單鏈的多抗原結合性分子,其製備和用途的製作方法

2023-04-24 02:13:31

專利名稱：單鏈的多抗原結合性分子,其製備和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及單鏈的多抗原結合性分子，所述分子具有免疫球蛋白重鏈和輕鏈多變區，這些區域以VH-VL構建體的形式相互連接，它們又通過一種肽而連接在一起，本發明還涉及所述分子的製備及其作為藥物或診斷輔助物的用途。
識別兩種不同抗原，例如腫瘤細胞表面抗原和效應物分子的雙特異性抗體被廣泛用於實驗免疫療法中(Fanger等，免疫學評述，12,101-124(1992)；van de Winkel等，今日免疫學，18,562-564(1997))。由雙特異性抗體募集的效應物功能包括在體內天然存在的那些效應物分子，例如細胞毒性細胞和吞噬細胞，補體成分，細胞因子，溶栓酶和纖維蛋白溶酶，以及外源效應物分子，例如毒素、前體藥物轉化酶和放射性核素。因此，例如，在異種移植的腫瘤中注射針對Hodgkin腫瘤相關抗原CD30和T細胞抗原CD3和CD28的雙特異性抗體會導致細胞毒性T細胞的募集和刺激，並誘導殺腫瘤活性(Renner等，科學，264,833,1994)。在另一方法中，使用了針對CD30和鹼性磷酸酶的雙特異性抗體將酶募集至腫瘤位點，從而將無毒性的藥物前體轉變為有毒的藥物(Sahin等，癌症研究，50,6944-6948,1990)。
注射純化的雙特異性抗體的替代方法是由體外或體內轉染的細胞表達和分泌這些雙特異性抗體。此策略的優點是由經轉導細胞產生雙特異性抗體的過程發生在體內，因此無需在注射前費力地生產和純化雙特異性抗體。另外，有可能通過選擇適當的表達系統來控制雙特異性抗體在器官或腫瘤中局部表達或在全身表達。
通過例如化學交聯(Nisonoff等，自然，194,355,1962)可製備雙特異性抗體。動物來源的單克隆或多克隆抗體分子經化學交聯後，大部分可能失去活性，另外，還產生了異型二聚體和同型二聚體，必需通過複雜的過程將同型二聚體與所需的異型二聚體分開。僅可以通過相對費力的方法製備能產生雙特異性抗體的雜交瘤細胞(被稱為雜合雜交瘤)，因為其中需要將兩種不同的雜交瘤融合在一起(Milstein等，自然，305,537,1983)。功能性異型二聚體的比例相對較低，理論上僅為10％，因為兩種抗體分子的重鏈和輕鏈可以任何方式彼此結合。所用的起始物質主要包括鼠單克隆抗體，它對於人而言是有免疫原性的。
也可重組製備和在細菌或真核細胞中表達多種二價或雙特異性抗體分子(WO 93/06217)。所有重組抗體分子的共同點是可使用始於鼠和人的分子製備它們。已開發了多種方法以儘可能有效地製備雙特異性重組抗體分子。使用這些方法可製備多組分子。
在一組分子中，抗體的可變部分與免疫球蛋白的恆定區(Fc,CH3,CL)融合以達到二聚體化(Hu等，癌症研究，56,3055-3061(1994)；Hayden等，ther.Immunol,1,3-15(1994))。然而，在這種情況下，沒有對異型二聚體分子的選擇，使得以這種方法主要產生的是二價同型二聚體。另外，只有真核細胞能以功能形式表達這些分子。
在另一組分子中，抗體的可變部分與其它蛋白質的肽或蛋白質區域融合以製備二價或雙特異性分子(Pluckthun和Pack，免疫技術，3,83-105(1997))。在這種情況下，由於隨機結合，通常也會形成同型和異型二聚體。另外，這些分子含有一定比例(有時是相當大比例)的外源序列，因此估計有顯著的免疫原性。
在第三組分子中，對重組Fv片段，通常為單鏈Fv片段(scFv)的少量修飾被用於製備二價或雙特異性分子(Holliger和Winter,Curr.Opin.Biotechnol,4,446-449(1993))。這些修飾包括通過scFv鏈C末端額外的半胱氨酸進行二聚體化(MacCartney等，蛋白質工程，8,301-314(1994))。然而，這會導致同型和異型二聚體，並且，當在細菌細胞中表達時，將產生無功能的聚集體。可以在細菌和真核細胞中表達結構為scFv(A)-接頭-scFv(B)的串聯scFv分子(Mallender和Voss，生物化學雜誌，269,199-206,1994)。然而，有時也會出現四個可變區的無功能的結合。
最近幾年，重組抗體技術導致產生了一些新型的、小的二價或雙特異性抗體片段。這種類型分子的例子例如有「間體」(diabody)(Holliger等，美國國家科學院院報，90,6444-6448,1993)。這些分子含有免疫球蛋白的VH和VL可變區域，所述區域通過很短的接頭連接在一起。所述接頭非常短以致於不會導致單鏈Fv片段中會出現的一條鏈的VH和VL區域的結合。這意味著是兩條鏈的VH和VL區域結合形成二聚體，從而產生具有兩個結合位點的分子(Perisic等，結構，2,1217-1226,1994)。通過在一個細胞中表達結構為VH(A)-VL(B)和VH(B)-VL(A)的兩條鏈可產生雙特異性的「間體」。在這種情況下，VL指的是免疫球蛋白輕(L)鏈的可變(V)區，VH指的是免疫球蛋白重(H)鏈的可變區(V)，這些可變區可結合抗原(A)或(B)。VH部分與VL部分的結合產生了具有功能活性結合位點的異型二聚體片段。細菌表達的雙特異性「間體」已被成功用於募集多種效應物分子，免疫球蛋白，Clq或酶，或者效應細胞，如細胞毒性T淋巴細胞(Kontermann等，自然生物技術，15,629(1997)；Holliger等，蛋白質工程，9,299(1996)；自然生物技術，15,632(1997)；Zhu等，生物技術，14,192(1996)；FitzGerald等，蛋白質工程，10,1221(1997)；Krebs等，生物化學雜誌，273,2858(1998))。
然而，「間體」具有下列缺點由於VH(A)-VL(B)和VH(B)-VL(A)這兩條鏈在物理上不再連接在一起，故同等程度地產生同型和異型二聚體，這使得必需對異型二聚體進行很費力的純化過程。另外，也會出現二聚體解離現象，正如已在scFv片段中看到的那樣(Glockshuber等，生物化學，29,1362-1367(1990))。為了解決此問題，已開發了二硫鍵穩定化的「間體」(FitzGerald等，蛋白質工程，10,1221-1225,1997)或「球入穴(knobinto hole)間體」(Zhu等，蛋白質科學，6,781-788,1997)，然而，它們的製備相當複雜。另外，雙特異性「間體」的基因工程表達中每條鏈均需要信號序列和核糖體結合位點，這很難實現。另外，有可能表達非等摩爾量的可變區，這可增加無功能的同型二聚體的比例。
因此，本發明的目的是找出不具有所謂的「間體」的上述缺點，並可經簡單的方法以基本上均一的形式製備的多抗原結合性分子。
因此，本發明的一個方面是單鏈的多抗原結合性分子，所述分子含有下列組分a)具有第一特異性(A)的免疫球蛋白重鏈可變區(VH)及其功能性部分，b)具有第二特異性(B)的免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)及其功能性部分，c)具有特異性(B)的免疫球蛋白重鏈可變區(VH)及其功能性部分，和d)具有特異性(A)的免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)及其功能性部分。
其中VH和VL區域以VH-VL構建體或VL-VH構建體的形式連接，而這兩種VH-VL構建體經由肽(P)連接。
在另一個實施方案中，本發明的分子含有兩個以上所述的VH-VL構建體(如VH(B)-肽-VL(B))。這使得有可能得到含有幾種特異性(A)，(B),(C)等的分子。
在優選的實施方案中，各個VH-VL構建體經由其具有相同特異性的可變區結合在一起。本發明分子的特別優選的結構示於

圖1。
在另一個優選的實施方案中，所述的各種特異性實質上相同。本發明的術語「實質上相同」指的是區域的分子結構很有可能不同，但它們的特異性，即特異性結合抗原的功能仍保持不變。結果是本發明的分子不僅可含有一種免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的完整可變區，也可含有其功能性部分，即保留了其抗原結合特異性的部分。例如，本發明也包括人工構建體，所述構建體由免疫球蛋白可變區的各個CDR部分(「互補決定區」)組成(Jones,P.T等，自然，321,522,1986；Riechmann,L等，自然，332,323,1988；Verhoeyen,M等，科學，239,1534,1988)。
在一個優選實施方案中，通過肽接頭(L)以VH-L-VL構建體或VL-L-VH構建體的形式連接VH和VL區域。此時接頭一般應儘可能地短，優選約為1-20個胺基酸，尤其是約1-5個胺基酸長，特別優選序列為GGGGS的接頭。
與接頭(L)形成對照的是，連接肽(P)可具有任何適當的長度。然而，優選肽(P)具有約12-40個胺基酸，尤其是約12-20個胺基酸，特別是約14個胺基酸。特別優選的肽(P)含有胺基酸序列GGGGSGGRASGGGS或GGGGSGGRASGGGGS，尤其優選由所述胺基酸序列組成的肽(P)。
在另一個優選的實施方案中，本發明的分子含有效應物(E)作為另外的組分。所述效應物可直接，或適當時經由連接物(B)與本發明的分子連接。特別優選連接物(B)含有蛋白酶切割序列，尤其優選含有PSA(前列腺特異性抗原)、組織蛋白酶、纖溶酶原和/或纖溶酶原激活子切割序列。
蛋白酶切割序列是特別優選的，因為這使得可以通過使用蛋白酶而將效應物從本發明的分子上脫離下來。當效應物的活性因效應物直接地或通過連接物間接地與本發明的分子結合而受到抑制時，這種分離尤其有利。
由於蛋白酶特別地存在於炎症區或腫瘤中，效應物，優選因通過蛋白酶切割序列與本發明的分子結合而被滅活的效應物，在此得到了廣泛的局部釋放。另外，通過選擇本發明分子的適當靶結構，例如對腫瘤細胞上的抗原，腫瘤相關內皮細胞上的抗原或者炎症細胞如淋巴細胞或巨噬細胞上的抗原具有特異性的靶結構，也可能使本發明的分子與效應物累積於諸如炎症或腫瘤區域中。
根據本發明，本發明的分子也可以直接或間接地與幾種效應物結合。
蛋白酶或相關切割序列詳細描述於例如DE1970430.1中。
圖2圖示了本發明優選分子的一個例子，其具有通過連接物而與該分子結合的效應物。
對本發明分子中各個組分的選擇一般取決於應用領域。
如果本發明的分子將被用作診斷輔助物，那麼，例如在另外的實施方案中，第一特異性(A)針對的是待分析的分子，第二特異性(B)直接或間接針對分析物。分析物可以是例如放射性分子、螢光分子或者通過其酶活性而將分析物前體轉變為活性分析物的酶。
在另一個優選實施方案中，第一特異性(A)針對待分析的分子，第二特異性(B)針對待分析的另一分子，而效應物(E)是一種分析物，例如放射性分子、螢光分子和/或已在上文詳細說明的一種酶。
然而，本發明的分子也可用作病毒或非病毒載體之靶細胞特異性結合的配體。在一個優選實施方案中，本發明的分子也可用作所謂的多功能配體。如果肽(P)和/或效應物(E)含有融合肽，則對於此目的是有利的。可將多功能配體用於核苷酸序列的靶細胞特異性轉移，它一般是一種含有靶細胞特異性配體、基因構建體特異性配體和融合肽的蛋白質。可使用這種類型的多功能配體使基因構建體(即核酸構建體)與靶細胞特異性結合，而融合肽可使該核酸構建體有可能穿過細胞膜滲透至細胞核內，從而也從內體中釋放出來。
將本發明的分子用作載體的配體或用作多功能配體時，第一特異性(A)針對靶細胞、第二特異性(B)針對載體是有利的。載體一般是核酸、陽離子肽或蛋白質、陽離子脂質、陽離子肽或陽離子卟啉。在本發明的一個具體實施方案中，載體是得自例如腺病毒(AdV)，腺相關病毒(AAV)、痘苗病毒、RSV、HSV、流感病毒或慢病毒的病毒載體。
靶細胞上膜結構的靶細胞特異性配體，衍生自免疫球蛋白(即含有VH和VL區域)的靶細胞特異性配體和基因構建體特異性配體，以及具有融合特性的肽的例子詳細描述於DE19649645.4。
本發明的分子也適用於預防和/或用作治療劑。
為了這些目的，例如，第一特異性(A)可以是針對細胞膜，如淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞、粒細胞、造血細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、橫紋肌細胞、上皮細胞、肝細胞、腎細胞、膠質細胞、支持組織的細胞、腫瘤細胞或白血病細胞的細胞膜，或者是針對胞外基質、補體系統、凝結系統、激肽系統、血漿、支持組織的蛋白質，或者是針對細胞因子或趨化因子，或者針對內源或外源毒素，或者針對如毛地黃之類的藥物，和/或針對病原體如細菌、病毒和/或寄生蟲病原體。
第二特異性(B)例如可針對諸如淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞或粒細胞的細胞膜，結果是它與靶結構的交聯可在該處導致細胞毒性、免疫調節或炎症過程。
它也可針對細胞因子、趨化因子或生長因子，結果是它與靶結構的交聯可在該處誘導免疫調節或增殖過程。它也可針對補體系統的蛋白質，所述蛋白質可啟動、增強或抑制補體系統的激活。取決於對蛋白質的選擇，這種類型的蛋白質與靶結構的交聯可在該處誘導炎性和細胞裂解反應或者抗炎性反應和細胞保護性反應。它也可以針對凝結系統的蛋白質，所述蛋白質可啟動、增強或抑制凝結系統的激活。取決於對蛋白質的選擇，這種類型的蛋白質與靶結構的交聯可誘導或防止血栓形成。另外，它也可以針對可導致靶結構上血纖蛋白塊溶解的纖溶蛋白，針對能將靶結構上無活性的藥物前體轉變為有活性(例如有細胞毒性)的藥物的酶，針對肽激素或類固醇激素，針對免疫球蛋白的恆定部分，針對介體，如組胺、5-羥色胺、白三烯、前列環素或激肽，針對病原體，如細菌、病毒和/或寄生蟲病原體，或針對腫瘤細胞。
細胞因子作為靶結構，或者單核細胞、巨噬細胞和/或淋巴細胞作為靶結構可被具有感染或腫瘤抗原的本發明分子交聯，從而在體內誘導針對該抗原的有所增強的免疫應答。在此方面，在本發明的分子中加入病原體或腫瘤的特定抗原，在適當時也加入細胞因子，並局部施用或注射該交聯複合物是有利的。
第二特異性(B)也可針對內源或外源毒素以使靶結構上可發生毒素的中和作用和吞噬作用或者發生毒性反應。另外，它還可針對如毛地黃之類的藥物以造成藥物的絡合和消除。
在另一個優選的實施方案中，具有效應物的本發明分子允許兩個相同或不同的靶結構與一個或多個效應物交聯。
適當效應物的例子是跨膜區域，糖磷脂錨，受體的與配體結合的部分；受體的配體或配體的與受體結合的部分；肽激素；細胞因子；生長因子；生長因子抑制劑；趨化因子；幹擾素；介體；對循環起作用的肽；將藥物的無活性前體轉變為有活性藥物的酶；激活或抑制凝結作用的蛋白質；激活或抑制纖溶作用的蛋白質；激活或抑制補體系統的蛋白質；免疫球蛋白的一個或多個恆定區；細胞毒性肽，另一種單鏈的單或多抗原(尤其是雙抗原)結合分子；腫瘤抗原或病原體抗原，如細菌抗原或病毒抗原；含有半胱氨酸以產生本發明分子之二聚體的肽；和/或二聚體化或多聚體化的肽(Pluckthun和Pack，免疫技術，3,83-105(1997))。
本發明的另一方面是編碼本發明分子的核酸。該核酸一般為DNA或RNA，優選為雙鏈DNA。
為了分泌本發明的表達產物(這在適當時是需要的)，本發明的核酸在其5』末端含有編碼信號或跨膜序列的核苷酸序列(例見DE19639103.2或DE 19651443.6)。適當信號或跨膜序列的一個例子是免疫球蛋白的信號序列(DNA位置≤63至≥107),CEA的信號序列(DNA位置≤33至≥134)，或人呼吸道合胞病毒糖蛋白的信號序列(胺基酸序列≤38至≥50或48至65的cDNA)。
在另一個實施方案中，本發明的核酸在其5』末端含有啟動子和/或激活子(activator)。優選激活子可被細胞特異性地、細胞周期特異性地、代謝特異性地和/或被藥物激活或抑制。這種類型的激活子序列(包括其組合)被描述於EP97101507.8,DE19617851.7,DE19639103.2,DE19651443.6,DE19704301.1,EP97102547.3和DE19710643.9。本發明特別優選的核酸構建體示於圖3和4。
在一個優選實施方案中，本發明的核酸在其起始密碼子5』末端含有序列GCCACC或GCCGCC，這有可能導致翻譯的增強。
本發明的另一實施方案涉及含有本發明核酸的載體。在這種情況下，載體可以是病毒或非病毒載體，優選為非病毒載體，尤其是選自陽離子脂質、陽離子聚合物、陽離子肽或陽離子卟啉的非病毒載體。
為了製備本發明的分子，將所述核酸克隆至表達載體，例如適當的質粒中，並導入適當的細胞，例如細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞中，培養以此方式轉化或轉染的細胞，並在適當時分離表達產物。方法一般是本領域技術人員已知的，詳細描述於例如Sambrook J等，分子克隆，實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，1989。
在本發明一個特別優選的實施方案中，這些細胞表達具有效應物的本發明分子，該效應物優選為一種跨膜區。
因此，例如，編碼人巨噬細胞集落刺激因子之跨膜序列的DNA序列(DNA位置≤1485至≥1554)或編碼人呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白G之信號和跨膜區(胺基酸1至63，或其部分序列胺基酸38至63)的DNA序列或編碼流感病毒神經氨酸酶之信號和跨膜區(胺基酸7至35，或部分序列胺基酸7至27)的DNA序列可被插入到啟動子序列和本發明分子之DNA序列之間或該基因的3』末端。
然而，為了將藥物錨定在表達本發明分子之細胞的細胞膜內，也可以將編碼糖磷脂錨的核苷酸序列插入到核酸構建體中。
糖磷脂錨的插入一般是在編碼本發明分子之核苷酸序列的3』末端，並且可與信號序列的插入同時發生。
已描述了例如CEA、N-CAM和其它膜蛋白如Thy-1的糖磷脂錨。
由於存在這種跨膜區，該特定細胞在細胞膜上表達本發明的分子，因此獲得了特異於靶或效應物結構的「受體」，所述結構由本發明分子中與抗原結合的部分所識別。
另一種優選的受體是受體(例如T細胞受體或M-CSF受體)的跨膜或信號轉導區域。這使得在細胞膜上表達本發明分子的細胞有可能被靶結構與特異性功能的結合所激活。這種類型的特異性功能可以是例如T淋巴細胞的細胞毒性反應，巨噬細胞和粒細胞的吞噬反應，或者粒細胞、單核細胞和巨噬細胞的胞吐反應。
因此，本發明的另一方面是含有本發明核酸或本發明載體的細胞，尤其是細菌、昆蟲、酵母或哺乳動物細胞。除了通常已知的可用於表達核酸的細胞(例如CHO或BHK細胞)外，適當的哺乳動物細胞也可以是淋巴細胞，巨噬細胞，膠質細胞，上皮細胞，肝細胞，腎細胞，骨髓細胞，內皮細胞，平滑肌或橫紋肌細胞或者成纖維細胞。
最後提及的細胞特別適用於基因治療應用，因為含有本發明核酸構建體的這些細胞可被局部或非腸道地(如靜脈內、動脈內)注射到體腔、器官內，或者皮下注射入患者體內以預防或治療疾病。
然而，為了通過基因療法治療疾病，也可將本發明的核酸構建體經皮下或肌內局部直接施用於患者體腔、器官、循環系統內。
因此，本發明的另一方面是含有本發明分子、本發明核酸、本發明載體或本發明細胞的藥物，以及含有本發明分子的診斷輔助物，所述分子也針對上文已詳細描述的分析物。
因此，本發明分子、本發明核酸、本發明載體或本發明細胞適用於治療、預防或診斷諸如癌症，自身免疫疾病，炎性疾病，血液病，尤其是血液凝結和/或循環系統疾病，神經系統疾病和/或傳染病。
在此方面，對各個組分的選擇一般取決於本發明項目的用途。下文一般性地和以舉例方式詳細描述了各個組分及其用途為了製備本發明的項目，如圖3和4中的例子所說明，可以將本發明核酸構建體的5』末端與編碼信號序列的核酸的3』末端連接，再將後者的5』末端與啟動子序列的3』末端連接。
選定的啟動子序列包括例如能無限制地激活的啟動子和激活子序列，如RNA聚合酶Ⅲ的啟動子，RNA聚合酶Ⅱ的啟動子，CMV啟動子和/或增強子，SV40啟動子；或病毒啟動子和激活子序列，如HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV、HIV等的啟動子和激活子序列。
使用HIV啟動子時，優選將包括TAR序列的完整LTR序列[位置≤-453至≥-80,Rosen等，細胞，41,813(1985)]用作病毒特異性啟動子。
可選的其它啟動子序列是例如能被代謝地激活的啟動子和增強子序列，如能被低氧誘導的增強子，能被細胞周期特異性地激活的啟動子，如cdc25C基因、cdc25B基因，細胞周期蛋白A基因、cdc2基因、B-myb基因、DHFR基因或E2F-1基因的啟動子，或者細胞周期特異性地出現或被激活的轉錄因子的結合序列。這些結合序列包括例如c-myc蛋白的結合序列。被稱為Myc E-Box的核苷酸序列[5』-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3』]的單體或多體也包括在這些結合序列中。
可選的其它啟動子序列是例如能被四環素激活的啟動子，如與相應的阻抑子聯合的四環素操縱基因，或嵌合啟動子。嵌合啟動子是位於上遊的、能被細胞特異性地、代謝或病毒特異性地激活的激活子序列與位於下遊、並含有CDE-CHR或E2FBS-CHR核苷酸序列的啟動子元件的聯合，在細胞周期G0和G1期，抑制蛋白與之結合從而抑制位於上遊的激活子序列的激活(WO96/06943；Lucibello等，EMBO J,14,132(1995))。
可選的其它啟動子序列是例如能被細胞特異性地激活的啟動子，優選例如得自編碼優選在選定細胞中產生的蛋白質之基因的啟動子或增強子的啟動子或激活子序列。
例如，為本發明目的，在下述細胞中優選使用下列蛋白質的啟動子在內皮細胞中被激活的啟動子和激活子序列是編碼例如下列蛋白質的基因的基因調節序列腦特異性內皮細胞葡萄糖1轉運蛋白，endoglin,VEFG受體1(flt-1),VEFG受體2(flk-1,KDR),til-1或til-2,B61受體(Eck受體)，B61，內皮素，尤其是內皮素B或內皮素1，內皮素受體，尤其是內皮素B受體，甘露糖-6-磷酸受體，vonWillebrand受體，IL-1α,IL-1β,IL-1受體，血管細胞粘著分子(VCAM-1)或合成的、由在內皮細胞中優先或選擇性地具有活性之轉錄因子的寡聚化結合位點組成的激活子序列。一個例子是轉錄因子GATA-2，它在內皮素1基因中的結合位點是5』-TTATCT-3』。
在與已被激活的內皮細胞相鄰的細胞中被激活的啟動子或激活子序列是編碼例如下列蛋白質的基因的基因調節序列VEGF，此時VEGF基因的基因調節序列是5』側翼區，3』側翼區，c-Src基因或v-Src基因，或類固醇激素受體；以及它們的啟動子元件，尤其是小鼠乳腺腫瘤病毒啟動子。
在肌肉細胞，尤其是平滑肌細胞中被激活的啟動子或激活子序列是編碼例如下列蛋白質的基因的基因調節序列原肌球蛋白，α-肌動蛋白，α-肌球蛋白，PDGF受體，FGF受體，MRF-4，果糖磷酸激酶A，磷酸甘油酸變位酶，肌鈣蛋白C，肌漿蛋白，內皮素A受體，結蛋白，VEGF(見上文)，「人工」啟動子或肌肉特異性轉錄因子的啟動子，所述轉錄因子如螺旋-環-螺旋(HLH)家族的因子(MyoD,Myf-5，肌漿蛋白，MRF4)或鋅指蛋白GATA-4。
不僅肌肉特異性基因的啟動子可使HLH蛋白和GATA-4顯示出肌肉特異性轉錄，異源啟動子也可使上述蛋白質顯示出肌肉特異性轉錄，因此人工啟動子也可做到這一點。這種類型的人工啟動子的例子是肌肉特異性HLH蛋白的多拷貝(DNA)結合位點，如E盒(MyoD)(例如4×AGCAGGTGTTGGGAGGC)或α-肌球蛋白重鏈基因的GATA-4多拷貝DNA結合位點(如5』-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3』)。
在膠質細胞中被激活的啟動子和激活子序列是例如來自編碼下列蛋白質的基因的基因調節序列Schwann細胞特異性蛋白質periaxin，穀氨醯胺合成酶，膠質細胞特異性蛋白質(膠質原纖維酸性蛋白質=GFAP)，膠質細胞蛋白質S100b,IL-6,CNTF,5-HT受體，TNFα,IL-10,胰島素樣生長因子受體Ⅰ和Ⅱ或VEGF(見上文)。
在血液形成細胞中被激活的啟動子和激活子序列是例如在血液形成細胞或相鄰細胞(如基質)中表達的細胞因子或其受體的基因的啟動子序列。
這些啟動子序列包括編碼例如下列細胞因子及其受體之基因的啟動子序列幹細胞因子受體，幹細胞因子，IL-1α,IL-1受體，IL-3,IL-3受體(α亞基)，IL-3受體(β亞基)，IL-6,IL-6受體，GM-CSF,GM-CSF受體(α鏈)，幹擾素調節因子1(IRF-1)(IL-6激活IRF-1啟動子的水平與IFNγ或IFNβ激活IRF-1啟動子的水平相同)，促紅細胞生成素或促紅細胞生成素受體。
在淋巴細胞和/或巨噬細胞中被激活的啟動子和激活子序列是例如編碼諸如下列細胞因子、細胞因子受體和粘附分子及抗體Fc片段受體之類的基因的啟動子和激活子序列IL-1受體，IL-1α,IL-1β,IL-2,IL-2受體，IL-3,IL-3受體(α亞基)，IL-3受體(β亞基)，IL-4,IL-4受體，IL-5,IL-6,IL-6受體，幹擾素調節因子1(IRF-1)(IL-6激活IRF-1啟動子的水平與IFNγ或IFNβ激活IRF-1啟動子的水平相同)，IFNγ反應性啟動子，IL-7,IL-8,IL-10,IL-11,IFNγ,GM-CSF,GM-CSF受體(α鏈)，IL-13,LIF，巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)受體，Ⅰ型和Ⅱ型巨噬細胞清除受體，MAC-1(白細胞功能相關抗原)，LFA-1α(白細胞功能相關抗原)或p150,95(白細胞功能相關抗原)。
在滑膜細胞中被激活的啟動子和激活子序列例如是編碼諸如下列基質金屬蛋白酶(MMP)之類的基因的啟動子序列MMP-1(間質膠原酶)，MMP-3(溶基質素/transin)或金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP)，如TIMP-1,TIMP-2,TIMP-3。
在白血病細胞中被激活的啟動子和激活子序列是例如編碼下列蛋白質的基因的啟動子HSP-70,bcl-1/細胞周期蛋白D-1,bcl-2,IL-6,IL-10,TNFα,TNFβ,HOX-11,BCR-Abl,E2A-PBX-1,PML-RAR(早幼粒細胞白血病視黃酸受體)或c-myc，其中c-myc蛋白結合併激活被稱為Myc E盒的核苷酸序列(5』-GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3』)的多體。
在腫瘤細胞中被激活的啟動子和激活子序列是例如基因調節核苷酸序列，所述序列與在腫瘤細胞中形成的或具有活性的轉錄因子可相互作用。
為了本發明的目的，優選的啟動子或激活子序列包括編碼特別地產生於癌細胞或肉瘤細胞中之蛋白質的基因的基因調節序列或元件。因此，優選用於小細胞支氣管癌中的是N-CAM蛋白啟動子，用於卵巢癌中的是肝炎生長因子受體或L-絲束蛋白的啟動子，用於胰腺癌中的是L-絲束蛋白或多形上皮粘蛋白(PEM)的啟動子。
本發明一個相當大的優點在於各個組分的連接有利於異型二聚體化結合，從而大量形成單鏈的多抗原結合性分子。二聚體的解離現象也有所減少，scFv片段已顯示出這一點(例見Glockshuber等，生物化學，29,1362-1367,1990)，因此，相對於所謂的「間體」而言，可以較簡便地並以更均一的形式製備本發明的分子，即便是前者為二硫鍵穩定化的或「球入穴」的形式也是如此。
另外，製備本發明的分子僅需要一個信號序列和一個核糖體結合位點(RBS)，與之形成對照的是在本發明的「間體」中每條鏈都需要信號序列和RBS。本發明的另一個優點是，就本發明的分子，表達的是等摩爾量的可變區，而至於「間體」的兩條鏈的表達，可能是以非等摩爾量進行的，因此後者中無功能的同型二聚體的比例有所增加。
本發明分子的另一優點是可以在細菌和酵母、杆狀病毒和真核細胞中簡單地並以功能形式表達本發明的分子。另外，除了對本發明的分子進行分泌表達外，也可以將它們表達在細胞內或與膜聯合的形式(例見Biocca Cattaneo，細胞生物學動態，5,248-252(1995))。
本發明分子的另一優點是它們象雙特異性抗體一樣，可以廣泛用作診斷輔助物以及預防和/或治療疾病的藥物。
選擇效應物基因和啟動子序列應考慮所需的用途和欲轉導的靶細胞。例如，就下列疾病，可選擇的啟動子序列和效應物基因的組合如下所述腫瘤治療腫瘤治療的靶細胞是例如增殖中的內皮細胞，或與內皮細胞相鄰的基質細胞和肌肉細胞，或者腫瘤細胞或白血病細胞，所用啟動子是例如內皮細胞特異性和細胞周期特異性啟動子，或細胞非特異性或肌肉細胞特異性和細胞周期特異性啟動子，或腫瘤細胞特異性(實體腫瘤，白血病)和細胞周期特異性啟動子，所用效應物是例如下列基因細胞增殖抑制劑基因是例如成視網膜細胞瘤蛋白(pRb=p110)或相關的p107和p130蛋白的基因。成視網膜細胞瘤蛋白(pRb/p110)和相關的p107和p130蛋白可通過磷酸化而失活。應優選使用的細胞周期抑制劑基因是在所表達蛋白質的失活位點具有突變、而其功能未因此受損害的那些基因。已描述了p110中這些突變的例子。p107蛋白或p130蛋白的DNA序列可以類似的方式突變。p53蛋白的基因也是合適的。p53蛋白在細胞中或者通過與特定蛋白質(如MDM2)結合而失活，或者通過經由去磷酸化的C-末端絲氨酸使p53寡聚體化而失活。因此，最好使用C末端截短至絲氨酸392的p53蛋白的DNA序列。其它的合適基因是p21(WAF-1)、p16蛋白、其它cdk抑制劑、GADD45蛋白或bak蛋白的基因。
凝結誘導因子和血管生成抑制劑的基因是例如纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1),PAI-2,PAI-3，制管張素，幹擾素(IFNα,IFNβ或IFNγ)，血小板因子4,IL-12,TIMP-1,TIMP-2,TIMP-3，白血病抑制因子(LIF)或組織因子(TF)及其促進凝結的片斷的基因。
細胞靜止蛋白和細胞毒性蛋白的基因是例如穿孔素，粒酶，IL-2,IL-4,IL-12，如IFNα、IFNβ或IFNγ之類的幹擾素，如TNFα或TNFβ之類的TNF，制癌蛋白M，鞘磷脂酶或爪蟾抗菌肽和爪蟾抗菌肽衍生物的基因。
炎症誘導物的基因是例如下列物質的基因IL-1,IL-2,RANTES(MCP-2)，單核細胞趨化和激活因子(MCAF),IL-8，巨噬細胞炎症蛋白1(MIP-1α,-β)，嗜中性白細胞活化蛋白-2(NAP-2),IL-3,IL-5，人白血病抑制因子(LIF),IL-7,IL-11,IL-13,GM-CSF,G-CSF,M-CSF,在功能上相當於人補體因子C3b的眼鏡蛇毒因子(CVF)或CVF的部分序列(即它能與補體因子B結合，經D因子切割後，代表一種C3轉變酶)，人補體因子C3或其部分序列C3b(C3b是人補體因子C3的切割產物，它在功能和結構上與CVF相似)，或者能激活補體或誘導炎症的細菌蛋白質，例如鼠傷寒沙門氏菌的孔蛋白，金黃色葡萄球菌的聚集因子，革蘭氏陰性細菌所特有的調節蛋白(modulin)，軍團菌或乙型流感嗜血桿菌或克雷伯氏桿菌的主要外膜蛋白，或G類鏈球菌的M分子。
激活細胞靜止因子前體的酶的基因是例如將無活性的前體(前體藥物)裂解為有活性的細胞靜止因子(藥物)的酶。這種類型的物質以及與它們中的每一個相關的前體藥物和藥物已由Deonarain等人(英國癌症雜誌，70,786(1994)),Mullen(藥物療法，63,199(1994))和Harris等人(基因療法，1,170(1994))進行了評述。例如，可使用下列酶之一的DNA序列單純皰疹病毒胸苷激酶，水痘帶狀疤疹病毒胸苷激酶，細菌硝基還原酶，細菌β-葡糖醛酸糖苷酶，得自黑麥的植物β-葡糖醛酸糖苷酶，人β-葡糖醛酸酶，人羧肽酶(CB)，例如肥大細胞CB-A、胰腺CB-B或細菌羧肽酶，細菌β-內醯胺酶，細菌胞嘧啶脫氨酶，人過氧化氫酶或過氧化物酶，磷酸酶，尤其是人鹼性磷酸酶，人前列腺酸性磷酸酶或5型酸性磷酸酶，氧化酶，尤其是人賴氨醯氧化酶或人D-胺基酸氧化酶，尤其是人穀胱甘肽過氧化物酶，人嗜酸性粒細胞過氧化物酶或人甲狀腺過氧化物酶，β-半乳糖苷酶或α-半乳糖苷酶。將前體藥物道諾黴素β-D-半乳糖吡喃糖苷轉變為細胞靜止因子道諾黴素(daunomycin)時特別優選β-半乳糖苷酶。自身免疫疾病和炎症的治療自身免疫疾病和炎症治療的靶細胞是例如增殖中的內皮細胞或巨噬細胞和/或淋巴細胞或滑膜細胞，所用啟動子是例如內皮細胞特異性和細胞周期特異性啟動子，或巨噬細胞和/或淋巴細胞特異性和/或細胞周期特異性啟動子，或滑膜細胞特異性和/或細胞周期特異性的啟動子，所用效應物是例如下列基因用於變態反應治療的基因是例如IFNβ,IFNγ,IL-10，針對IL-4的抗體或抗體片斷，可溶性的IL-4受體，IL-12或TGFβ的基因。
用於預防移植器官排斥反應的基因是例如IL-10,TGFβ，可溶性的IL-1受體，可溶性的IL-2受體，IL-1受體拮抗劑或可溶性IL-6受體的基因。
用於抗體介導的自身免疫疾病的治療的基因是例如TGFβ,IFNα,IFNβ,IFNγ,IL-12，可溶性IL-4受體，可溶性IL-6受體，免疫抑制劑抗體或其含有VH和VL的片斷的基因。
用於細胞介導的自身免疫疾病的治療的基因是例如IL-6,IL-9,IL-10,IL-13,TNFα或TNFβ,IL-13，免疫抑制劑抗體或其含有VH和VL的片斷的基因。
上文已詳細描述了細胞增殖抑制劑、細胞靜止蛋白或細胞毒性蛋白和可激活細胞靜止因子前體的酶的基因。
用於關節炎治療的基因是例如所表達的蛋白質能直接或間接地抑制如關節中的炎症和/或促進關節中胞外基質(軟骨，結締組織)的重建的結構基因。
這些結構基因包括例如下述的基因IL-1受體拮抗劑(IL-1-RA)，因為IL-1-RA能抑制IL-1α,β的形成；可溶性的IL-1受體，因為可溶性的IL-1受體能與IL-1結合併使其失活；IL-6，因為IL-6可使滑膜細胞和軟骨細胞增加TIMP和超氧化物的分泌並減少IL-1和TNFα的分泌；可溶性TNF受體，因為可溶性TNF受體能與TNF結合併使其失活；IL-4，因為IL-4抑制IL-1,TNFα和MMP的形成和分泌；IL-10，因為IL-10抑制IL-1,TNFα和MMP的形成和分泌，並增加TIMP的分泌；胰島素樣生長因子(IGF-1)，因為IGF-1刺激胞外基質的合成；TGFβ，尤其是TGFβ1和TGFβ2，因為TGFβ刺激胞外基質的合成；超氧化物歧化酶或TIMP，尤其是TIMP-1、TIMP-2或TIMP-3。血液形成系統的治療血液細胞形成缺陷之治療的靶細胞是例如血液形成系統的增殖中的未成熟細胞或與血液形成細胞相鄰的基質細胞；所用啟動子是例如血液形成細胞特異性和/或細胞周期特異性啟動子或細胞非特異性和細胞周期特異性的啟動子，所用效應物是例如下列基因用於貧血症治療的基因是例如促紅細胞生成素的基因。
用於白細胞減少症治療的基因是例如G-CSF,GM-CSF或M-CSF的基因。
用於血小板減少症治療的基因是例如IL-3，白血病抑制因子(LIF),IL-11或血小板生成素的基因。神經系統治療對神經系統損傷的治療的靶細胞是例如膠質細胞或增殖中的內皮細胞，所用啟動子是例如膠質細胞特異性和細胞周期特異性啟動子或內皮細胞特異性和細胞周期特異性啟動子，或細胞非特異性和細胞周期特異性啟動子，所用效應物是例如下列基因神經元生長因子的基因是例如FGF，神經生長因子(NGF)，腦衍生神經營養因子(BDNF)，神經營養蛋白-3(NT-3)，神經營養蛋白-4(NT-4)或睫狀神經營養因子(CNTF)的基因。
酶的基因是例如酪氨酸羥化酶或多巴脫羧酶的基因。
細胞因子及其抑制或中和TNFα之神經毒性作用的抑制劑的基因是例如編碼下述的基因TGFβ；可溶性TNF受體，因為TNF受體可中和TNFα；IL-10，因為IL-10可抑制IFNγ、TNFα、IL-2和IL-4的形成；可溶性IL-1受體，如IL-1受體Ⅰ或IL-1受體Ⅱ，因為可溶性IL-1受體能中和IL-1的活性；IL-1受體拮抗劑或可溶性IL-6受體。血液凝結和循環系統的治療血液凝結和循環系統障礙的治療的靶細胞是例如內皮細胞，增殖中的內皮細胞，與內皮細胞和平滑肌細胞相鄰的體細胞；或巨噬細胞，所用啟動子是例如細胞非特異性和細胞周期特異性啟動子，或者內皮細胞、平滑肌細胞或巨噬細胞特異性和細胞周期特異性啟動子；所用效應物是例如下列基因用於抑制凝結或促進纖溶的基因是例如組織纖溶酶原激活物(tPA)，尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA),tPA和uPA的雜合體，C蛋白，水蛭素，絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)，如C-1S抑制劑，α1-抗胰蛋白酶或抗凝血酶Ⅲ，或組織因子途徑抑制劑(TFPI)的基因。
用於促進凝結的基因是例如F Ⅷ,F Ⅸ,von Willebrand因子，F ⅩⅢ,PAI-1,PAI-2或組織因子及其片斷的基因。
血管生成因子的基因是例如VEGF或FGF的基因。
用於降低血壓的基因是例如激肽釋放酶或內皮細胞「氧化氮合酶」的基因。
用於抑制內皮細胞層受傷後的平滑肌細胞增殖的基因是例如抗增殖性、細胞靜止性或細胞毒性蛋白的基因，或上文所述的將細胞靜止因子的前體裂解為細胞靜止因子的酶的基因，或這些藥物之一與配體(如特異於肌肉細胞的抗體或抗體片斷)的融合蛋白的基因。
其它血漿蛋白的基因是例如白蛋白、C1滅活劑、血清膽鹼酯酶、運鐵蛋白或1-抗胰蛋白酶的基因。預防和/或治療傳染病用於接種的靶細胞是例如肌肉細胞或巨噬細胞和/或淋巴細胞，所用啟動子是例如非特異性和細胞周期特異性啟動子，或靶細胞特異性和細胞周期特異性啟動子，所用效應物是例如可用於預防傳染病的基因。
選定的活性物質一般是蛋白質的DNA，所述蛋白質是由病原體產生的，並且通過注射可引起免疫應答，即通過抗體結合和/或通過細胞毒性T淋巴細胞可導致病原體被中和和/或殺死。這種類型的所謂中和性抗原已被用作疫苗抗原(例見Ellis，高等實驗醫學生物學(Adv.Exp.Med.Biol.),327,263(1992))。
本發明優選編碼下列病原體之中和性抗原的核酸甲型流感病毒，HIV，狂犬病毒，HSV(單純皰疹病毒)，RSV(呼吸道合胞病毒)，副流感病毒，輪狀病毒，VZV(水痘帶狀皰疹病毒)，CMV(巨細胞病毒)，麻疹病毒，HPV(人乳頭狀瘤病毒)，HBV(B型肝炎病毒)，HCV(C型肝炎病毒)，HDV(丁型肝炎病毒)，HEV(戊型肝炎病毒)，HAV(A型肝炎病毒)，霍亂弧菌抗原，布氏疏螺旋體，幽門螺桿菌或瘧疾抗原。
用於本發明的這種類型的活性物質也包括抗獨特型抗體或其與抗原結合之片段的DNA，所述抗體的結合抗原的結構(互補決定區)代表病原體的中和性抗原的多拷貝蛋白質或糖類結構(見上文)。
這種類型的抗獨特型抗體及其裂解產物可特別地代替細菌病原體的糖類抗原，Hawkins等人(免疫療法雜誌，14,273(1993))和Westerink和Apicella(Springer Seminars in Immunopathol,15,227(1993))對此進行了綜述。
其它效應物的例子是「腫瘤疫苗」的基因，它們包括腫瘤細胞上的抗原，Sedlacek等(腫瘤學成就，32,Karger Verlag,Munich(1988)和腫瘤學成就，43,Karger Verlag,Munich(1992))對此也進行了綜述。
其它例子是下列抗原或下列抗獨特型抗體的基因sialyl-Lewis；腫瘤上由T細胞識別的肽；癌基因表達的蛋白質；血型抗原及其前體；多形上皮粘蛋白上的抗原；或熱激蛋白上的抗原。
慢性傳染病治療的靶細胞是例如肝細胞,淋巴細胞和/或巨噬細胞，上皮細胞或內皮細胞，所用啟動子是例如病毒特異性或細胞特異性和細胞周期特異性啟動子，所用效應物是例如下列基因編碼具有細胞靜止效應、細胞編程性死亡效應或細胞毒性效應的蛋白質或編碼將抗病毒或細胞毒性物質的前體切割為活性物質的酶的基因。
已描述了編碼抗病毒蛋白質，如有抗病毒活性的細胞因子和生長因子(如IFNα,IFNβ,IFNγ,TNFβ,TNFα,IL-1或TGFβ)，或具有滅活特定病毒之特異性的抗體或其含有VH和VL的片段或其經接頭而連接的VH和VL片段的基因。針對病毒抗原的抗體的例子是抗HBV、抗HCV、抗HSV、抗HPV、抗HIV、抗EBV、抗HTLV、抗柯薩奇病毒或抗漢坦病毒抗體。
另一種有抗病毒活性的蛋白質是rev-結合蛋白。這些蛋白質與revRNA結合併抑制逆轉錄病毒基因表達中依賴於rev的轉錄後階段。rev-結合蛋白的例子是RBP9-27,RBP1-8U,RBP1-8D或RBP1-8的假基因。
編碼抗細菌蛋白質的基因例如是可中和細菌毒素或調理細菌的抗體的基因。這些抗體的例子是針對腦膜炎球菌C或B，大腸桿菌，疏螺旋體，假單胞菌，幽門螺桿菌或金黃色葡萄球菌的抗體。
下列圖和實施例旨在詳細闡明本發明，而並非將本發明局限於此。圖的描述圖1圖解描述了單鏈的雙抗原結合性分子的結構。
圖2圖解描述了具有效應物的單鏈的雙抗原結合性分子。
圖3和圖5圖解描述了編碼單鏈的雙抗原結合性分子的核酸構建體。
圖4圖解描述了編碼具有效應物的單鏈的雙抗原結合性分子的核酸構建體。
圖6顯示出與針對CEA和大腸桿菌β-半乳糖苷酶的間體(CEAGal)相比，β-半乳糖苷酶通過本發明的單鏈的雙抗原結合性蛋白而在結合於塑料的CEA上的募集(scDb-CEAGal)，用BSA包被一塊微量滴定板以用作陰性對照。
圖7顯示出由哺乳動物細胞分泌的scDb-CEAGal對β-半乳糖苷酶的募集，其中在被CEA包被的微量滴定板上使用了不同量的scDb-CEAGal和β-半乳糖苷酶。所用底物是鄰硝基苯基β-D-半乳糖吡喃糖苷，用BSA包被微量滴定板以用作陰性對照。
圖8A顯示出LoVo細胞在本發明的單鏈的雙抗原結合性蛋白(scDb),β-半乳糖苷酶(β-Gal)，道諾黴素β-D-半乳糖吡喃糖苷(前體藥物)和/或道諾黴素(藥物)存在下的死亡情況。
圖8B顯示出用CEA陰性細胞系(A549)進行的對照實驗。
實施例實施例1單鏈的雙抗原結合性蛋白的製備和細菌表達以識別抗原癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和大腸桿菌β-半乳糖苷酶的蛋白質為例來描述單鏈的雙抗原結合性蛋白的製備。
在5』至3』方向上依次將下列DNA序列連接在一起-LacZ啟動子-細菌核糖體結合結構(AAGGAG)-細菌信號序列pelB(Power等，基因，113,95-99(1992))-抗CEA的VH(Kontermann等，免疫技術，3,137(1997))-接頭GGGS(Kontermann等，(1997))-抗β半乳糖苷酶的VL(Kontermann等，(1997))-連接肽GGGGSGGRASGGGGS-抗β半乳糖苷酶的VH(Kontermann等，(1997))-接頭GGGGS-抗CEA的VL(Kontermann等，(1997))-抗體9E10 EQKLISEEDLN的Myc表位(Munro Pelham，細胞，46,291-300(1986))-可用於通過固定化金屬親和層析(IMAC)進行純化的多組氨酸HHHHHH(Kontermann等，(1997))通過經PCR擴增而在各個DNA序列的末端引入的適當限制性位點可以進行構建體的連接(Kontermann等，免疫技術，3,137(1997))中。
使用本領域技術人員已知的特異於限制性位點的酶和DNA連接酶進行連接。酶可以商購，將構建體克隆至細菌表達載體pAB1(Kontermann等，(1997))。
使用寡核苷酸引物LMB2和LMB3(Kontermann,R.E.(1997)，文獻同上)和VK-NotFor:5′-TTG TTC TGC GGC CGC CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGTGCC AGC ACC-3′,scDb-AscBack:5′-TGC ATG CTA GGG CGC GCC TCG GGC GGA GGT GGCTCA CAG GTG CAG CTG GTG CAA TCT GG-3′,scDb-AscForK:GCT CGG TAA GGC GCG CCC ACC GCT GCC ACC GCCTCC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC-3′和pelB-Metminus:5′-TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ACG GCC CAGGT-3′.進行克隆。
為此，使用引物LMB2和LMB3擴增得自間體CEAGal(Kontermann,R.E.(1997))的片段VHB-VLA(片段1)和VHA-VLB(片段2)並凝膠純化所述片段。然後使用引物VK-NotFor和scDb-AscBack擴增片段1以導入一個AscⅠ位點和7個胺基酸的接頭。使用引物LMB3和scDb-AscForλ擴增片段2以導入一個AscⅠ位點和8個胺基酸的接頭。用AscⅠ和NotⅠ(片段1)與SfiⅠ和AscⅠ(片段2)水解兩種片段並克隆至細菌表達載體pAB1(Kontermann,R.E.(1997))。所得的插入片段編碼一種單鏈多肽，其中VHA-VLB經由15個胺基酸長、序列為GGGGSGGRASGGGGS的接頭與VHB-VLA連接。
然後將質粒插入TG1細菌，用本領域技術人員熟悉的方法培養所述細菌(Kontermann,R.E.(1997))。
破碎細菌，通過固定化金屬親和層析(IMAC)(Hochuli等，生物/技術，6,1321-1325(1988))從壁膜間隙製品中純化單鏈的雙抗原結合性蛋白，此方法的細節由Kontermann等人(1997)作了描述。
SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳和凝膠過濾結果表明純化的蛋白質的分子量為60KDa。每升細菌培養物可以純化出約200至300微克這種分子。在ELISA中，細菌表達的單鏈的雙抗原結合性蛋白能與CEA和β-半乳糖苷酶反應，並能將這種酶募集至結合於塑料的CEA上，通過鄰硝基苯基β-D-半乳糖吡喃糖苷的轉變可以說明這一點(圖6)。另外，這種單鏈的雙抗原結合性蛋白通過募集β-半乳糖苷酶並轉變底物5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖吡喃糖苷(X-Gal)而能對活的和被固定的表達CEA的LoVo細胞進行染色。為此，將LoVo細胞與10μg/ml適當的抗原結合蛋白，10μg/mlβ-半乳糖苷酶和X-Gal(0.8mg/ml，於PBS,3mM鉀鐵(Ⅲ)氰化物，3mM鉀鐵(Ⅱ)氰化物中)一起保溫。在多種對照細胞(A549,HEK293)中或用針對雞蛋溶菌酶和β-半乳糖苷酶的間體(HELGal；Kontermann等，(1997))未觀察到染色。實施例2單鏈的雙抗原結合性蛋白的真核細胞表達為了在真核細胞中表達，將單鏈的雙抗原結合性蛋白的編碼區克隆至真核表達載體pSecTagA(Invitrogen)中，其中的細菌信號序列已被載體中存在的Ig-κ信號序列所取代。
為此，使用引物LMB2和pelB-Metminus擴增單鏈構建體，籍此，pelB前導序列中的甲硫氨酸(第21位)被蘇氨酸所取代。接著用SfiⅠ和EcoRⅠ消化並克隆至載體pSecTagA中。成熟的單鏈抗原結合蛋白在VHA區域的N末端含有7個額外的胺基酸(AAQPATA)。
用脂質轉染胺試劑(Gibco)將質粒瞬時轉染至真核HEK293細胞中。在zeocin的存在下選擇穩定的細胞。在免疫螢光實驗中用這些細胞可以檢測到內質網ER和高爾基體的染色。另外，通過60KDa蛋白質從35S-Met標記的細胞的上清液中的免疫沉澱和通過用固定化金屬親和層析(IMAC)進行的純化還可能檢測到單鏈的雙抗原結合性蛋白的分泌。該純化蛋白質在與β-半乳糖苷酶和包被有CEA的微量滴定板結合方面和將β-半乳糖苷酶募集至結合於塑料的CEA上這一方面是有功能活性的(圖7)。實施例3通過與分泌單鏈的雙抗原結合性蛋白的細胞共培養在體外募集酶通過將產生單鏈的雙抗原結合性蛋白的HEK293細胞與CEA陽性的LoVo細胞共培養而在體外研究募集現象。為此，首先在Transwell細胞培養皿(Costar)中將產生本發明蛋白質的細胞與LoVo細胞一起培養，其中通過膜將兩種細胞系分隔開。2天後，加入β-半乳糖苷酶(10μg/ml)，再通過加入底物X-Gal檢測募集現象。在與產生單鏈的雙抗原結合性蛋白的細胞的共培養物上發現了特異性的染色，而用未經轉染的HEK293細胞進行的對照實驗未顯示出染色。
其中LoVo細胞被A549細胞(CEA陰性)替代的實驗中，和其中產生單鏈的雙抗原結合性蛋白的細胞與酶和底物一起保溫的實驗中同樣都是負結果。後者闡明了僅僅是產生單鏈的雙抗原結合性蛋白的細胞本身不能結合酶。
在另一個實驗中，按1∶4至1∶24的接種比例將分泌單鏈的雙抗原結合性蛋白的HEK293細胞和LoVo細胞直接共培養。為了將HEK293細胞和LoVo細胞區分開，加入LoVo細胞之前用CM-Dil(分子探針)(紅色螢光)將HEK293細胞染色。2天後，加入β-半乳糖苷酶，再通過加入底物X-Gal(10μg/ml)和用抗β-半乳糖苷酶抗體(Biotrend)直接進行免疫螢光術可檢測與細胞的結合。這些實驗也顯示出酶特異性地被募集至LoVo細胞，而HEK293細胞未被染色。用未經轉染的HEK293細胞進行的對照實驗為負結果。這些實驗證明單鏈的雙抗原結合性蛋白能特異性地和選擇性地識別腫瘤細胞。
在另一個實驗中，研究了無毒性的道諾黴素β-D-半乳糖吡喃糖苷向細胞毒性的道諾黴素的轉變。通過將LoVo細胞與純化的單鏈的雙抗原結合性蛋白(10μg/ml)一起保溫1小時，隨後於37℃與β-半乳糖苷酶(1μg/ml)和道諾黴素β-D-半乳糖吡喃糖苷(2μM)一起保溫1小時，就有可能通過所得道諾黴素的自身螢光而檢測到該物質在核中的特異性定位，所述螢光比得上因直接與道諾黴素保溫而致的染色。在缺乏單鏈的雙抗原結合性蛋白或β-半乳糖苷酶時，和用對照細胞(HEK293；產生單鏈的雙抗原結合性蛋白的HEK)時未檢測到核染色。這些實驗證明該單鏈的雙抗原結合性蛋白能將酶募集至腫瘤細胞，並且該酶可被用於將無毒性的前體轉變為毒性物質。
在進一步的實驗中此效應可被用於特異性地殺死腫瘤細胞。
為此，在96孔培養板中將LoVo細胞與一種單鏈的雙抗原結合性蛋白(10μg/ml)一起保溫，然後於37℃與道諾黴素β-D-半乳糖吡喃糖苷(5μM)一起保溫1小時。2天後，使用WST試驗(Boehringer Mannheim)分析細胞的死亡情況(圖8)。在這種情況下，前體藥物轉變為藥物時細胞的死亡情況幾乎和藥物存在時效果一樣好(圖8A)。在缺乏一個組分時或用CEA陰性的A549細胞基本上未發現上述效應。實施例4用於在細胞內表達單鏈的雙抗原結合性蛋白的構建體的製備為了在細胞內表達單鏈的雙抗原結合性蛋白，用多個引物擴增單鏈的雙抗原結合性蛋白基因的DNA-跨膜的單鏈雙抗原結合性蛋白(TM-scDAP)。對它使用了能在該基因3』末端插入PDGFR跨膜區的引物-(LPFKVVVISAIIALVVLTIISLIILIMLWQKKPRYES)-位於內質網的單鏈的雙抗原結合性蛋白(ER-scDAP)。對它使用了能在該基因3』末端插入ER保留信號(SEKDEL)的引物。-位於細胞質中的單鏈的雙抗原結合性蛋白(cyto-scDAP)。對它使用了用最適於翻譯起始的甲硫氨酸和Kozak序列替代基因5』末端信號序列的引物。-位於核中的單鏈的雙抗原結合性蛋白(nuc-scDb)。對它使用了用最適於翻譯起始的甲硫氨酸和Kozak序列替代基因5』末端信號序列、並在基因3』末端插入核定位序列(PKKKRKVGGGT；下劃線的是核定位序列)的引物。
將這些片段克隆至適當的真核表達載體(pSecTagA和pcDNA3；Invitrogen)中。然後將所得構建體(TM-scDAP,ER-scDAP,cyto-scDAP,nuc-scDAP和sec-scDAP(=分泌的蛋白質；見實施例2))瞬時轉染至真核細胞(3T3)中，通過使用抗Myc表位的抗體進行免疫螢光分析來研究所表達的蛋白質的定位。在構建體sec-scDAP,ER-scDAP和TM-scDAP中可檢測到分泌途徑典型的染色，而cyto-scDAP顯示出在細胞質中的擴散定位，nuc-scDAP顯示出定位於核中。
權利要求
1．單鏈的多抗原結合性分子，所述分子含有下列組分a)具有第一特異性(A)的免疫球蛋白重鏈可變區(VH)及其功能性部分，b)具有第二特異性(B)的免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)及其功能性部分，c)具有特異性(B)的免疫球蛋白重鏈可變區(VH)及其功能性部分，和d)具有特異性(A)的免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)及其功能性部分，其中VH和VL區域以VH-VL構建體或VL-VH構建體的形式連接在一起，而這兩個VH-VL構建體經由肽(P)連接。
2．權利要求1的單鏈的多抗原結合性分子，所述分子含有兩個以上VH-VL構建體。
3．權利要求1或2的單鏈的多抗原結合性分子，其中VH-VL構建體經由具有相同特異性的區域而連接。
4．權利要求1至3中任一項的單鏈的多抗原結合性分子，其中特異性(A)和(B)基本上相同。
5．權利要求1至4中任一項的單鏈的多抗原結合性分子，其中通過肽接頭(L)以VH-L-VL構建體或VL-L-VH構建體的形式連接VH和VL區域。
6．權利要求5的單鏈的多抗原結合性分子，其中接頭(L)長約為1-20個胺基酸，優選約為1-5個胺基酸。
7．權利要求5的單鏈的多抗原結合性分子，其中接頭(L)含有胺基酸序列GGGGS。
8．權利要求1至7中任一項的單鏈的多抗原結合性分子，其中肽(P)約為12-40個胺基酸，優選約為12-20個胺基酸，特別是約14個胺基酸長。
9．權利要求8的單鏈的多抗原結合性分子，其中肽(P)含有胺基酸序列GGGGSGGRASGGGS或GGGGSGGRASGGGGS。
10．權利要求1至9中任一項的單鏈的多抗原結合性分子，其中所述分子含有一個或多個效應物(E)作為另外的組分。
11．權利要求10的單鏈的多抗原結合性分子，其中所述效應物(E)是經由連接物(B)與所述分子連接。
12．權利要求11的單鏈的多抗原結合性分子，其中連接物(B)含有一個蛋白酶切割序列，優選含有PSA、組織蛋白酶、纖溶酶原和/或纖溶酶原激活物切割序列。
13．權利要求1至12中任一項的單鏈的多抗原結合性分子，其中第一特異性(A)針對待分析的分子，第二特異性(B)針對分析物。
14．權利要求13的單鏈的多抗原結合性分子，其中所述分析物是一种放射性分子，螢光分子和/或酶。
15．權利要求10至12中任一項的單鏈的多抗原結合性分子，其中第一特異性(A)針對待分析的分子，第二特異性(B)針對待分析的另一分子，效應物(E)是一種分析物。
16．權利要求15的單鏈的多抗原結合性分子，其中所述分析物是放射性分子，螢光分子和/或酶。
17．權利要求1至12中任一項的單鏈的多抗原結合性分子，其中肽(P)和/或效應物(E)含有融合肽。
18．權利要求1至17中任一項的單鏈的多抗原結合性分子，其中第一特異性(A)針對靶細胞，第二特異性(B)針對載體。
19．權利要求18的單鏈的多抗原結合性分子，其中所述載體是核酸，陽離子肽或蛋白質，陽離子脂質，陽離子聚合物，陽離子卟啉或選自AdV、AAV、痘苗病毒、RSV、HSV、流感病毒或慢病毒載體的病毒載體。
20．權利要求1至12中任一項的單鏈的多抗原結合性分子，其中第一特異性(A)針對細胞膜，特別是針對淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞、粒細胞、造血細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、橫紋肌細胞、上皮細胞、肝細胞、腎細胞、膠質細胞、支持組織的細胞、腫瘤細胞或白血病細胞的細胞膜，或針對胞外基質、補體系統、凝結系統、激肽系統、血漿、支持組織的蛋白質，或針對細胞因子或趨化因子，或針對內源或外源毒素，或針對藥物，特別是毛地黃，和/或針對病原體，特別是例如細菌，病毒和/或寄生蟲病原體。
21．權利要求1至12和20中任一項的單鏈的多抗原結合性分子，其中第二特異性(B)是針對細胞膜，特別是針對淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞或粒細胞的細胞膜，針對細胞因子、趨化因子或生長因子，針對補體系統的蛋白質，針對凝結系統的蛋白質，針對纖溶蛋白，針對能將靶結構上無活性的藥物前體轉變為有活性的、特別是有細胞毒性的藥物的酶，針對肽激素或類固醇激素，針對免疫球蛋白的恆定部分，針對介體，特別是例如組胺、5-羥色胺、白三烯、前列環素或激肽，針對病原體，針對腫瘤細胞，針對內源性或外源性毒素，針對藥物，特別是毛地黃。
22．權利要求1至12、20和21中任一項的單鏈的多抗原結合性分子，其中效應物(E)選自跨膜區域，糖磷脂錨，受體上的與配體結合的部分；受體的配體或配體的與受體結合的部分；肽激素；細胞因子；生長因子；生長因子抑制劑；趨化因子；幹擾素；介體；對循環起作用的肽；將藥物的無活性前體轉變為有活性藥物的酶；激活或抑制凝結的蛋白質；激活或抑制纖溶作用的蛋白質；激活或抑制補體系統的蛋白質；免疫球蛋白的一個或多個恆定區；細胞毒性肽，另一種單鏈的單抗原或多抗原、尤其是雙抗原結合性分子；腫瘤抗原或病原體抗原，如細菌抗原或病毒抗原；含有半胱氨酸的肽；和/或二聚體化或多聚體化的肽。
23．編碼權利要求1至22中任一項的單鏈的多抗原結合性分子的核酸。
24．權利要求23的核酸，其中所述核酸在其5』末端含有編碼信號或跨膜序列的核苷酸序列。
25．權利要求23或24的核酸，其中所述核酸在其5』末端含有啟動子和/或激活子。
26．權利要求25的核酸，其中激活子可被細胞特異性地、細胞周期特異性地、代謝特異性地和/或被藥物激活或抑制。
27．權利要求23至26中任一項的核酸，其中所述核酸在其起始密碼子5』末端含有序列GCCACC或GCCGCC。
28．含有權利要求23至27中任一項的核酸的載體。
29．權利要求28的載體，其中所述載體是病毒或非病毒載體。
30．權利要求29的載體，其中所述非病毒載體選自陽離子脂質、陽離子聚合物，陽離子肽或陽離子卟啉。
31．含有權利要求23至27中任一項的核酸或權利要求28或29的載體的細胞。
32．權利要求31的細胞，其中細胞是細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞。
33．權利要求32的細胞，其中哺乳動物細胞是淋巴細胞、巨噬細胞、膠質細胞、上皮細胞、肝細胞、腎細胞、骨髓細胞、內皮細胞、平滑肌或橫紋肌細胞，或成纖維細胞。
34．製備單鏈的多抗原結合性分子的方法，所述方法包括培養權利要求31或32的細胞並適當地分離表達產物。
35．含有權利要求1至12和17至22中任一項的單鏈的多抗原結合性分子、權利要求23至27中任一項的核酸、權利要求28至30中任一項的載體或權利要求31至33中任一項的細胞的藥物。
36．含有權利要求13至16中任一項的單鏈的多抗原結合性分子的診斷輔助物。
37．權利要求1至22中任一項的單鏈的多抗原結合性分子，權利要求23至27中任一項的核酸，權利要求28至30中任一項的載體或權利要求31至33中任一項的細胞用於治療、預防或診斷癌症、自身免疫疾病、炎性疾病、血液病，尤其是血液凝結和/或循環系統疾病，神經系統障礙和/或傳染病的用途。
全文摘要
本發明涉及單鏈的多抗原結合性分子,所述分子具有免疫球蛋白重鏈和輕鏈的多變區,所述區域以VH－VL構建體的形式相互連接,它們又通過肽而連接在一起,本發明還涉及所述分子的製備及其作為藥物或診斷輔助物的用途。
文檔編號A61P31/00GK1234406SQ99104958
公開日1999年11月10日 申請日期1999年4月8日 優先權日1998年4月9日
發明者R·科特曼, H－H·薩德拉克, R·穆勒 申請人:德國赫徹斯特馬裡奧羅塞爾有限公司