下遊催化工藝進行改進，為7-ACA的催化提供了一條新思路，並加快了頭孢菌素C催化生產7-ACA的工業化的步伐，具有重要的理論意義和實際意義。
圖1為兩步酶法生產7-ACA的示意2為含有重組酶編碼基因的重組質粒pET-ALD的物理圖譜圖3為重組酶基因工程菌誘導表達後的全菌SDS-PAGE電泳4為含有重組酶編碼基因的重組質粒pET-ALD的構建過程示意5為重組酶催化頭孢菌素C 60min和120min的反應產物的HPLC色譜圖具體實施方式
實施例1、含有重組酶編碼基因(ACY-linker-DAAO，簡稱ALD)的重組質粒pET-ALD的構建重組質粒pET-ALD的構建過程如圖4所示，具體步驟如下1、D-胺基酸氧化酶基因的克隆(1)以帶有DAAO基因的重組質粒pET-DAAO(其相關性狀為Kanr，T7 lacpromotor，DAAO；其物理圖譜如圖4所示)為模板，以序列表中序列1和序列2為引物進行PCR擴增，序列表中序列1由25個核苷酸殘基組成，序列2由29個核苷酸殘基組成。在一已滅菌的0.2mL PCR薄壁管中，依次加入5μL無菌水、10μL擴增緩衝液、1μL四種脫氧核苷酸(2.5mM，TAKARA公司)、1μL引物1(終濃度50pmol)、1μL引物2(終濃度50pmol)、0.5μL質粒pET-DAAO溶液(濃度為50ng/μL)、0.2μLpfu DNA聚合酶(5U/μL，上海生工生物工程技術服務有限公司)，用無菌水補足至總體積為20μL，將離心管置於變溫系統中。在PCR反應中，PCR反應的溫度變化過程為先升溫至94℃，保持1分鐘，接著按以下溫度變化程序循環30次升溫至94℃，保持1分鐘，降溫至56℃，保持1.5分鐘，升溫至72℃，保持2.5分鐘，最後於72℃保持10分鐘，結束擴增反應。
(2)經PCR擴增，得到帶有BamH I和Hind III酶切位點的DAAO基因，並將得到的DAAO基因用BamH I和Hind III進行酶切，並與同樣BamH I和Hind III酶切的大腸桿菌表達質粒pET-28(購自Novagen公司，其相關性狀為Kanr，T7 lacpromotor；其物理圖譜如圖4所示)用T4 DNA連接酶進行連接，連接樣品轉化大腸桿菌TOP-10F』(購自Invitrogen公司，相關性狀有F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15ΔlacX74deoRrecAlaraD139(ara-leu)7697galU galK rpsL(StrR)endAl nupG)感受態細胞，在含有100μg/mL卡那黴素的LB固體培養基上培養16hr後，挑取若干單菌落於液體LB培養基中培養過夜，收集菌體並提取質粒，0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選得到帶有新的DAAO基因的重組質粒pET-DAAO fusion(其相關性狀為Kanr，T7 lac promotor，DAAOfusion)。
2、帶有連接肽序列的GL-7-ACA醯化酶基因的克隆(1)以帶有GL-7-ACA醯化酶基因的重組質粒pET-ACY(其相關性狀為Kanr，T7lac promotor，ACY；其物理圖譜如圖4所示)為模板，以序列表中序列3和序列4為引物進行PCR擴增，序列3由31個核苷酸殘基組成，序列4由58個核苷酸殘基組成。在一已滅菌的0.2mL PCR薄壁管中，依次加入5μL無菌水、10μL擴增緩衝液、1μL四種脫氧核苷酸(2.5mM)、1μL引物1(終濃度50pmol)、1μL引物2(終濃度50pmol)、0.5μL質粒pET-ACY溶液(濃度為50ng/μL)、0.2μLLA Taq DNA聚合酶(5U/μL，TAKARA公司)，用無菌水補足至總體積20μL，將離心管置於變溫系統中。在PCR反應中，PCR反應的溫度變化過程為先升溫至94℃，保持1分鐘，接著按以下的溫度變化程序循環30次升溫至94℃，保持1分鐘，降溫至58℃，保持1.5分鐘，升溫至72℃，保持2.5分鐘，最後於72℃保持10分鐘，結束擴增反應。
(2)經PCR擴增得到的帶有Nde I和BamHI酶切位點的GL-7-ACA醯化酶基因，同時在PCR下遊引物中引入了一段對應(Gly-Ser)6的連接肽編碼序列GGATCAGGCTCTGGGTCTGGCTCTGGATCAGGATCC。
這個連接肽的插入是為增加兩個酶分子之間的距離，減小它們的空間位阻，使融合蛋白最大限度地保持其原有生物學活性。而且擴增得到GL-7-ACA醯化酶基因被去除了終止密碼子TGA，融合基因在翻譯到GL-7-ACA醯化酶C端時不會終止，而會繼續翻譯連接肽和D-胺基酸氧化酶基因，從而表達成一個完整的融合蛋白。
將PCR得到的GL-7-ACA醯化酶基因用Nde I和BamH I進行酶切，並將得到的GL-7-ACA醯化酶基因用BamH I和Nde I進行酶切，並與同樣BamH I和Nde I酶切的DAAO重組質粒pET-DAAO fusion用T4 DNA連接酶進行連接，連接樣品轉化大腸桿菌TOP-10F』感受態細胞，在含有100μg/mL卡那黴素的LB固體培養基上培養16hr後，挑取若干單菌落於液體LB培養基中培養過夜，收集菌體並提取質粒，0.7％瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選得到帶有DAAO和GL-7-ACA醯化酶融合蛋白基因的重組質粒pET-ALD，其物理圖譜如圖2所示，它是雙鏈環狀DNA，長度為8.5kb，其相關性狀為Kanr，T7 lac promotor，ALD。經此法構建得到的重組酶(融合蛋白)的基因序列和對應的胺基酸序列如序列表中序列5和序列6所示。
實施例2、重組酶(融合蛋白)的表達將重組pET-ALD轉化宿主細胞E.coli BL21(DE3)(購自Promega公司，相關性狀有M15 Tn10(terr)HsdS gal(λcIts857 indl Sam7 nin5 lacUV5-T7 Genel))，得到重組酶(融合蛋白)的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-ALD。
將基因工程菌接種於LB液體培養基中(LB培養基組成為酵母粉0.5％、胰蛋白腖1％、NaCl 1％，pH7.0)，37℃搖床培養過夜，再以5％的接種量轉接到裝有50mL LB培養基的300mL搖瓶中，繼續37℃培養2hr，加入0.5mM IPTG，於28℃進行誘導，20hr後，離心收集菌體。分別測定基因工程菌中DAAO和GL-7-ACA醯化酶的活性，測得DAAO酶活為3.4U/mL，GL-7-ACA醯化酶酶活為54U/L。
將收集得到的菌體進行全菌SDS-PAGE電泳，如圖3所示，表明基因工程菌表達出了重組酶(融合蛋白)，圖中標準蛋白質分子量分別為94、67、43、31、21、14kD，泳道1為IPTG誘導前的菌體樣品，泳道2為IPTG誘導後的菌體樣品，泳道3為標準蛋白樣品。在18kD和94kD左右表達出了兩條明顯的蛋白條帶，其中18kD蛋白條帶對應GL-7-ACA醯化酶的α亞基，94kD左右的蛋白條帶對應GL-7-ACA醯化酶的β亞基、連接肽和D-胺基酸氧化酶的融合片段。說明重組酶(融合蛋白)中的GL-7-ACA醯化酶的α亞基和β亞基被正確加工，重組酶(融合蛋白)已成功表達。
實施例3、重組酶(融合蛋白)直接催化頭孢菌素C生產7-ACA將實施例2中誘導表達的基因工程菌液離心，收集菌體，用0.1mol磷酸鹽緩衝液(pH8.0)在50mL三角瓶中重懸，加入用同樣磷酸鹽緩衝液溶解的頭孢菌素C溶液(終濃度為5g/L)，28℃搖床反應60min和120min。採用Shimadzu C18柱的HPLC法檢測反應產物，流動相為7.5％乙腈-15％甲醇-1％乙酸，流速為1mL/min，色譜分離結果如圖5所示，表明樣品反應60min時，CPC尚未反應完，已有7-ACA生成，但同時存在相當多量的GL-7-ACA。這說明在重組酶(融合蛋白)中，DAAO和GL-7-ACA醯化酶的活性不均衡，DAAO的過量導致了中間產物GL-7-ACA的部分積累。樣品反應120min時，CPC已基本反應完全，GL-7-ACA也基本都轉化成了7-ACA，其生成率約為78％。
序列表1606210121125212DNA213人工序列220
223
4001cgggatccat ggctaaaatc gttgt25210221129212DNA213人工序列220
223
4002gctcaagctt ctaaaggttt ggacgagta29210321131212DNA213人工序列220
223
400
ggaattccat atggagccga cctcgacgcc g31210421158212DNA213人工序列220
223
4004atggatcctg atccagagcc agacccagag cctgatcctg gcttgaagtt gaagggcg 5821052113183212DNA213人工序列220
223
4005atggagccga cctcgacgcc gcaggcgccg attgcggcct ataaaccgag aagcaatgag60atcctgtggg acggctacgg cgtcccgcac atctacgggg tcgacgcgcc ctccgccttc120tacggctacg gctgggccca ggcgcgaagc cacggcgaca atatcctgcg cctgtatgga180gaagcgcggg gcaagggggc cgaatactgg ggcccggatt acgaacagac gaccgtctgg240ctgctgacca acggcgtgcc ggagcgcgcc cagcagtggt atgcgcagca gtcgctggat300ttccgcgcca acctcgacgc cttcgcggcg ggcatcaacg cctatgccga acagaaccca360gacgacatct cgcccgaggt gcggcaggtg ctgccggttt ccggcgccga cgtggtggcg420cacgcccatc gcctgatgaa cttcctctat gtcgcgtcgc ccggccgcac cctgggcgag480ggcgatccgc cggacctggc cgatcagggg tccaactcct gggccgtggc gccgggcaag540acggcgaacg ggaacgccct gctgctgcag aacccgcacc tgtcctggac gacggactac600
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100 105 110Asn Ala Tyr Ala Glu Gln Asn Pro Asp Asp Ile Ser Pro Glu Val Arg115 120 125Gln Val Leu Pro Val Ser Gly Ala Asp Val Val Ala His Ala His Arg130 135 140Leu Met Asn Phe Leu Tyr Val Ala Ser Pro Gly Arg Thr Leu Gly Glu145 150 155 160Gly Asp Pro Pro Asp Leu Ala Asp Gln Gly Ser Asn Ser Trp Ala Val165 170 175Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala Leu Leu Leu Gln Asn Pro180 185 190His Leu Ser Trp Thr Thr Asp Tyr Phe Thr Tyr Tyr Glu Ala His Leu195 200 205Val Thr Pro Asp Phe Glu Val Tyr Gly Ala Thr Gln Ile Gly Leu Pro210 215 220Val Ile Arg Phe Ala Phe Asn Gln Arg Met Gly Ile Thr Asn Thr Val225 230 235 240Asn Gly Met Val Gly Ala Thr Asn Tyr Arg Leu Thr Leu Gln Asp Gly245 250 255Gly Tyr Leu Tyr Asp Gly Gln Val Arg Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala260 265 270Ser Tyr Arg Leu Arg Gln Ala Asp Gly Ser Thr Val Asp Lys Pro Leu275 280 285Glu Ile Arg Ser Ser Val His Gly Pro Val Phe Glu Arg Ala Asp Gly290 295 300Thr Ala Val Ala Val Arg Val Ala Gly Leu Asp Arg Pro Gly Met Leu305 310 315 320Glu Gln Tyr Phe Asp Met Ile Thr Ala Asp Ser Phe Asp Asp Tyr Glu325 330 335Ala Ala Met Ala Arg Met Gln Val Pro Thr Phe Asn Ile Val Tyr Ala340 345 350Asp Arg Glu Gly Thr Ile Asn Tyr Ser Phe Asn Gly Val Ala Pro Lys
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610 615 620Glu Thr Trp Val Ala Met Ile Glu Phe Ser Thr Pro Val Arg Ala Tyr625 630 635 640Gly Leu Met Ser Tyr Gly AsnSer Arg Gln Pro Gly Thr Thr His Tyr645650 655Ser Asp Gln Ile Glu Arg Val Ser Arg Ala Asp Phe Arg Glu Leu Leu660 665 670Leu Arg Arg Glu Gln Val Glu Ala Ala Val Gln Glu Arg Thr Pro Phe675 680 685Asn Phe Lys Pro Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser690 695 700Met Ala Lys Ile Val Val Ile Gly Ala Gly Val Ala Gly Leu Thr Thr705 710 715 720Ala Leu Gln Leu Leu Arg Lys Gly His Glu Val Thr Ile Val Ser Glu725 730 735Phe Thr Pro Gly Asp Leu Ser Ile Gly Tyr Thr Ser Pro Trp Ala Gly740 745 750Ala Asn Trp Leu Thr Phe Tyr Asp Gly Gly Lys Leu Ala Asp Tyr Asp755 760765Ala Val Ser Tyr Pro Ile Leu Arg Glu Leu Ala Arg Ser Ser Pro Glu770 775 780Ala Gly Ile Arg Leu Ile Asn Gln Arg Ser His Val Leu Lys Arg Asp785 790 795 800Leu Pro Lys Leu Glu Gly Ala Met Ser Ala Ile Cys Gln Arg Asn Pro805 810 815Trp Phe Lys Asn Thr Val Asp Ser Phe Glu Ile Ile Glu Asp Arg Ser820 825 830Arg Ile Val His Asp Asp Val Ala Tyr Leu Val Glu Phe Ala Ser Val835 840 845Cys Ile His Thr Gly Val Tyr Leu Asn Trp Leu Met Ser Gln Cys Leu850 855 860Ser Leu Gly Ala Thr Val Val Lys Arg Arg Val Asn His Ile Lys Asp
865 870 875 880Ala Asn Leu Leu His Ser Ser Gly Ser Arg Pro Asp Val Ile Val Asn885 890 895Cys Ser Gly Leu Phe Ala Arg Phe Leu Gly Gly Val Glu Asp Lys Lys900 905 910Met Tyr Pro Ile Arg Gly Gln Val Val Leu Val Arg Asn Ser Leu Pro915 920 925Phe Met Ala Ser Phe Ser Ser Thr Pro Glu Lys Glu Asn Glu Asp Glu930 935 940Ala Leu Tyr Ile Met Thr Arg Phe Asp Gly Thr Ser Ile Ile Gly Gly945 950 955 960Cys Phe Gln Pro Asn Asn Trp Ser Ser Glu Pro Asp Pro Ser Leu Thr965 970 975His Arg Ile Leu Ser Arg Ala Leu Asp Arg Phe Pro Glu Leu Thr Lys980 985 990Asp Gly Pro Leu Asp Ile Val Arg Glu Cys Val Gly His Arg Pro Gly995 1000 1005Arg Glu Gly Gly Pro Arg Val Glu Leu Glu Lys Ile Pro Gly Val1010 1015 1020Gly Phe Val Val His Asn Tyr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Tyr Gln1025 1030 1035Ser Ser Tyr Gly Met Ala Asp Glu Ala Ile Ser Tyr Val Glu Arg1040 1045 1050Ala Leu Thr Arg Pro Asn Leu1055 1060
權利要求
1.一種重組酶，是具有序列表中SEQ ID №6胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID NQ6的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №6的胺基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №6衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的重組酶，其特徵在於所述重組酶是序列表中的SEQ ID№6。
3.一種重組酶的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №5的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №6蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №5限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
4.根據權利要求1所述的基因，其特徵在於所述重組酶的編碼基因是序列表中的SEQ ID №5。
5.含有權利要求3所述基因的表達載體。
6.根據權利要求5所述的表達載體，其特徵在於所述表達載體為pET-ALD。
7.含有權利要求3所述基因的細胞系。
8.根據權利要求7所述的細胞系，其特徵在於所述細胞係為E.coli BL21(DE3)/pET-ALD。
9.一種生產7-氨基頭孢烷酸的方法，是由重組酶催化頭孢菌素C生產7-氨基頭孢烷酸。
10.權利要求1所述重組酶在生產7-氨基頭孢烷酸中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種生產7－氨基頭孢烷酸的方法及其專用重組酶，目的是提供一種具有戊二醯基－7－氨基頭孢烷酸醯化酶和D－胺基酸氧化酶活性的重組酶及其編碼基因，利用該重組酶催化頭孢菌素C直接生產7－氨基頭孢烷酸的方法。本發明所提供的重組酶，是具有序列表中SEQ ID №6胺基酸殘基序列的蛋白質，或者是將SEQ ID №6的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №6的胺基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID№6衍生的蛋白質。本發明所提供的生產7－氨基頭孢烷酸的方法，是由重組酶催化頭孢菌素C生產7－氨基頭孢烷酸。本發明的重組酶可廣泛用於7－氨基頭孢烷酸的生產。本發明為酶法催化頭孢菌素C生產7－ACA提供了一條新路子，具有重要的理論意義和實際意義。
文檔編號C12N9/00GK1544620SQ20031011356
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月17日 優先權日2003年11月17日
發明者羅暉, 李強, 于慧敏, 沈忠耀, 羅 暉 申請人:清華大學