一種人白細胞介素-17受體樣蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-04-24 02:29:06 3

專利名稱：一種人白細胞介素-17受體樣蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種人白細胞介素-17受體樣蛋白及其編碼基因與應用。
儘管目前已克隆了至少7種IL-17家族配體成員，但有關該家族成員的受體研究卻知之甚少。IL-17R是第一個被鑑定的IL-17受體家族成員，廣泛表達於多種不同的組織。但是，IL-17與IL-17R的親和力較弱，與IL-17具有的廣泛的生物學功能並不匹配，並且IL-17R並不含有與先前已知蛋白相似的結構。IL-17Rh1/IL-17BR與IL-17R一樣，並不含有與先前已知蛋白相似的結構域，但它們的胞外結構域具有保守的胱氨酸殘基，胞內結構域含有與IL-17R相似的胺基酸殘基序列，暗示它們可能具有相似的下遊信號事件。研究結果表明NF-κB是它們共同介導的下遊信號分子。
曾報導，IL-17A和IL-17E能誘導核轉錄因子NF-κB的活化，另外也有研究結果表明IL-17A所誘導的下遊信號事件包括活化胞外調控激酶(ERK-1/ERK-2)，氮末端激酶(JNK，c-Jun)，p38有絲分裂原激酶，Raf、Stats等下遊信號分子。IL-17AR的敲基因小鼠研究表明，在腫瘤壞死因子-α結合因子-6(TRAF-6)缺陷的細胞系，IL-17誘導的下遊信號事件明顯阻斷，提示TRAF-6對於IL-17刺激的信號是必要的。由於已知的幾種IL-17受體成員的胞內結構域並不含有與Toll/IL-1R相似的結構，因此尋找和鑑定未知的IL-17家族成員的潛在受體顯得尤其必要。
一種人白細胞介素-17受體樣蛋白，它具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列或將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
本發明的人白細胞介素-17受體樣蛋白命名為hIL-17RLM-S，是一種單跨膜細胞因子受體，由595個胺基酸殘基組成。胞外區分別含有4個胱氨酸殘基和4個潛在的N-糖基化部位。跨膜區由23個胺基酸組成。在臨近跨膜區的3』端含有一個Toll/IL-1R樣結構域。5』端並不含有潛在的信號肽或前導序列。
本發明採用多組織Northern Blot方法，檢測了hIL-17RLM-S的mRNA組織表達分布，結果表明hIL-17RLM-S mRNA主要在腎及睪丸表達，在腦、心、脾、子宮有微弱的mRNA表達。但並未檢測到hIL-17RLM-S在胸腺、胰腺、前列腺、外周血、小腸、結腸、骨骼肌、肝、肺、胎盤等組織的表達。表明hIL-17RLM-S的mRNA表達具有組織特異性。檢測了hIL-17RLM-S在眾多細胞系的表達分布，結果表明IL-17RLM在所選擇的大多數細胞系如293，293T，HepG2，Ho8910，SGC7901，CNE，Hela，L02，A431，CHO，Cos7，GBE，Jurcat，K562，6T-CEM等皆有表達，但在某些白血病細胞系如HL60，U937，THP1和成纖維細胞3T3並未檢測到其表達。
本發明的第二個目的是提供編碼人白細胞介素-17受體樣蛋白的基因。
一種人白細胞介素-17受體樣蛋白的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
本發明人白細胞介素-17受體樣蛋白hIL-17RLM-S的編碼基因由4508個鹼基組成，位於人3號染色體(3p21.1)距NT_005787.8 420,648到506,133的位置，其基因組位置與IL-17BR和Toll receptor9基因非常臨近，hIL-17RLM-S的起始編碼胺基酸位於第五個外顯子，共有14個外顯子組成。
研究表明，本發明的人白細胞介素-17受體樣蛋白可以使Stat5因子活化、介導細胞增殖，並可望在促進或抑制精子形成的藥物或其它方面得到應用。
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
將hIL-17RLM-S瞬時轉染於Cos7細胞，檢測其在胞內的表達和糖基化情況。hIL-17RLM-S在Cos7細胞的表達顯示其分子量約為70kD。與預測的hIL-17RLM-S胞外區含有多個氮糖基化位點相匹配。
為了檢測hIL-17RLM-S在細胞的內源性表達，採用免疫沉澱方法，使用抗hIL-17RLM-S兔多克隆抗血清，檢測hIL-17RLM-S是否在人腎癌細胞系GRC-1有內源性蛋白表達。結果表明hIL-17RLM-S在人腎癌細胞系GRC-1存在內源性蛋白表達，其分子質量約100kD，很可能為hIL-17RLM-S的一種選擇性剪切形式。但是，在GRC-1細胞系，並未同時檢測到hIL-17RLM-S幾種選擇性剪切形式的蛋白表達。說明hIL-17RLM-S幾種選擇性剪切形式的內源性蛋白表達存在組織、細胞特異性。
對hIL-17RLM-S在細胞器的表達定位進行研究。將hIL-17RLM-S構建於EGFP-N1真核表達載體，將其瞬時轉染於Cos7細胞，結果顯示其主要表達在細胞膜上。為了進一步檢測hIL-17RLM-S在細胞的內源性表達定位，進行了免疫螢光染色實驗。藉助hIL-17RLM-S兔多克隆抗血清，選擇兩種腎癌細胞系786-O和GRC-1，進行免疫染色研究，以檢測hIL-17RLM-S在細胞的內源性表達定位。結果清楚表明hIL-17RLM-S主要定位在細胞膜。
實施例2、hIL-17RLM-S胞內結構域的功能——活化Stat5和介導細胞增殖本發明的發明人構建了一系列嵌合受體，通過對hIL-17RLM-S胞內區人工二聚化，證實了其傳遞信號的能力。
發明人將EPOR的胞外區和跨膜區與hIL-17RLM-S的胞內區構建一嵌合受體，藉助EPO的刺激，進而檢測hIL-17RLM-S的胞內區傳遞信號的潛力。首先進行了螢光素酶報導分析，瞬時共轉染指示的受體表達質粒，Stat5應答的螢光素酶報導質粒4FTKSLN，pRL-TK載體(內對照)，轉染36小時後，使用重組人EPO刺激或不刺激(PBS)約30分鐘後，收穫細胞，進行螢光素酶報導分析。結果顯示EPOR/hIL-17RLM-S嵌合受體與全長EPOR一樣，在EPO的刺激作用下，能夠介導Stat5的活化；並且當共轉染Stat5的負顯性突變體(dominant mutant)-Stat5 CYF時，EPOR/hIL-17RLM-S嵌合受體介導Stat5的活化被明顯抑止；全長hIL-17RLM-S的過表達並不能介導Stat5的活化。這個結果暗示，hIL-17RLM-S的胞內區具有能夠介導Stat5活化的潛力。
Stat5活化的一個重要標誌是其在Jak激酶的作用下，Stat5的酪氨酸被磷酸化，然後轉位入核，介導下遊靶基因的表達。為了進一步檢測hIL-17RLM-S的胞內區介導Stat5活化的潛力，採用免疫沉澱方法，檢測EPOR/hIL-17RLM-S是否能夠介導Stat5酪氨酸磷酸化。向Cos7細胞共轉染嵌合受體-EPORextm/hIL-17RLM-Sicd或全長EPOR或空載體(Mock)，Jak2，stat5高純度表達質粒。在EPO刺激前30分鐘，培養基中補加NaV3O4以抑制內源性磷酸化酶的水解。使用重組人EPO刺激或不刺激(PBS)約30分鐘後，收穫細胞，製備總細胞裂解液，一部分用於免疫沉澱，另一部分直接用於Western blot以檢測轉染質粒的表達情況。結果表明EPORextm/hIL-17RLM-Sicd嵌合受體同EPOR一樣，在EPO的刺激下，能夠介導Stat5酪氨酸磷酸化；而在EPO未刺激組和空載體組，並未檢測到Stat5酪氨酸磷酸化。這一結果進一步表明hIL-17RLM-S的胞內區能夠介導Stat5酪氨酸磷酸化。
為了進一步證實hIL-17RLM-S胞內區具有介導Stat5活化的潛力，採用gel shiftassay以分析是否EPOR/hIL-17RLM-S嵌合受體能夠介導細胞核抽提物Stat5-DNA結合複合體的形成，以證實其介導Stat5活化。具體做法是共轉染指示的表達質粒於Cos7細胞，在EPO的作用後，製備細胞核抽提物，進行凝膠電泳阻滯分析實驗。實驗結果顯示EPORextm/hIL-17RLM-Sicd嵌合受體同EPOR一樣，在EPO的刺激下，能夠介導Stat5-DNA結合複合體的形成；而在EPO未刺激組和空載體組，並未檢測到Stat5-DNA結合複合體的形成。採用冰冷的未標記的特異性結合Stat5的DNA探針，能夠競爭性抑止Stat5-DNA結合複合體的形成。這一結果表明hIL-17RLM-S胞內區具有介導特異性Stat5-DNA結合複合體形成的特性。
為了進一步確定Stat5-DNA結合複合體的特異性和Stat5具體成分，分別藉助抗Stat5ab，Stat5b，Stat1和Stat3特異性抗體，進行了Supershift分析實驗。結果顯示抗Stat5ab或Stat5b能夠顯著超遷移這個DNA結合複合體，而Stat1或Stat3特異性抗體卻並不能超遷移這個DNA結合複合體，暗示EPOR/hIL-17RLM-S嵌合受體所介導的Stat5-DNA結合複合體主要為Stat5b-DNA複合體。這一結果進一步表明了hIL-17RLM-S胞內區具有活化Stat5信號的潛力。
上述實驗結果顯示hIL-17RLM-S具有活化Stat5的信號潛力。為了進一步鑑定是否細胞內穩定表達的EPORextm/hIL-17RLM-Sicd嵌合受體在重組人紅細胞生成素(rhEPO)的刺激下也具有介導Stat5活化的信號能力，發明人建立了穩定表達細胞系，命名為穩定表達EPOR和EPORextm/hIL-17RLM-Sicd的陽性細胞系Ba/F3，採用Northern blot和western blot方法鑑定具有穩定表達EPOR和EPORextm/hIL-17RLM-Sicd嵌合受體的陽性細胞克隆。
對穩定表達EPOR和EPORextm/hIL-17RLM-Sicd的陽性Ba/F3細胞系進行gelshift assay實驗。結果表明EPOR/hIL-17RLM-S與EPOR穩定表達細胞系一樣，EPO能夠以時間依賴方式誘導其細胞核抽提物Stat5-DNA結合複合體的形成；然而在野生型Ba/F3細胞系，卻並未誘導其細胞核抽提物Stat5-DNA結合複合體的形成。進一步表明hIL-17RLM-S的胞內區具有活化Stat5的信號能力。
Supershift分析結果顯示採用抗Stat5ab或Stat5b，能夠超遷移Stat5-DNA結合複合體，然而採用抗Stat5a或Stat1特異性抗體卻並未超遷移Stat5-DNA結合複合體。這表明EPOR/hIL-17RLM-S嵌合受體主要介導Stat5b的活化，而不是Stat5a的活化。另外。使用冰冷的未標記Stat5 DNA特異性結合探針，能夠特異地競爭性抑止Stat5-DNA結合複合體地形成，而使用無關的探針卻不能競爭性抑止Stat5-DNA結合複合體的形成。這些結果充分證明了EPOR/hIL-17RLM-S嵌合受體主要介導Stat5b的活化，而不是Stat5a的活化。這一結果也與通過瞬時過量表達EPOR/hIL-17RLM-S在Cos7細胞所介導Stat5活化的結果相吻合。據此可以得出，在Cos7細胞瞬時過量表達和在Ba/F3細胞穩定表達EPORextm/hIL-17RLM-Sicd嵌合受體都能夠介導Stat5活化，表明hIL-17RLM-S胞內區具有活化轉錄因子Stat5的信號潛力。
通常，I型細胞因子受體應答其偶連配體具有傳遞細胞增殖的信號能力。藉助[3H]-Thymidine整合，進行了細胞增殖分析實驗。結果表明EPORextm/hIL-17RLM-Sicd嵌和受體穩定表達的Ba/F3細胞系和EPOR穩定表達的Ba/F3細胞系一樣，能夠應答EPO的刺激，出現細胞增殖現象，並且這種增殖效應為EPO濃度依賴的方式和刺激時間依賴的方式。這暗示hIL-17RLM-S的胞內結構域具有傳遞細胞增殖的信號潛力。
實施例3、hIL-17RLM-S與FGFRs的相互作用、共定位及對細胞分化的影響免疫沉澱和Western blot結果顯示hIL-17RLM-S能夠與爪蟾(Xenopus)mFGFR1或mFGFR2在瞬時共轉染的Cos7細胞相互作用。但並未檢測到hIL-17RLM-S與mFGFR3或mFGFR4的相互作用。
為了進一步確定hIL-17RLM-S與mFGFR1或mFGFR2的相互作用，進行了免疫染色實驗，並進行Merge分析。Merge實驗結果顯示，hIL-17RLM-S與mFGFR2共定位於細胞膜和胞漿部位。
為了探討是否hIL-17RLM-S與FGFR1或FGFR2在人體內源性組織中共定位表達。首先藉助常規免疫組化的方法，檢測hIL-17RLM-S、FGFR1和FGFR2在人體組織中的原位表達分布。結果表明hIL-17RLM-S、FGFR1和FGFR2在人體腎和睪丸組織中具有非常相似的表達分布，表達在組織的相同細胞類型，並且主要表達在組織細胞膜及細胞漿部位。另外FGFR1在腎及睪丸組織中的表達明顯強於FGFR2的表達。
為了進一步確定是否hIL-17RLM-S與FGFR1在人體某些組織共定位表達，使用人多組織陣列(tissue array)，採用雙重或三重免疫組化染色試劑盒，大量篩檢了hIL-17RLM-S與FGFR1在人體多種組織中的表達分布，並進行merge分析。結果顯示在睪丸、腎組織，hIL-17RLM-S(綠光)和FGFR1(紅光)具有極強的陽性免疫染色，並且具有非常相似的表達樣式和細胞特異性。另外merge實驗分析結果表明，hIL-17RLM-S和FGFR1明顯共表達定位於睪丸組織的特異細胞類型。在腎組織和其它組織，儘管hIL-17RLM-S和FGFR1具有較強的陽性免疫染色和相似的表達分布，但是merge結果卻並未顯示hIL-17RLM-S和FGFR1的共定位表達分布。這表明hIL-17RLM-S和FGFR1的共定位表達分布具有組織特異性。也暗示hIL-17RLM-S與FGFR1在睪丸組織生精細胞中的特異性共定位表達很可能與精子的形成有關。
實施例4、hIL-17RLM-S抑制FGF介導的下遊信號通路有資料表明FGF介導的下遊Ras-Raf-MEK-MAPK信號通路受Sprouty家族成員的負調節。在早期斑馬魚胚胎發育過程中，由於FGF3，FGF8，spouty2，sprouty4與zSef/zhIL-17RLM-S為一協同表達組。因而，我們假設hIL-17RLM-S有可能同sprouty家族成員一樣，具有在高等生物抑制FGF介導的下遊信號通路及相應的某些生物學功能。
實驗中，首先構建了EGFP-tagged hIL-17RLM-S(WT)，EGFP-hIL-17RLM-Secdtm(ΔC)(含有hIL-17RLM-S的胞外結構域和跨膜結構域)，EGFP-hIL-17RLM-Stmcyd(ΔN)(含有hIL-17RLM-S的胞內結構域和跨膜結構域)和EGFP-hIL-17RLM-S(DNΔ327-333)(缺失含有潛在酪氨酸磷酸化部位的一段基因序列)真核表達質粒。經DNA測序證實和western blot檢測其在細胞的過表達正確。
在大鼠嗜鉻神經細胞瘤細胞系-PC12細胞過表達上述真核表達質粒，轉染36小時後，使用鹼性成纖維細胞生長因子(FGF2)刺激細胞約72小時後，螢光顯微鏡拍照和計數細胞分化的百分率。結果顯示野生型hIL-17RLM-S能夠顯著抑制FGF2誘導PC12細胞的分化。然而，野生型全長hIL-17RLM-S對FGF2誘導PC12細胞分化的這種抑制作用能夠被EGFP-hIL-17RLM-Secdtm(ΔC)逆轉，但並不能夠被EGFP-hIL-17RLM-Stmcyd(ΔN)和EGFP-hIL-17RLM-S(DNΔ327-333)所逆轉。這一結果暗示hIL-17RLM-S的胞內結構域對與hIL-17RLM-S對FGF2誘導PC12細胞分化的抑制作用是必需的，然而hIL-17RLM-S的胞外結構域以及hIL-17RLM-S的胞內區潛在酪氨酸磷酸化部位卻並不需要。這一結果也表明hIL-17RLM-S的胞內結構域是對FGF2誘導PC12細胞分化抑制作用的功能結構域。
序列表160221012114508212DNA213人屬人種(Homo sapiens)4001cagcagtggt aacgacgcac agtacgcggg ggaaaagaaa cgggaagtgg ccgtgggccg 60gtgaattccg tgtagtggcc aagctttgtt ccaaagaggg ggaggtggtg acagtctctt120gcccactgaa gcgtgccaga cagagtgcta ggcatggggg cagaggtgaa tcagatgaca180gccacctctc accacgagga gtggctgaaa gtgtgactgg actacaggca atcctggcct240tggcagggag tggggccagc cagcagaaac agtgggctgt acaacatcac cttcaaatat300gacaattgta ccacctactt gaatccagtg gggaagcatg tgattgctga cgcccagaat360atcaccatca gccagtatgc ttgccatgac caagtggcag tcaccattct ttggtcccca420ggggccctcg gcatcgaatt cctgaaagga tttcgggtaa tactggagga gctgaagtcg480gagggaagac agtgccaaca actgattcta aaggatccga agcagctcaa cagtagcttc540aaaagaactg gaatggaatc tcaacctttc ctgaatatga aatttgaaac ggattatttc600gtaaaggttg tcccttttcc ttccattaaa aacgaaagca attaccaccc tttcttcttt660agaacccgag cctgtgacct gttgttacag ccggacaatc tagcttgtaa acccttctgg720aagcctcgga acctgaacat cagccagcat ggctcggaca tgcaggtgtc cttcgaccac780gcaccgcaca acttcggctt ccgtttcttc tatcttcact acaagctcaa 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570Leu Ser Ser Gly Ser Cys Lys Ala Asp Leu Gly Cys Arg Ser Tyr575 580 585Thr Asp Glu Leu His Ala Val Ala Pro Leu590 59權利要求
1.一種人白細胞介素-17受體樣蛋白，它具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列或將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的蛋白質，其特徵在於所述蛋白質具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列。
3.一種人白細胞介素-17受體樣蛋白的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
4.根據權利要求3所述的基因，其特徵在於所述人白細胞介素-17受體樣蛋白的編碼基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.權利要求1所述的人白細胞介素-17受體樣蛋白在使Stat5因子活化中的應用。
6.權利要求1所述的人白細胞介素-17受體樣蛋白在介導細胞增殖中的應用。
7.權利要求1所述的人白細胞介素-17受體樣蛋白在製造促進或抑制精子形成的藥物中的作用。
8.權利要求1所述的人白細胞介素-17受體樣蛋白在高等生物抑制FGF介導的下遊信號通路中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種人白細胞介素－17受體樣蛋白及其編碼基因與應用。本發明的目的是提供一種新的人白細胞介素－17受體樣蛋白及其編碼基因。一種人白細胞介素－17受體樣蛋白，它具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列或將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。一種人白細胞介素－17受體樣蛋白的編碼基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。本發明的人白細胞介素－17受體樣蛋白可以使Stat5因子活化、介導細胞增殖，並可望在促進或抑制精子形成的藥物中得到應用。
文檔編號C07K14/435GK1465592SQ02123540
公開日2004年1月7日 申請日期2002年7月1日 優先權日2002年7月1日
發明者熊世勤, 常智傑, 傅新元 申請人:清華大學