一種獲得紅掌單倍體植株的方法

2023-04-24 07:45:11

一種獲得紅掌單倍體植株的方法
【專利摘要】本發明公開了一種獲得紅掌單倍體植株的方法，屬於花卉苗木的遺傳育種【技術領域】。方法包括：（1）培養基的配製；（2）花序的選擇、低溫預處理與消毒；（3）誘導愈傷組織；（4）增殖培養；（5）分化培養；（6）生根培養；（7）移栽煉苗；（8）染色體鑑定；（9）單倍體擴繁等步驟。本發明紅掌花序經5-8℃低溫預處理24-72h後，能顯著提高其無菌花葯的獲得率和有效愈傷組織的誘導率，從而能有效獲得紅掌單倍體植株，且操作方法簡便、可以作為育種材料進一步從中選育出紅掌新品種，縮短育種年限。
【專利說明】一種獲得紅掌單倍體植株的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及花卉苗木的遺傳育種【技術領域】，具體涉及一種獲得紅掌單倍體植株的 方法。

【背景技術】
[0002] 紅掌(A aflt/raea/w?)又名安祖花、花燭等，天南星科花燭屬，原產哥倫比亞，是一 種多年生、常綠、四季開花、觀花觀葉兼可的草本植物，可分為切花和盆栽兩大類。由於紅掌 的花型奇特、顏色鮮豔多彩、生性耐蔭、觀賞期長等特點，在國內外的市場消費量很大，在全 球熱帶花卉貿易中僅次於蘭花名列第二。
[0003] 單倍體（Haploid)是指具有配子染色體（η)的個體，一般是利用花葯、花粉作外殖 體進行組織培養，從小孢子經愈傷組織或胚狀體產生植株，或以孤雌生殖、人工引變等方式 產生具有配子體染色全數的植株(單倍體植株)。在育種上利用單倍體具有克服雜種分離、 縮短育種年限和提高獲得純和材料的效率等優點。單倍體育種在糧食和果蔬作物上已研究 較多，並已育成了一些菸草、水稻、小麥等優良品種，但對單倍體觀賞植物的研究還處於起 步階段。目前紅掌育種的主要方法還是以傳統的雜交育種為主，存在育種周期長、進程慢、 後代不穩定等問題，在國內還未見有關於紅掌花葯培養單倍體成功的文獻報導。


【發明內容】

[0004] 本發明目的是，針對紅掌傳統雜交育種存在周期長、進程慢、後代不穩定等問題， 提出一種能克服雜種分離、縮短育種年限、獲得高純度紅掌單倍體育種材料的方法，並進一 步可從中選育出紅掌的新品種。
[0005] 本發明目的通過以下技術方案得以實現： 一種獲得紅掌單倍體植株的方法，該方法按以下步驟進行： (1) 培養基的配製：包括花葯培養各階段的培養基，其中， 1) 誘導培養基：1/2MS 基本培養基添加 0· 5-3mg/L 2, 4-D、0. 5-2mg/L 6-BA、30-70g/L 蔗糖、20g/L葡萄糖、6g/L瓊脂粉，pH滅菌前5. 8 ; 2) 增殖培養基：MS基本培養基添加1. Omg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH滅菌前5. 8 ; 3) 分化培養基：MS基本培養基添加1. Omg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH滅菌前5. 8 ; 4) 生根培養基：1/2MS基本培養基添加 lg/L活性炭、20g/L蔗糖，pH滅菌前5. 8 ; (2) 花序的選擇、低溫預處理與消毒：待紅掌佛焰苞花序抽出後，從中選擇苞片即將開 展的花序，剪下並除去其苞片，用酒精棉擦洗花序表面後放入培養瓶中，於5-8°C低溫條件 下處理24-72h ;再將該花序用自來水衝洗3-5min，加少量洗潔精，輕輕搓洗片刻後，用自來 水衝洗掉洗潔精和表面汙染物，再在超淨工作檯上用75%酒精浸泡30s後，用0. 1%升汞溶 液搖晃消毒l〇_15min，倒掉升汞溶液，用無菌水衝洗5次後，備用； (3) 誘導愈傷組織：將低溫預處理、消毒的花序用刀片橫切，用解剖針剝出花葯後，接種 到誘導培養基中誘導培養4個月，其中的無菌花葯將誘導產生愈傷組織，且對汙染花葯要 及時剔除； (4) 增殖培養：將誘導產生的愈傷組織轉接到增殖培養基中，經繼代培養至愈傷組織進 入增殖期； (5) 分化培養：將快速增殖期的愈傷組織轉接種到分化培養基上，誘導分化成芽； (6) 生根培養：當芽長至2cm時，從愈傷組織上切下並轉接到生根培養基上誘導生根， 長成幼苗； (7) 移栽煉苗：當幼苗長至4-5cm時，將該幼苗從培養瓶移栽到大棚穴盤中煉苗； (8) 染色體鑑定：當移栽苗新根長出後，取其白色幼嫩根尖0. 3-0. 5 cm，於室溫黑暗條 件下，用0.002 mol/L 8-羥基喹啉浸漬處理2-3 h;清水洗淨後於4°C條件下用95%乙醇： 冰醋酸=3 : 1新鮮配製的卡諾固定液固定18-24 h;棄去固定液後將根尖置於37°C水浴 中，用0. 2mol/L HC1酸解15-20 min後，用蒸餾水衝洗3次；切取該根尖的分生組織放在預 先滴一滴石炭酸品紅染料的載玻片上，用鑷子壓碎根尖，棄去殘渣，蓋上蓋玻片後，吸乾多 餘的染料，在40X 10倍顯微鏡下拍照、觀察、鑑定； (9) 單倍體擴繁：將確定為單倍體的植株進行組培擴繁。
[0006] 本發明具有以下幾方面的有益效果： 1、本發明的紅掌花序經5-8°C低溫預處理24-72小時後，能有效提高無菌花葯的獲得 率和有效愈傷組織的誘導率。如品種'阿拉巴馬（Alabamb)'的花序經過5-8°C低溫預處理 24-72h後，無菌花葯的獲得率平均為49. 73%，而對照為26. 7%，提高了 86. 25% ;有效愈傷誘 導率平均為24. 24%，而對照為13. 47%，提高了 79. 92% ;單倍體誘導率平均為33. 75%，而對照 為20%，提高了 68. 75% ;對品種'燕尾紅（Loattails Red)'來說，效果更加明顯，無菌花葯的 獲得率從對照的7. 14%提高到平均25. 43%，有效愈傷誘導率從對照0提高到平均11. 85%， 單倍體誘導率從對照〇提高到平均30%。（見試驗例）. (2) 本發明中的紅掌花序5-8°C低溫預處理24-72h比現有的報導10°C低溫預處理3d (杜寶貴，黃麗娟，張志勝等.紅掌花葯培養.生物技術通訊，2009年增刊：189-195.)能有 效提高花葯膨大率和有效愈傷組織的誘導率。l〇°C低溫預處理3d後的花葯膨大率最高為 17. 33%，花葯有效愈傷誘導率最高為1. 67%，而本發明中的花葯膨大率最高為87% ;花葯有 效愈傷誘導率最高為29%。（見實施例6、7和2) (3) 本發明能有效得到紅掌單倍體，而之前的有關報導表明得到的花葯再生植株均是 二倍體，並沒有得到紅掌單倍體。

【具體實施方式】
[0007] 以下通過實施例對本發明作進一步的具體說明，但本發明的內容並不局限於此。
[0008] 實施例1 :(獲得紅掌品種'阿拉巴馬（Alabamb)'單倍體植株的方法1) 該方法按以下步驟進行： (1)培養基的配製：包括花葯培養各階段的培養基，其中， 1) 誘導培養基：1/2MS基本培養基添加0.5mg/L 2,4-D、0.5mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、 20g/L葡萄糖、6g/L瓊脂粉，pH滅菌前5. 8 ; 2) 增殖培養基：MS基本培養基添加1. Omg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH滅菌前5. 8 ; 3) 分化培養基：MS基本培養基添加1. Omg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH滅菌前5. 8 ; 4)生根培養基：1/2MS基本培養基添加 lg/L活性炭、20g/L蔗糖，pH滅菌前5. 8 ; (2) 花序的選擇、低溫預處理與消毒：以紅掌品種'阿拉巴馬（Alabamb)'為試材，待佛 焰苞花序抽出後，從中選擇苞片即將開展的花序，剪下並除去其苞片，用酒精棉擦洗花序表 面後放入培養瓶中，於5°C低溫條件下處理24h ;將該花序用自來水衝洗3-5min後，加少量 洗潔精，輕輕搓洗片刻後，用自來水衝洗掉洗潔精和表面汙染物，再在超淨工作檯上用75% 酒精浸泡30s後，用0. 1%升汞溶液搖晃消毒10-15min ;倒掉升汞溶液，用無菌水衝洗5次 後，備用； (3) 誘導愈傷組織：將低溫預處理與消毒後的花序用刀片橫切，用解剖針剝出花葯後， 按每瓶接種30-50粒花葯接種到誘導培養基中，在25-27°C自然散射光下培養，共接種10 瓶；其中的無菌花葯將誘導產生愈傷組織，汙染花葯則需及時剔除，共誘導培養4個月，該 例7d後得到的無菌花葯率為42. 00%，15d花葯膨大率為76. 14%，40d後有效愈傷誘導率為 20. 00% ； (4) 增殖培養：將誘導產生的愈傷組織轉接到增殖培養基中，經繼代培養至愈傷組織進 入增殖期； (5) 分化培養：將快速增殖期的愈傷組織接種到分化培養基上，誘導分化成芽； (6) 生根培養：當幼苗芽長至2cm時，將其從愈傷組織上切下並轉接至生根培養基上， 4d後開始長根，20d後根長至l-2cm，50d後全部生根； (7) 移栽煉苗：當幼苗長至4-5cm時，將該幼苗從培養瓶移栽到大棚穴盤中煉苗； (8) 染色體鑑定：當移栽苗新根長出後，取其白色幼嫩根尖0.3cm，於室溫黑暗條件下， 用0. 002 mol/L 8-羥基喹啉處理3 h ;用清水洗淨，於4°C條件下用95%乙醇：冰醋酸=3 :1新鮮配製的卡諾固定液固定18 h;棄去固定液後將根尖置於37°C水浴中，用0. 2mol/ L HC1酸解15 min後並用蒸餾水衝洗3次；切取該根尖的分生組織放在預先滴一滴石炭酸 品紅染料的載玻片上，用鑷子壓碎根尖，棄去殘渣，蓋上蓋玻片，吸乾多餘的染料，在40 X 10 倍顯微鏡下拍照、觀察、鑑定染色體，其中有35%左右的苗為單倍體； (9) 單倍體擴繁：將確定為單倍體的植株進行組培擴繁後，分化形成的新苗均為單倍 體。
[0009] 實施例2 :(獲得紅掌品種'阿拉巴馬（Alabamb)'單倍體植株的方法2): 本例中，步驟（1)誘導培養基配方添加的2,4-D為1.5mg/L，6-BA為lmg/L，蔗糖為 45g/L ;步驟（2)花序於6°C低溫條件下處理36h ;步驟（8)取其白色幼嫩根尖0. 4cm，用 0.002 mol/L 8-羥基喹啉處理2.5 h，用卡諾固定液固定20 h，用0.2mol/L HC1酸解17 min ;其餘步驟工藝同於實施例1，結果：步驟（3)得到的無菌花葯率為59. 42%，花葯膨大率 為75. 50%，有效愈傷誘導率為29. 00%，步驟（8)中單倍體苗比例為40%左右。
[0010] 實施例3 :(獲得紅掌品種'阿拉巴馬（Alabamb)'單倍體植株的方法3): 本例中，步驟（1)誘導培養基配方添加的2, 4-D為2. 5mg/L，6-BA為1. 5mg/L，蔗糖 為55g/L ;步驟（2)花序於7°C低溫條件下處理48h ;步驟（8)取其白色幼嫩根尖0. 5cm，用 0.002 mol/L 8-羥基喹啉處理2.5 h，用卡諾固定液固定22 h，用0.2mol/L HC1酸解19 min ;其餘步驟工藝同於實施例1，結果：步驟（3)得到的無菌花葯率為43. 33%，花葯膨大率 為60. 82%，有效愈傷誘導率為19. 21%，步驟（8)中單倍體苗的比例為30%左右。
[0011] 實施例4 :(獲得紅掌品種'阿拉巴馬（Alabamb)'單倍體植株的方法4): 本例中，步驟（1)誘導培養基配方添加的2, 4-D為3mg/L，6-BA為2mg/L，蔗糖為70g/ L ;步驟（2)花序於8°C低溫條件下處理72h ;步驟（8)取其白色幼嫩根尖0. 4cm，用0. 002 mol/L 8-羥基喹啉處理2 h，用卡諾固定液固定24 h，用0.2mol/L HC1酸解20 min;其餘 步驟工藝同於實施例1，結果：步驟（3)得到的無菌花葯率為23. 5%，花葯膨大率為83. 78%， 有效愈傷誘導率為23%，步驟（8)中單倍體苗的比例為30%左右。
[0012] 實施例5 :(獲得紅掌品種'燕尾紅（Loattails Red)'單倍體植株的方法5): 本例中，步驟（1)誘導培養基配方添加的2, 4-D為0· 5mg/L，6-BA為0· 5mg/L，蔗糖為 30g/L ;步驟（2)以紅掌品種'燕尾紅（Loattails Red)'為試材，其花序於5°C低溫條件下處 理24h;步驟（8)取其白色幼嫩根尖0.3cm，用0.002 mol/L 8-羥基喹啉處理3 h，用卡諾固 定液固定18 h，用0. 2mol/L HC1酸解15 min ;其餘步驟工藝同於實施例1，結果：步驟（3) 得到的無菌花葯率為24. 5%，花葯膨大率為70. 61%，有效愈傷誘導率為5%，步驟（8)中單倍 體苗的比例為30%左右。
[0013] 實施例6 :(獲得紅掌品種'燕尾紅（Loattails Red)'單倍體植株的方法6): 本例中，步驟（1)誘導培養基配方添加的2,4-D為1.5mg/L，6-BA為lmg/L，蔗糖為 45g/L;步驟（2)以紅掌品種'燕尾紅（Loattails Red)'為試材，其花序於6°C低溫條件下 處理36h;步驟（8)取其白色幼嫩根尖(λ 4cm，用(λ 002 mol/L 8-羥基喹啉處理2.5 h，用 卡諾固定液固定20 h，用0. 2mol/L HC1酸解17 min;其餘步驟工藝同於實施例1，結果：步 驟（3)得到的無菌花葯率為33. 3%，花葯膨大率為87. 71%，有效愈傷誘導率為13. 49%，步驟 (8)中單倍體苗的比例為35%左右。
[0014] 實施例7 :(獲得紅掌品種'燕尾紅（Loattails Red)'單倍體植株的方法7): 本例中，步驟（1)誘導培養基配方添加的2, 4-D為2. 5mg/L，6-BA為1. 5mg/L，蔗糖為 55g/L;步驟（2)以紅掌品種'燕尾紅（Loattails Red)'為試材，其花序於7°C低溫條件下 處理48h;步驟（8)取其白色幼嫩根尖0.4cm，用0.002 mol/L 8-羥基喹啉處理2.5 h，用卡 諾固定液固定22 h，用0. 2mol/L HC1酸解19 min ;其餘步驟工藝同於實施例1，結果：步驟 (3)得到的無菌花葯率為20. 5%，花葯膨大率為87. 8%，有效愈傷誘導率為12%，步驟（8)中 單倍體苗的比例為30%左右。
[0015] 實施例8 :(獲得紅掌品種'燕尾紅（Loattails Red)'單倍體植株的方法8): 本例中，步驟（1)誘導培養基配方添加的2, 4-D為3mg/L，6-BA為2mg/L，蔗糖為70g/ L;步驟（2)以紅掌品種'燕尾紅（Loattails Red)'為試材，其花序於8°C低溫條件下處理 72h;步驟（8)取其白色幼嫩根尖0· 5cm，用0.002 mol/L 8-羥基喹啉處理2 h，用卡諾固定 液固定24 h，用0. 2mol/L HC1酸解20 min ;其餘步驟工藝同於實施例1，結果：步驟（3)得 到的無菌花葯率為18. 37%，花葯膨大率為86. 19%，有效愈傷誘導率為12. 73%，步驟（8)中單 倍體苗的比例為35%左右。
[0016] 試驗例(不同品種不同花序預處理對花葯誘導培養的影響試驗）： 本試驗於2011年在杭州進行，紅掌參試品種2個為'阿拉巴馬（Alabamb)'和'燕尾紅 (Loattails Red)'，花序低溫預處理設為 5°C /24h、6°C /36h、7°C /48h、8°C /72h 及不預處 理直接消毒接種(對照)共5個，其餘步驟工藝均相同。每個處理接種15瓶，每瓶約接30-50 個花葯，一個花序約可接5瓶，接種後在25°C左右自然散射光下培養。在培養過程中：每隔 3-5天觀察並記錄汙染花葯數一次；40天後統計膨大的花葯個數；4個月後統計成活愈傷組 織塊數；8個月後瓶苗移栽；12個月後進行染色體鑑定。並按照下述公式計算無菌花葯率、 花葯膨大率和有效愈傷誘導率： 無菌花葯率=無汙染瓶數/接種總瓶數X 100%， 花葯膨大率=發生膨大的花葯數/無菌花葯總數X 100%， 有效愈傷誘導率=愈傷成活數/無菌花葯總數X 100%。
[0017] 試驗結果表明：5-8°C低溫預處理24-72h均能有效提高無菌花葯的獲得率、有 效愈傷組織的誘導率以及單倍體誘導率(見表1)。品種'阿拉巴馬（Alabamb)'的花序經 過5-8°C低溫預處理24-72h後，無菌花葯的獲得率平均為49. 73%，而對照為26. 7%，提高了 86. 25% ;有效愈傷誘導率平均為24. 24%，而對照為13. 47%，提高了 79. 92% ;單倍體誘導率平 均為33. 75%，而對照為20%，提高了 68. 75% ;對品種'燕尾紅（Loattails Red)'來說，效果 更加明顯，無菌花葯的獲得率從對照7. 14%提高到平均25. 43%，有效愈傷誘導率從對照0提 高到平均11. 85%，單倍體誘導率從對照0提高到平均30%。
[0018] 表1不同品種不同預處理的花葯誘導培養結果

【權利要求】
1. 一種獲得紅掌單倍體植株的方法，其特徵在於按以下步驟進行： (1) 培養基的配製：包括花葯培養各階段的培養基，其中， 1) 誘導培養基：1/2MS 基本培養基添加 0· 5-3mg/L 2, 4-D、0. 5-2mg/L 6-BA、30-70g/L 蔗糖、20g/L葡萄糖、6g/L瓊脂粉，pH滅菌前5. 8 ; 2) 增殖培養基：MS基本培養基添加1. Omg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH滅菌前5. 8 ; 3) 分化培養基：MS基本培養基添加1. Omg/L 6-BA、30g/L蔗糖，pH滅菌前5. 8 ; 4) 生根培養基：1/2MS基本培養基添加 lg/L活性炭、20g/L蔗糖，pH滅菌前5. 8 ; (2) 花序的選擇、低溫預處理與消毒：待紅掌佛焰苞花序抽出後，從中選擇苞片即將開 展的花序，剪下並除去其苞片，用酒精棉擦洗花序表面後放入培養瓶中，於5-8°C低溫條件 下處理24-72h ;再將該花序用自來水衝洗3-5min，加少量洗潔精，輕輕搓洗片刻後，用自來 水衝洗掉洗潔精和表面汙染物，再在超淨工作檯上用75%酒精浸泡30s後，用0. 1%升汞溶 液搖晃消毒l〇_15min，倒掉升汞溶液，用無菌水衝洗5次後，備用； (3) 誘導愈傷組織：將低溫預處理、消毒的花序用刀片橫切，用解剖針剝出花葯後，接種 到誘導培養基中誘導培養4個月，其中的無菌花葯將誘導產生愈傷組織，且對汙染花葯要 及時剔除； (4) 增殖培養：將誘導產生的愈傷組織轉接到增殖培養基中，經繼代培養至愈傷組織進 入增殖期； (5) 分化培養：將快速增殖期的愈傷組織轉接種到分化培養基上，誘導分化成芽； (6) 生根培養：當芽長至2cm時，從愈傷組織上切下並轉接到生根培養基上誘導生根， 長成幼苗； (7) 移栽煉苗：當幼苗長至4-5cm時，將該幼苗從培養瓶移栽到大棚穴盤中煉苗； (8) 染色體鑑定：當移栽苗新根長出後，取其白色幼嫩根尖0. 3-0. 5 cm，於室溫黑暗條 件下，用0.002 mol/L 8-羥基喹啉浸漬處理2-3 h;清水洗淨後於4°C條件下用95%乙醇： 冰醋酸=3 : 1新鮮配製的卡諾固定液固定18-24 h;棄去固定液後將根尖置於37°C水浴 中，用0. 2mol/L HC1酸解15-20 min後，用蒸餾水衝洗3次；切取該根尖的分生組織放在預 先滴一滴石炭酸品紅染料的載玻片上，用鑷子壓碎根尖，棄去殘渣，蓋上蓋玻片後，吸乾多 餘的染料，在40X 10倍顯微鏡下拍照、觀察、鑑定； (9) 單倍體擴繁：將確定為單倍體的植株進行組培擴繁。
【文檔編號】A01H4/00GK104137777SQ201410363151
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月29日 優先權日:2014年7月29日
【發明者】田丹青, 潘曉韻, 葛亞英, 潘剛敏, 沈曉嵐, 劉建新, 金亮 申請人:浙江省蕭山棉麻研究所