一種膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑及製備方法

2023-04-24 02:45:26 2

一種膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑及製備方法
【專利摘要】本發明提供了一種膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑及其製法，該對比劑由丙烯醯胺類單體、帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體、超順磁性鐵氧化物納米粒、螢光染料和乳鐵蛋白組成，其中，丙烯醯胺類單體與帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體通過聚合反應形成共聚物納米凝膠，在聚合反應過程中加入超順磁性鐵氧化物納米粒獲得超順磁性共聚物納米凝膠。將螢光染料與乳鐵蛋白以共價鍵進行結合獲得標記有螢光染料的乳鐵蛋白，再將上述超順磁性共聚物納米凝膠與標記有螢光染料的乳鐵蛋白通過共價鍵結合獲得本發明的膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑，具有特異性、選擇性、對比效果好、毒副作用低和雙模式成像等特點。
【專利說明】一種膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑及製備方
【技術領域】
[0001]本發明涉屬於學檢驗和生物【技術領域】，涉及膠質瘤靶向磁共振和螢光成像對比劑，具體涉及膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑及製備方法。
【背景技術】
[0002]膠質瘤是腦內最常見的原發性惡性腫瘤，據統計，我國膠質瘤每年新發病例4-13萬人，惡性程度高，佔全身惡性腫瘤致死率中第四位。目前，膠質瘤的首選治療方法仍為手術，但臨床實踐顯示，手術難以完全切除，且致殘率高，嚴重影響患者生活質量及生存率。研究表明，造成這一現象的重要原因在於:①膠質瘤的術前診斷缺乏特異性，不能準確分辨細小腫瘤；②膠質瘤切除時缺乏術中引導，由於膠質瘤具有浸潤性，無法準確界定腫瘤邊界，無法準確切除。因此，如何在術前診斷中特異性顯示膠質瘤生物學特性，在術中準確界定膠質瘤的邊界，引導手術切除，提高療效，是當前臨床工作需要急迫解決的課題，也是目前有關膠質瘤研究中的熱點和難點。
[0003]磁共振(MRI)作為一種新型無創檢查技術，能安全有效地呈現人體組織及器官的結構及功能形態，已經成為膠質瘤診斷的首選方法。臨床應用中，約超過30 %的病例需要使用磁共振成像對比劑來接受增強掃描。該方法可以有效提高成像對比度，使原來缺乏對比差異的組織結構顯示得更加清晰，從而更好的顯示體內組織器官的結構和病變的性質及功能狀態，能夠大大提高診斷的準確性和靈敏度。超順磁性氧化鐵對比劑可以提高病變組織與正常腦組織的對比度，與傳統的釓類對比劑相比，具有磁飽和強度高、弛豫率高和生物相容性好的優點，可被人體正常代謝，對組織無毒副作用。但普通超順磁性氧化鐵對比劑主要被網狀內皮系統所識別，被吞噬細胞攝取，沉積在網狀內皮細胞豐富的組織和器官中，缺乏對腫瘤組織特別是膠質瘤的靶向性。此外，普通超順磁性氧化鐵對比劑容易團聚，在生理環境下穩定性較差。因此，採用諸如納米凝膠在內的共聚物包裹超順磁性氧化鐵對比劑，提高其穩定性；並偶聯靶向分子， 提供主動靶向能力是一種有效方法。
[0004]螢光成像是指利用能在特定波長的激發光激發下產生螢光的物質(如量子點、螢光納米顆粒和螢光染料等)或以螢光素酶以及螢光素組成的螢光報告對作為識蹤標記，利用光學檢測儀器，通過監控生物個體內螢光報告物質的變化情況實現對目標對象的實時、原位檢測。螢光成像更能反映生物組織的實際情況且不必對生物體造成傷害，從而可用於對腫瘤組織、生理病變過程、藥物體內分布和作用進行分析和監測。螢光成像檢測靈敏度高，生物組織解析度高，且因不涉及放射性物質和方法，安全性良好。目前，已有研究利用螢光成像引導手術進行並已經嘗試在臨床上使用。
[0005]膠質瘤靶向的配體主要是通過與膠質瘤細胞受體特異性結合，以受體介導機制協助其修飾的載體或其他系統定向運輸至腫瘤部位。乳鐵蛋白是一種多功能的蛋白質。已經有文獻報導乳鐵蛋白能通過單向受體介導的轉胞作用通過血腦屏障。有證據表明腦微血管內皮細胞上有乳鐵蛋白的結合位點，乳鐵蛋白修飾的外源性基因在整個大腦均有表達。同時，乳鐵蛋白偶聯的基因載體在腦部有較高的累積。
[0006]當前，磁共振和螢光雙模式成像對比劑已得到廣泛研究，在生物學和醫學領域發揮了重要的作用，具有很好的應用前景，但仍有發展和完善的空間。(I)對比劑的穩定性不足，容易團聚。(2)對比劑粒徑較大，容易發生非特異性吸附和吞噬。(3)磁性材料與螢光材料之間存在相互幹擾，導致螢光容易淬滅。(4)靶向分子特異性不足，無法有效到達腫瘤部位。
【發明內容】

[0007]本發明的任務是提供一種膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑，並提供該對比劑的其製備方法。
[0008]實現本發明任務的技術方案是:
[0009]本發明提供的膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑，是超順磁性共聚物納米凝膠和標記有螢光染料的乳鐵蛋白的共價鍵結合物。
[0010]所述的超順磁性共聚物納米凝膠，是由丙烯醯胺類單體與帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體進行聚合反應形成共聚物納米凝膠，並在所述聚合反應過程中加入超順磁性鐵氧化物納米粒獲得的產物，其中所述丙烯醯胺類單體是N-異丙基丙烯醯胺、N-(2-羥丙基)丙烯醯胺、聚丙烯醯嗎啉、N-(3_羥丙基)_丙烯醯胺、聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯、2-甲基丙烯醯氧基-乙基磷酸膽鹼、2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2- 二異丙氨基乙基甲基丙烯酸酯中的一種，優選N-異丙基丙烯醯胺、N-(2-羥丙基)丙烯醯胺或N-(3-羥丙基)_丙烯醯胺。所述的帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體是丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯胺、聚2-乙烯基吡啶、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、磺胺嘧啶衍生物中的一種，優選丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸或甲基丙烯胺。所述的超順磁性鐵氧化物納米粒是粒徑為8-30nm的超順磁性三氧化二鐵納米粒或超順磁性四氧化三鐵納米粒，優選為10-20nm的超順磁性三氧化二鐵納米粒或超順磁性四氧化三鐵納米粒。
[0011]所述的標記有螢光染料的乳鐵蛋白是螢光染料與乳鐵蛋白通過共價鍵結合獲得的產物，其中所述的螢光染料為Cy系列螢光染料、異硫氰酸螢光素、羰花青染料螢光染料DiR碘化物、羰花青染料螢光染料DiO高氯酸鹽中的一種，優選Cy系列螢光染料或羰花青染料螢光染料DiR碘化物；所述的Cy系列螢光染料是Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7，優選Cy5.5或Cy7。
[0012]本發明提供的膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的製備方法，包括以下步驟:
[0013]步驟一、製備超順磁性共聚物納米凝膠:取丙烯醯胺類單體、超順磁性氧化鐵納米粒、N, N』 -亞甲基雙丙稀醯胺、十二烷基硫酸鈉溶於去離子水中，攪拌並通入氮氣，加入過硫酸鉀和帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體，在50-100°C反應4-8小時。將反應物用去離子水透析去除未反應單體，冷凍乾燥獲得凍乾粉，即為超順磁性共聚物納米凝膠。再用去離子水復溶，得到濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液。其中，丙烯醯胺類單體與帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體的摩爾比為4: 1-40: 1，優選8: 1-20: I。
[0014]步驟二、製備標記有螢光染料的乳鐵蛋白:取乳鐵蛋白溶於碳酸氫鈉水溶液中，向其中加入螢光染料溶液，混合均勻後避光振蕩，然後使用Sephadex? G_50樹脂柱分離，獲得標記有螢光染料的乳鐵蛋白。其中，所用乳鐵蛋白的碳酸氫鈉溶液濃度範圍為0.05-50mg/mL，螢光染料溶液濃度範圍為l_50mg/mL，螢光染料與乳鐵蛋白摩爾比為
0.3: 1-50: 1，優選 2: 1-20: I。
[0015]步驟三、製備活化的超順磁性共聚物納米凝膠:向步驟⑴獲得的濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液中加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺，振蕩後用磁鐵分離，並加入pH = 7.4,0.lmol/L的磷酸鹽緩衝液分散，獲得濃度為3% (質量/體積)的活化的超順磁性共聚物納米凝膠。其中，帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾比為1:1:1。
[0016]步驟四、製備膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑:向步驟(3)獲得的活化的超順磁性共聚物納米凝膠中加入步驟(2)獲得的標記有螢光染料的乳鐵蛋白，室溫下反應過夜，用磁鐵分離，即得本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑。其中，活化的超順磁性共聚物納米凝膠中鐵元素含量與標記有螢光染料的乳鐵蛋白中乳鐵蛋白含量的摩爾比為1: 0.01-1: 1，優選1: 0.1-1: 0.5。
[0017]上述製備方法步驟一中所述的丙烯醯胺類單體是N-異丙基丙烯醯胺、N-(2_羥丙基)丙烯醯胺、聚丙烯醯嗎啉、N-(3-羥丙基)-丙烯醯胺、聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯、2-甲基丙烯醯氧基-乙基磷酸膽鹼、2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯或2- 二異丙氨基乙基甲基丙烯酸酯中的一種，優選N-異丙基丙烯醯胺、N-(2-羥丙基)丙烯醯胺、N-(3-羥丙基)-丙烯 醯胺中的一種；
[0018]上述製備方法步驟一中所述的帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體為丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯胺、聚2-乙烯基吡啶、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、磺胺嘧啶衍生物中的一種，優選丙烯 酸、丙烯胺、甲基丙烯酸或甲基丙烯胺。
[0019]上述製備方法的步驟二中所述的超順磁性鐵氧化物納米粒是粒徑為8_30nm的超順磁性三氧化二鐵納米粒或超順磁性四氧化三鐵納米粒,優選粒徑為10-20nm的超順磁性三氧化二鐵納米粒或超順磁性四氧化三鐵納米粒。
[0020]上述製備方法的步驟二中所述的螢光染料為Cy系列螢光染料、異硫氰酸螢光素、羰花青染料螢光染料DiR碘化物、羰花青染料螢光染料DiO高氯酸鹽中的一種，優選Cy系列螢光染料或羰花青染料螢光染料DiR碘化物；所述的Cy系列螢光染料是Cy3、Cy5、Cy5.5或 Cy7，優選 Cy5.5、Cy7。
[0021]本發明利用丙烯醯胺類單體與帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體通過聚合反應形成共聚物納米凝膠，並在反應中加入超順磁性鐵氧化物納米粒獲得超順磁性共聚物納米凝膠，再通過共價鍵結合標記有螢光染料的乳鐵蛋白製得。所述共聚物納米凝膠具有良好的載藥能力、穩定性和可修飾性，可以大量載負順磁性氧化鐵納米粒和螢光染料，並提供比單純鐵氧化物納米粒更加優 越的穩定性和可修飾性。同時，乳鐵蛋白與膠質瘤細胞高表達的乳鐵蛋白受體具有高親和力，可以有效實現靶向顯影。此外，磁共振和螢光雙模式成像不但能夠用於膠質瘤診斷，從而可以為膠質瘤提供一體化的術前磁共振診斷、術中螢光引導切除和術後療效評價。
[0022]本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑由丙烯醯胺類單體、帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體、超順磁性鐵氧化物納米粒、螢光染料和乳鐵蛋白組成，其中，丙烯醯胺類單體與帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體通過聚合反應形成共聚物納米凝膠；通過在上述聚合反應過程中加入超順磁性鐵氧化物納米粒獲得超順磁性共聚物納米凝膠；同時，將螢光染料與乳鐵蛋白通過共價鍵進行結合獲得標記有螢光染料的乳鐵蛋白；最後，將上述超順磁性共聚物納米凝膠與標記有螢光染料的乳鐵蛋白通過共價鍵結合獲得本發明的膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑。
[0023]本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的體外表徵:
[0024](I)膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的形貌與粒徑:形貌與粒徑利用透射電鏡表徵。結果顯示偶聯後的對比劑為球形，分布均勻，粒徑為30-500nm，優選50_160nm。
[0025](2)膠質瘤祀向磁共振和突光雙模式成像對比劑的水合半徑與粒徑分布:水合半徑與粒徑分布利用雷射粒度儀測定。結果顯示偶聯後的對比劑水合半徑為50-800nm，優選80-200nm,粒徑分布窄，無團聚。
[0026](3)膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的磁學性能:磁飽和強度和超順磁性利用振動樣品磁強計測定。對比劑偶聯前後具有超順磁性，磁飽和強度範圍分別為30-200emu/g Fe和30_200emu/g Fe，優選範圍分別為60_120emu/g Fe和50_110emu/g Fe。
[0027](4)膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的磁共振成像能力:將對比劑用水稀釋成不同濃度，利用磁共振掃描儀測定不同濃度對比劑的成像能力。結果顯示對比劑偶聯前後均具有良好的成像能力，隨著對比劑濃度增加，可以使磁共振信號值顯著降低。
[0028](5)膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的弛豫率:將對比劑用水稀釋成不同濃度，利用磁共振掃描儀測定不同濃度對比劑的弛豫時間(T2)值，計算得到偶聯前後對比劑的弛豫率(r2)範圍為100-300πιΜ?優選110-200πιΜ?。
[0029](6)膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的螢光發射光譜:螢光光譜通過螢光分光光度計測定。結果顯示偶聯後對比劑具有與螢光染料標記乳鐵蛋白相似的發射峰，表明具有螢光，並證實了偶聯步驟。
[0030](7)膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的螢光成像能力:螢光成像能力通過IVIS小動物成像系統測定。結果顯示偶聯後的對比劑具有螢光成像的能力，隨著對比劑濃度增加，螢光信號強度顯著增大。
[0031]本發明的有益效果通過以下動物實驗表明:
[0032]實驗動物:Wistar大鼠，湖北預防醫學科學院提供，體重200_300g，雄性。
[0033]設備:GE 3.0T Signa HDxt磁共振成像系統
[0034](I)大鼠膠質瘤模型的建立:在大鼠前因右偏3毫米，前偏I毫米的的位置將顱骨鑽開，利用立體定位儀將I X IO6個細胞注入該位置，約10天後瘤直徑達到(5mmX5mm)用於動物實驗。
[0035](2)實驗動物磁共振和螢光成像:大鼠腫瘤模型9隻，隨機分為3組，一組為空白組，尾靜脈注射生理鹽水；一組為實驗組，尾靜脈注射經生理鹽水稀釋的本發明對比劑，按照12mg Fe/kg體重注射；一組為對照組，尾靜脈注射相同劑量的偶聯前對比劑，分別在注射前和注射後不同時間點進行磁共振掃描。磁共振掃描後，立即處死大鼠，進行腫瘤螢光成像和拍照。[0036](3)組織病理分析:大鼠處死後，取腦組織進行組織病理分析，H&E染色用於判定膠質瘤組織，普魯士藍染色用於證實鐵顆粒的存在。
[0037]結果顯示，注射本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑後，從注射後6小時起，腫瘤區域的磁共振信號變化明顯。在注射後6小時至48小時內，信號變化的程度和範圍都顯著擴大。膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑能夠達到特異性靶向腫瘤的要求。
[0038]本發明利用丙烯醯胺類單體與帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體通過聚合反應形成共聚物納米凝膠，並在反應中加入超順磁性鐵氧化物納米粒獲得超順磁性共聚物納米凝膠，再通過共價鍵結合標記有螢光染料的乳鐵蛋白製得。提供了一種特異性、選擇性、對比效果好、毒副作用低的膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑，可以實現膠質瘤靶向的一體化術前磁共振診斷、術中螢光引導切除和術後療效評價。本發明提供的對比劑顯示出以下優勢:
[0039](I)與傳統釓類對比劑和超順磁性鐵氧化物對比劑相比，本發明中形成的共聚物納米凝膠是尺度範圍在1-1OOOnm內的聚合物三維網絡，由於網絡中富含大量的水，因此本發明具有良好的生物相容性。
[0040](2)與傳統超順磁性鐵氧化物對比劑和現有文獻報告的雙模式成像對比劑相比，本發明能夠極大地提高穩定性(形成的共聚物納米凝膠網絡可以阻止鐵氧化物納米粒聚集)，特別是生理條件下的穩定性。從而實現穩定地載負大量鐵氧化物納米粒，提高成像能力。
[0041](3)與傳統超順磁性鐵氧化物對比劑相比，本發明中形成的共聚物納米凝膠富含可修飾位點(羧基或巰基或氨基)，能方便、容易地修飾、偶聯靶向分子乳鐵蛋白，從而賦予該對比劑對膠質瘤的靶向性。
[0042](4)對比劑載負的螢光染料具有靈敏度高、螢光強度高和抗漂白性能強的優點，能夠有效應用於體內。
[0043]本發明提供了一種膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑及其製備方法。所述對比劑由丙烯醯胺類單體、帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體、超順磁性鐵氧化物納米粒、螢光染料和乳鐵蛋白組成，其中，丙烯醯胺類單體與帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體通過聚合反應形成共聚物納米凝膠；通過在上述聚合反應過程中加入超順磁性鐵氧化物納米粒獲得超順磁性共聚物納米凝膠；同時，將螢光染料與乳鐵蛋白通過共價鍵進行結合獲得標記有螢光染料的乳鐵蛋白；最後，將上述超順磁性共聚物納米凝膠與標記有螢光染料的乳鐵蛋白通過共價鍵結合獲得本發明的膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑。該對比劑中的共聚物納米凝膠具有良好的載藥能力、穩定性和可修飾性，可以實現高含量的超順磁性氧化鐵納米粒和螢光染料載負，並提供比單純氧化鐵納米粒更加優越的穩定性和可修飾性。同時，乳鐵蛋白與股質瘤細胞聞表達的乳鐵蛋白受:體具有聞未和力，可以有效實現靶向顯影。此外，磁共振和螢光雙模式成像不但能夠用於膠質瘤診斷，還可以在膠質瘤切除手術中提供螢光引導。基於上述優點和特性，本發明提供一種特異性、選擇性、對比效果好、毒副作用低的膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑，可以為膠質瘤提供一體化的術前磁共振診斷、術中螢光引導切除和術後療效評價。【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1為膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的透射電鏡結果圖。顯示對比劑為球形，分散均一，粒徑為86.4±3.4nm。
[0045]圖2為膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的水合半徑分布圖。顯示對比劑的水合半徑為95.5 ±6.2nm，粒徑分布窄。
[0046]圖3為膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的穩定性結果。顯示對比劑在模擬生理環境的緩衝液中，穩定性良好，沒有發生團聚現象。
[0047]圖4為膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的磁學性能結果圖，圖中曲線I為偶聯前超順磁性納米凝膠(即偶聯前的對比劑)，曲線2為偶聯後超順磁性納米凝膠(即本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑)。顯示對比劑偶聯前後具有超順磁性，磁飽和強度分別為67.9emu/g Fe和61.5emu/g Fe。
[0048]圖5為膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的磁共振成像結果圖，圖中第一排為偶聯前超順磁性納米凝膠(即偶聯前的對比劑)，第二排為偶聯後超順磁性納米凝膠(即本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑)。顯示對比劑偶聯前後均具有良好的磁共振成像能力，隨著對比劑濃度增加，磁共振信號顯著降低。
[0049]圖6為膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的弛豫率結果圖，圖中直線I為偶聯前超順磁性納米凝膠(即偶聯前的對比劑`)，直線2為偶聯後超順磁性納米凝膠(即本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑)。顯示對比劑偶聯前後弛豫率分別為142.7ι?Μ? 和 129.3ι?Μ?。
[0050]圖7為膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的螢光發射光譜圖，圖中曲線I為標記有螢光染料Cy5.5的乳鐵蛋白，曲線2為偶聯後超順磁性納米凝膠(即本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑)，曲線3為偶聯前超順磁性納米凝膠(即偶聯前的對比劑)。顯示顯示對比劑具有與螢光染料相同的螢光發射光譜，表明具有螢光。
[0051]圖8為膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的螢光成像結果圖，圖中第一排為偶聯前超順磁性納米凝膠(即偶聯前的對比劑)，第二排為偶聯後超順磁性納米凝膠(即本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑)。顯示對比劑偶聯後具有良好的螢光成像能力，隨著對比劑濃度增加，螢光信號顯著增大。
[0052]圖9為不同時間點時膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑在膠質瘤大鼠體內磁共振成像結果圖。其中:
[0053]第一行(A-F)為生理鹽水注射膠質瘤大鼠的體內結果圖。顯示注射前後腫瘤區域磁共振信號隨時間無明顯改變。
[0054]第二行(G-L)而偶聯後對比劑注射膠質瘤大鼠的體內結果圖。顯示注射前後腫瘤區域磁共振信號隨時間明顯改變，在時間範圍內，隨時間延長信號值改變明顯，範圍增大。
[0055]第三行(M-R)為偶聯前對比劑注射膠質瘤大鼠的體內結果圖。顯示注射前後腫瘤區域磁共振信號隨時間無明顯改變。
[0056]圖10為膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑在膠質瘤大鼠體內螢光成像結果圖。其中:
[0057]第一行(A，B)為生理鹽水注射膠質瘤大鼠的體內結果圖。顯示注射前後腫瘤區域螢光信號無明顯改變。[0058]第二行(C，D)為偶聯後超順磁性納米凝膠(即本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑)注射膠質瘤大鼠的體內結果圖。顯示注射前後腫瘤區域螢光信號明顯改變，腫瘤邊界清晰可見。
[0059]第三行(E，F)為偶聯前超順磁性納米凝膠(即偶聯前的對比劑)注射膠質瘤大鼠的體內結果圖。顯示注射前後腫瘤區域螢光信號無明顯改變。
[0060]圖11為膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑注射後膠質瘤大鼠腦組織切片組織病理分析結果圖(H&E染色)。其中:
[0061]A為注射生理鹽水。顯示為膠質瘤組織，但無邊界。
[0062]B為注射偶聯後超順磁性納米凝膠(即本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑)。顯示為膠質瘤組織，可見邊界。
[0063]C為注射偶聯前超順磁性納米凝膠(即偶聯前的對比劑)。顯示為膠質瘤組織，但無邊界。
[0064]圖12為為膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑注射後膠質瘤大鼠腦組織切片組織病理分析結果圖(普魯士藍染色)。其中:
[0065]A為注射生理鹽水。顯示膠質瘤組織中無明顯鐵顆粒存在。
[0066]B為注射偶聯後超順磁性納米凝膠(即本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑)。顯示膠質瘤組織中有大量鐵顆粒存在。
[0067]C為注射偶聯前超順磁性納米凝膠(即偶聯前的對比劑)。顯示膠質瘤組織中僅有少量鐵顆粒存在。
【具體實施方式】
[0068]實施例1
[0069]一種膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑及其製備
[0070](I)製備超順磁性共聚物納米凝膠:取N-(3-羥丙基)_丙烯醯胺、IOnm超順磁性三氧化二鐵納米粒、N，N』 -亞甲基雙丙稀醯胺、十二烷基硫酸鈉溶於去離子水中，攪拌並通入氮氣，加入過硫酸鉀和甲基丙烯酸，在50-100°C反應4-8小時。其中，N- (3-羥丙基)-丙烯醯胺與甲基丙烯酸的摩爾比為8: I。將反應物用去離子水透析去除未反應單體，冷凍乾燥獲得凍乾粉，即為超順磁性共聚物納米凝膠。再用去離子水復溶，得到濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液。
[0071](2)製備標記有螢光染料的乳鐵蛋白:取乳鐵蛋白溶於碳酸氫鈉水溶液中，向其中加入Cy7溶液，混合均勻後避光振蕩，然後使用Sephadex? G_50樹脂柱分離，獲得標記有螢光染料的乳鐵蛋白。其中，所用乳鐵蛋白的碳酸氫鈉溶液濃度範圍為0.05mg/mL，Cy7溶液濃度範圍為lmg/mL，Cy7與乳鐵蛋白摩爾比為2: I。
[0072](3)製備活化的超順磁性共聚物納米凝膠:向步驟⑴獲得的濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液中加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺，其中，甲基丙烯酸、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾比為1:1:1。振蕩後用磁鐵分離，並加入PH= 7.4、0.lmol/L的磷酸鹽緩衝液分散，獲得濃度為3% (質量/體積)的活化的超順磁性共聚物納米凝膠。
[0073](4)製備膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑:向步驟(3)獲得的活化的超順磁性共聚物納米凝膠中加入步驟(2)獲得的標記有螢光染料的乳鐵蛋白，其中，活化的超順磁性共聚物納米凝膠中鐵元素含量與標記有螢光染料的乳鐵蛋白中乳鐵蛋白含量的摩爾比為1: 0.1。室溫下反應過夜，用磁鐵分離，即得本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑。
[0074]實施例2
[0075]一種膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑及其製備
[0076](I)製備超順磁性共聚物納米凝膠:取N-異丙基丙烯醯胺、IOnm超順磁性四氧化三鐵納米粒、N，N』_亞甲基雙丙稀醯胺、十二烷基硫酸鈉溶於去離子水中，攪拌並通入氮氣，加入過硫酸鉀和丙烯酸，在50-100°C反應4-8小時。其中，N-異丙基丙烯醯胺與丙烯酸的摩爾比為10: I。將反應物用去離子水透析去除未反應單體，冷凍乾燥獲得凍乾粉，即為超順磁性共聚物納米凝膠。再用去離子水復溶，得到濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液。
[0077](2)製備標記有螢光染料的乳鐵蛋白:取乳鐵蛋白溶於碳酸氫鈉水溶液中，向其中加入Cy5.5溶液，混合均勻後避光振蕩，然後使用Sephadex? G_50樹脂柱分離，獲得標記有螢光染料的乳鐵蛋白。其中，所用乳鐵蛋白的碳酸氫鈉溶液濃度範圍為10mg/mL，Cy5.5溶液濃度範圍為10mg/mL，Cy5.5與乳鐵蛋白摩爾比為10:1。
[0078](3)製備活化的超順磁性共聚物納米凝膠:向步驟⑴獲得的濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液中加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺，其中，丙烯酸、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾比為1:1:1。振蕩後用磁鐵分離，並加入PH = 7.4、0.lmol/L的磷酸鹽緩衝液分散，獲得濃度為3% (質量/體積)的活化的超順磁性共聚物納米凝膠。
[0079](4)製備膠質瘤靶向磁 共振和螢光雙模式成像對比劑:向步驟(3)獲得的活化的超順磁性共聚物納米凝膠中加入步驟(2)獲得的標記有螢光染料的乳鐵蛋白，其中，活化的超順磁性共聚物納米凝膠中鐵元素含量與標記有螢光染料的乳鐵蛋白中乳鐵蛋白含量的摩爾比為1:0.2。室溫下反應過夜，用磁鐵分離，即得本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑。
[0080]實施例3
[0081]一種膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑及其製備
[0082](I)製備超順磁性共聚物納米凝膠:取N-(2_羥丙基)丙烯醯胺、20nm超順磁性三氧化二鐵納米粒、N，N』 -亞甲基雙丙稀醯胺、十二烷基硫酸鈉溶於去離子水中，攪拌並通入氮氣，加入過硫酸鉀和丙烯胺，在50-100°C反應4-8小時。其中，N-(2-羥丙基)丙烯醯胺與丙烯胺的摩爾比為20: I。將反應物用去離子水透析去除未反應單體，冷凍乾燥獲得凍乾粉，即為超順磁性共聚物納米凝膠。再用去離子水復溶，得到濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液。
[0083](2)製備標記有螢光染料的乳鐵蛋白:取乳鐵蛋白溶於碳酸氫鈉水溶液中，向其中加入羰花青染料螢光染料DiR碘化物溶液，混合均勻後避光振蕩，然後使用Sephadex?G-50樹脂柱分離，獲得標記有螢光染料的乳鐵蛋白。其中，所用乳鐵蛋白的碳酸氫鈉溶液濃度範圍為50mg/mL，羰花青染料螢光染料DiR碘化物溶液濃度範圍為50mg/mL，羰花青染料螢光染料DiR碘化物與乳鐵蛋白摩爾比為20: I。[0084](3)製備活化的超順磁性共聚物納米凝膠:向步驟⑴獲得的濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液中加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺，其中，丙烯胺、1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾比為1:1:1。振蕩後用磁鐵分離，並加入PH = 7.4、0.lmol/L的磷酸鹽緩衝液分散，獲得濃度為3% (質量/體積)的活化的超順磁性共聚物納米凝膠。
[0085](4)製備膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑:向步驟(3)獲得的活化的超順磁性共聚物納米凝膠中加入步驟(2)獲得的標記有螢光染料的乳鐵蛋白，其中，活化的超順磁性共聚物納米凝膠中鐵元素含量與標記有螢光染料的乳鐵蛋白中乳鐵蛋白含量的摩爾比為1: 0.5。室溫下反應過夜，用磁鐵分離，即得本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑。
[0086]實施例4
[0087]一種膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑及其製備
[0088](I)製備超順磁性共聚物納米凝膠:取聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯、8nm超順磁性四氧化三鐵納米粒、N，N』 -亞甲基雙丙稀醯胺、十二烷基硫酸鈉溶於去離子水中，攪拌並通入氮氣，加入過硫酸鉀和甲基丙烯胺，在50-100°C反應4-8小時。其中，聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯與甲基丙烯胺的摩爾比為4: I。將反應物用去離子水透析去除未反應單體，冷凍乾燥獲得凍乾粉，即為超順磁性共聚物納米凝膠。再用去離子水復溶，得到濃度為3%(質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液。
[0089](2)製備標記有螢光染料的乳鐵蛋白:取乳鐵蛋白溶於碳酸氫鈉水溶液中，向其中加入Cy3溶液，混合均勻後避光振蕩，然後使用Sephadex? G_50樹脂柱分離，獲得標記有螢光染料的乳鐵蛋白。其中，所用乳鐵蛋白的碳酸氫鈉溶液濃度範圍為10mg/mL，Cy3溶液濃度範圍為10mg/mL，Cy3與乳鐵蛋白摩爾比為50: I。
[0090](3)製備活化的超順磁性共聚物納米凝膠:向步驟⑴獲得的濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺，其中，甲基丙烯胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾比為1:1:1。振蕩後用磁鐵分離，並加入PH= 7.4、0.lmol/L的磷酸鹽緩衝液分散，獲得濃度為3% (質量/體積)的活化的超順磁性共聚物納米凝膠。
[0091](4)製備膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑:向步驟(3)獲得的活化的超順磁性共聚物納米凝膠中加入步驟(2)獲得的標記有螢光染料的乳鐵蛋白，其中，活化的超順磁性共聚物納米凝膠中鐵元素含量與標記有螢光染料的乳鐵蛋白中乳鐵蛋白含量的摩爾比為1:1。室溫下反應過夜，用磁鐵分離，即得本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑。
[0092]實施例5
[0093]一種膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑及其製備
[0094](I)製備超順磁性共聚物納米凝膠:取2- 二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯、30nm超順磁性四氧化三鐵納米粒、N，N』 -亞甲基雙丙稀醯胺、十二烷基硫酸鈉溶於去離子水中，攪拌並通入氮氣，加入過硫酸鉀和甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯，在50-100°C反應4-8小時。其中，2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯與甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯的摩爾比為40: I。將反應物用去離子水透析去除未反應單體，冷凍乾燥獲得凍乾粉，即為超順磁性共聚物納米凝膠。再用去離子水復溶，得到濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液。[0095](2)製備標記有突光染料的乳鐵蛋白:取乳鐵蛋白溶於碳酸氧納水溶液中，向其中加入異硫氰酸螢光素溶液，混合均勻後避光振蕩，然後使用Sephadex? G_50樹脂柱分離，獲得標記有螢光染料的乳鐵蛋白。其中，所用乳鐵蛋白的碳酸氫鈉溶液濃度範圍為10mg/mL,異硫氰酸螢光素溶液濃度範圍為10mg/mL,異硫氰酸螢光素與乳鐵蛋白摩爾比為
0.3: I。
[0096](3)製備活化的超順磁性共聚物納米凝膠:向步驟⑴獲得的濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液中加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺，其中，甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾比為1:1:1。振蕩後用磁鐵分離，並加入pH= 7.4、
0.lmol/L的磷酸鹽緩衝液分散，獲得濃度為3% (質量/體積)的活化的超順磁性共聚物納米凝膠。
[0097](4)製備膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑:向步驟(3)獲得的活化的超順磁性共聚物納米凝膠中加入步驟(2)獲得的標記有螢光染料的乳鐵蛋白，其中，活化的超順磁性共聚物納米凝膠中鐵元素含量與標記有螢光染料的乳鐵蛋白中乳鐵蛋白含量的摩爾比為1: 0.01。室溫下反應過夜，用磁鐵分離，即得本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑。
[0098]實施例6
[0099]一種膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑及其製備
[0100](I)製備超順磁性共聚物納米凝膠:取N-異丙基丙烯醯胺、30nm超順磁性四氧化三鐵納米粒、N，N』_亞甲基雙丙稀醯胺、十二烷基硫酸鈉溶於去離子水中，攪拌並通入氮氣，加入過硫酸鉀和丙烯酸，在50-100°C反應4-8小時。其中，N-異丙基丙烯醯胺與丙烯酸的摩爾比為20: I。將反應物用去離子水透析去除未反應單體，冷凍乾燥獲得凍乾粉，即為超順磁性共聚物納米凝膠。再用去離子水復溶，得到濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液。
[0101](2)製備標記有螢光染料的乳鐵蛋白:取乳鐵蛋白溶於碳酸氫鈉水溶液中，向其中加入Cy5.5溶液，混合均勻後避光振蕩，然後使用Sephadex? G_50樹脂柱分離，獲得標記有螢光染料的乳鐵蛋白。其中，所用乳鐵蛋白的碳酸氫鈉溶液濃度範圍為10mg/mL，Cy5.5溶液濃度範圍為20mg/mL，Cy5.5與乳鐵蛋白摩爾比為5: I。
[0102](3)製備活化的超順磁性共聚物納米凝膠:向步驟⑴獲得的濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液中加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺，其中，丙烯酸、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾比為1:1:1。振蕩後用磁鐵分離，並加入PH= 7.4、0.lmol/L的磷酸鹽緩衝液分散，獲得濃度為3% (質量/體積)的活化的超順磁性共聚物納米凝膠。
[0103](4)製備膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑:向步驟(3)獲得的活化的超順磁性共聚物納米凝膠中加入步驟(2)獲得的標記有螢光染料的乳鐵蛋白，其中，活化的超順磁性共聚物納米凝膠中鐵元素含量與標記有螢光染料的乳鐵蛋白中乳鐵蛋白含量的摩爾比為1: 0.5。室溫下反應過夜，用磁鐵分離，即得本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑。[0104]實施例7
[0105]一種磁共振成像對比劑及其製備
[0106]取N-異丙基丙烯醯胺、IOnm超順磁性四氧化三鐵納米粒、N, N』 -亞甲基雙丙稀醯胺、十二烷基硫酸鈉溶於去離子水中，攪拌並通入氮氣，加入過硫酸鉀和丙烯酸，在50-100°C反應4-8小時。其中，N-異丙基丙烯醯胺與丙烯酸的摩爾比為10: I。將反應物用去離子水透析去除未反應單體，冷凍乾燥獲得凍乾粉，即為偶聯前超順磁性共聚物納米凝膠。再用去離子水復溶，得到濃度為3% (質量/體積)的偶聯前超順磁性共聚物納米凝膠溶液，用於對照組實驗。
[0107]實施例8
[0108]膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的形貌及粒徑測定
[0109]將實施例2製備的對比劑利用透射電鏡表徵對其形貌和粒徑進行測定。將樣品稀釋50倍後滴加至銅網上，在200kV電壓下於透射電鏡(JEM-2010，日本電子公司)下觀察，結果(圖2)顯示本發明對比劑為球形，分散均一，粒徑為86.4±3.4nm。
[0110]實施例9 [0111]膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的水合半徑與粒徑分布測定
[0112]將實施例2製備的對比劑利用雷射粒度儀對其水合半徑和粒徑分布進行測定。將樣品稀釋20倍後於雷射粒度儀(ZetasizerNano ZS90,英國馬爾文公司)下測定，結果(圖3)顯示本發明對比劑的水合半徑為95.5 ±6.2nm，粒徑分布窄。
[0113]實施例10
[0114]膠質瘤祀向磁共振和突光雙模式成像對比劑的穩定性測定
[0115]將實施例2製備的對比劑利用雷射粒度儀對其穩定性進行測定。將樣品分散於生理環境模擬液中，稀釋10倍後在於室溫下靜置不同的時間，然後利用雷射粒度儀(Zetasizer Nano ZS90,英國馬爾文公司)測定其水合半徑來判斷其穩定性。結果(圖4)顯示對比劑在模擬生理環境的緩衝液中，穩定性良好，沒有發生團聚現象。
[0116]實施例11
[0117]膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的磁學性能測定
[0118]將實施例2和實施例7製備的對比劑利用振動樣品磁強計對其磁飽和強度和超順磁性進行測定。將凍幹的樣品粉末置于振動樣品磁強計(Model 7404，美國Lake ShoreCryotronics公司)中測定，結果(圖5)顯示本發明對比劑偶聯前後具有超順磁性，磁飽和強度分別為 67.9emu/g Fe 和 61.5emu/g Fe。
[0119]實施例12
[0120]膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的磁共振成像能力測定
[0121]將實施例2和實施例7製備的對比劑利用磁共振掃描儀對其磁共振成像能力進行測定。將樣品用水稀釋成不同濃度，加入96孔板中，利用磁共振掃描儀(GE 3.0T SignaHDxt磁共振成像系統，美國GE公司)測定不同濃度對比劑的成像能力。結果(圖6)顯示對比劑偶聯前後均具有良好的成像能力，隨著對比劑濃度增加，可以使磁共振信號值顯著降低。
[0122]實施例13
[0123]膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的弛豫率測定[0124]將實施例2和實施例7製備的對比劑利用磁共振掃描儀對其弛豫率進行測定。將樣品用水稀釋成不同濃度，加入96孔板中，利用磁共振掃描儀(GE 3.0T Signa HDxt磁共振成像系統，美國GE公司)測定不同濃度對比劑的T2值，然後計算對比劑的弛豫率(r2)。結果(圖7)顯示偶聯前後對比劑的弛豫率分別為142.7mM^s^和129.SmT1s'
[0125]實施例14
[0126]膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的螢光發射光譜測定
[0127]將實施例2和實施例7製備的對比劑利用螢光分光光度計對其螢光發射光譜進行測定。將樣品稀釋20倍，利用螢光分光光度計(FL4500，日本日立公司)測定螢光發射光譜。結果(圖8)顯示偶聯後對比劑具有與螢光染料標記乳鐵蛋白相似的發射峰，表明具有螢光，並證實了偶聯步驟。
[0128]實施例15
[0129]膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的螢光成像能力測定
[0130]將實施例2和實施例7製備的對比劑利用IVIS小動物成像系統對其螢光成像能力進行測定。將樣品稀釋成不同濃度，加入96孔板中，利用IVIS小動物成像系統(IVISLumina XR,美國Caliper Life Sciences公司)測定其突光成像能力。結果(圖9)顯示偶聯後的對比劑具有螢光成像的能力，隨著對比劑濃度增加，螢光信號強度顯著增大。
[0131]實施例16
[0132]膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑在膠質瘤大鼠體內磁共振成像能力測定
[0133]將實施例2和實施例7製備的對比劑利用磁共振掃描儀(GE 3.0T Signa HDxt磁共振成像系統，美國GE公司)對其在膠質瘤大鼠體內的磁共振成像能力進行測定。所用大鼠為雄性Wistar大鼠(湖北預防醫學科學院提供，體重200-300g)。在大鼠前因右偏3毫米，前偏I毫米的的位置將顱骨鑽開，利用立體定位儀將I X IO6個細胞注入該位置，約10天後瘤直徑達到(5_X5mm)用於動物實驗。大鼠腫瘤模型9隻，隨機分為3組，一組為空白組，尾靜脈注射生理鹽水；一組為實驗組，尾靜脈注射經生理鹽水稀釋的本發明對比劑，按照12mg Fe/kg體重注射；一組為對照組，尾靜脈注射相同劑量的偶聯前對比劑，分別在注射前和注射後2、6、12、24、48小時進行磁共振掃描。結果(圖10)顯示本發明對比劑注射前後，腫瘤區域磁共振信號隨時間明顯改變，在時間範圍內，隨時間延長信號值改變明顯，範圍增大。而對照實施例和生理鹽水組，腫瘤組織磁共振信號均無明顯改變。
[0134]實施例17
[0135]膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑在膠質瘤大鼠體內螢光成像測定
[0136]將實施例2和實施例7製備的對比劑利用IVIS小動物成像系統(IVIS Lumina XR,美國Caliper Life Sciences公司)對其在膠質瘤大鼠體內的突光成像能力進行測定。實驗動物模型的建立與實驗分組與實施例16中保持一致。結果(圖11)顯示本發明對比劑注射前後，腫瘤區域螢光信號明顯改變，腫瘤邊界清晰可見。而對照實施例和生理鹽水組，腫瘤組織磁共振信號均無明顯改變。
[0137]實施例18
[0138]對比劑注射後膠質瘤大鼠腦組織切片的組織病理分析(H&E染色)
[0139]大鼠處死後，取腦組織進行組織病理分析，H&E染色用於判定膠質瘤組織。結果(圖12)顯示注射發明所述對比劑後，切片區域為膠質瘤組織，切可見腫瘤與正常組織邊界，說明對比劑成像範圍精確。
[0140]實施例19
[0141]對比劑注射後膠質瘤大鼠腦組織切片的組織病理分析(普魯士藍染色)
[0142]大鼠處死後，取腦組織進行組織病理分析，普魯士藍染色用於證實鐵顆粒的存在。結果(圖12)顯示注射發明所述對比劑後，腫瘤組織中含有大量鐵顆粒，說明對比劑大量靶向進入到腫瘤組織中。而對照實施例組，僅能見少量鐵顆粒；而空白組未見鐵顆粒 。
【權利要求】
1.一種膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑，其特徵在於，它是超順磁性共聚物納米凝膠和標記有螢光染料的乳鐵蛋白的共價鍵結合物。
2.根據權利要求1所述的對比劑，其特徵在於，所述的超順磁性共聚物納米凝膠，是由丙烯醯胺類單體與帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體進行聚合反應形成共聚物納米凝膠，並在所述聚合反應過程中加入超順磁性鐵氧化物納米粒獲得的產物。
3.根據權利要求2所述的對比劑，其特徵在於，所述丙烯醯胺類單體是N-異丙基丙烯醯胺、N-(2-羥丙基)丙烯醯胺、聚丙烯醯嗎啉、N-(3-羥丙基)-丙烯醯胺、聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯、2-甲基丙烯醯氧基-乙基磷酸膽鹼、2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-二異丙氨基乙基甲基丙烯酸酯中的一種；優選N-異丙基丙烯醯胺、N-(2-羥丙基)丙烯醯胺或N-(3-羥丙基)-丙烯醯胺。
4.根據權利要求2所述的對比劑，其特徵在於，所述的帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體是丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯胺、聚2-乙烯基吡啶、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、磺胺嘧啶衍生物中的一種；優選丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸或甲基丙烯胺。
5.根據權利要求1所述的對比劑，其特徵在於，所述的標記有螢光染料的乳鐵蛋白，是螢光染料與乳鐵蛋白通過共價鍵結合獲得的產物。
6.根據權利要求2所述的對比劑，其特徵在於，所述的超順磁性鐵氧化物納米粒是粒徑為8-30nm的超順磁性三氧化二鐵納米粒或超順磁性四氧化三鐵納米粒；優選為10_20nm的超順磁性三氧化二鐵納米粒或超順磁性四氧化三鐵納米粒。
7.根據權利要求5所述的對比劑，其特徵在於，所述螢光染料為Cy系列螢光染料、異硫氰酸螢光素、羰花青染料熒 光染料DiR碘化物、羰花青染料螢光染料DiO高氯酸鹽中的一種，優選Cy系列螢光染料或羰花青染料螢光染料DiR碘化物。
8.根據權利要求7所述的對比劑，其特徵在於，所述的Cy系列螢光染料是Cy3、Cy5,Cy5.5 或 Cy7，優選 Cy5.5 或 Cy7。
9.一種膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑的製備方法，包括以下步驟:步驟一、製備超順磁性共聚物納米凝膠:取丙烯醯胺類單體、超順磁性氧化鐵納米粒、N, N』 -亞甲基雙丙稀醯胺、十二烷基硫酸鈉溶於去離子水中，攪拌並通入氮氣，加入過硫酸鉀和帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體，在50-100°C反應4-8小時，將反應物用去離子水透析去除未反應單體，冷凍乾燥獲得凍乾粉，即為超順磁性共聚物納米凝膠，再用去離子水復溶，得到濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液，其中，丙烯醯胺類單體與帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體的摩爾比為4: 1-40: 1，優選8: 1-20: I。步驟二、製備標記有滅光染料的乳鐵蛋白:取乳鐵蛋白溶於碳Ife氣納水溶液中，向其中加入螢光染料溶液，混合均勻後避光振蕩，然後使用Sephadex? G_50樹脂柱分離，獲得標記有螢光染料的乳鐵蛋白，其中，所用乳鐵蛋白的碳酸氫鈉溶液濃度範圍為0.05-50mg/mL,螢光染料溶液濃度範圍為l_50mg/mL，螢光染料與乳鐵蛋白摩爾比為0.3: 1-50: 1，優選2: 1-20: I。步驟三、製備活化的超順磁性共聚物納米凝膠:向步驟(1)獲得的濃度為3% (質量/體積)的超順磁性共聚物納米凝膠溶液中加入1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺，振蕩後用磁鐵分離，並加入pH = 7.4,0.lmol/L的磷酸鹽緩衝液分散，獲得濃度為3% (質量/體積)的活化的超順磁性共聚物納米凝膠，其中，帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀醯亞胺的摩爾比為1:1:1。步驟四、製備膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑:向步驟(3)獲得的活化的超順磁性共聚物納米凝膠中加入步驟(2)獲得的標記有螢光染料的乳鐵蛋白，室溫下反應過夜，用磁鐵分離，即得本發明膠質瘤靶向磁共振和螢光雙模式成像對比劑，其中，活化的超順磁性共聚物納米凝膠中鐵元素含量與標記有螢光染料的乳鐵蛋白中乳鐵蛋白含量的摩爾比為 1: 0.01-1: 1，優選 1: 0.1-1: 0.5。
10.根據權利要求9所述的製備方法，其特徵在於:步驟一中所述的丙烯醯胺類單體是N-異丙基丙烯醯胺、N-(2-羥丙基)丙烯醯胺、聚丙烯醯嗎啉、N-(3-羥丙基)-丙烯醯胺、聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸酯、2-甲基丙烯醯氧基-乙基磷酸膽鹼、2-二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯或2-二異丙氨基乙基甲基丙烯酸酯中的一種，優選N-異丙基丙烯醯胺、N-(2-羥丙基)丙烯醯胺、N-(3-羥丙基)_丙烯醯胺中的一種；步驟一中所述的帶有巰基或羧基或氨基的烯丙基類單體為丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸、甲基丙烯胺、聚2-乙烯基吡啶、甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯、磺胺嘧啶衍生物中的一種，優選丙烯酸、丙烯胺、甲基丙烯酸或甲基丙烯胺；步驟二中所述的超順磁性鐵氧化物納米粒是粒徑為8-30nm的超順磁性三氧化二鐵納米粒或超順磁性四氧化三鐵納米粒，優選粒徑為10-20nm的超順磁性三氧化二鐵納米粒或超順磁性四氧化三鐵納米粒；步驟二中所述的螢光染料為Cy系列螢光染料、異硫氰酸螢光素、羰花青染料螢光染料DiR碘化物、羰花青染料螢光染料DiO高氯酸鹽中的一種，優選Cy系列螢光染料或羰花青染料螢光染料DiR碘化物；所述的Cy系列螢光染料是Cy3、Cy5、Cy5.5或Cy7，優選Cy5.5、Cy7。
【文檔編號】A61K49/00GK103505746SQ201310220938
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年6月5日 優先權日:2013年6月5日
【發明者】趙彥兵, 江凌宇, 周慶, 朱豔紅, 楊祥良, 劉衛 申請人:華中科技大學