基於大腸桿菌的結核菌表達文庫及其用途的製作方法
2023-04-23 22:17:41 3
專利名稱：基於大腸桿菌的結核菌表達文庫及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥生物技術領域，涉及一種基於大腸桿菌的結核菌表達文庫及其用途。
背景技術：
結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，以下簡稱結核菌)一直是威脅人類健康的主要病原微生物之一，至今仍未完全未明了其致病機理。1998年對MTB H37Rv和CDC1551菌株全基因組測序工作的完成，使得對這種病原微生物的研究上了一個新的臺階，但從全基因組序列分析中得到的4000多個基因中，有16％的基因功能完全未知。了解這些基因的功能，將為深入研究MTB的致病機理給出新的線索，進而為新藥物的開發提供可能的靶點。
結核分枝桿菌通過呼吸道入侵人體肺部時，面臨諸多不利因素的脅迫，如缺氧、低pH值、肺部表面活性物質等。其中，肺部表面活性物質參與了對病源微生物入侵的免疫應答，並且使細菌面臨表面活性物質的脅迫。研究與此相關分子機制，不僅能了解結核分枝桿菌在體內存活的機理，而且為消滅它們提供新的線索。
結核菌是乙類致病菌。研究該類致病菌需要較高的生物安全級別的實驗室。這限制了常規實驗室開展結核菌致病功能基因的研究，不利於加速揭示結核菌致病機理和開發新的控制結核病的措施。
發明內容
本發明的目的在於提供，1.一種基於大腸桿菌的結核菌表達文庫；2.從文庫中篩選功能基因的方法；3.利用從文庫中篩選的基因作為藥物靶標研發新的藥物的模型。
本發明的技術方案如下我們通過功能驅動篩選方法，從含有MTB基因組文庫的大腸桿菌中篩選出對SDS脅迫耐受的重組子，通過序列比對，發現一個以前功能未知的蛋白可能在耐受SDS脅迫中表現出一定功能。通過在大腸桿菌中的克隆，重組，誘導表達，獲得了該蛋白的異源表達。序列分析發現該蛋白為可能的膜蛋白。膜蛋白在細菌的致病性上表現出重要的作用，為了研究該蛋白的功能，我們比較了重組菌和對照脂肪酸含量的差異，分析了它們粗提物對細胞生長的影響。為進一步了解MTB致病的分子機理打下基礎。
實現上述目的的基本技術路線為總體技術方案是克隆包括提取結核菌基因組，利用合適的載體和限制性內切酶片段，構建轉化載體，將基因組DNA克隆到合適的大腸桿菌宿主細胞。
1.基因模板提取將待克隆菌株在LB培養基或YE培養基或者Middlebrook 7H9、sauton等分枝桿菌能夠生長的培養基中，培養到合適的菌體濃度，按照本領域一般技術人員熟悉的步驟、試劑和方法提取菌體DNA。
2.基因組表達文庫的構建按照本領域一般技術人員熟悉的步驟、試劑和方法，將基因組DNA克隆到適當的載體，轉化適當的宿主菌，通過一定的選擇標記，收集獲得的結核菌基因組表達文庫。
3.功能基因的篩選 按照本領域一般技術人員熟悉的步驟、試劑、完全可以從商業途徑獲得的載體、限制性內切酶和方法，將目標基因克隆到載體，轉化宿主細胞，篩選轉化子。分別根據已知的結核菌入侵人體和動物模型可能遭遇的不利環境，進行人工模擬，從基因組表達文庫篩選相應的轉化子，並進一步驗證。
4.利用含有功能基因的重組菌，進行功能基因抑制劑或激活劑的篩選。
發明效果利用本技術方案涉及的方法，構建了一種基於大腸桿菌的結核菌表達文庫並篩選到了與抗表面活性劑的結核菌功能基因Rv0621，純化了重組Rv0621，利用該重組菌篩選調控抗表面活性劑的分子。
圖1.結核分枝桿菌基因組不完全酶切結果。Sau 3AI濃度是0.003125 U/μgDNA，2.0.00625U/μgDNA，3.0.0125 U/μgDNA，4.0.025 U/μgDNA，5.0.05 U/μgDNA，6.0.1 U/μgDNA。
圖2.在含有0.4％SDS平板上，大腸桿菌的生長情況。1.結核菌基因組表達文庫；0，空載體轉化的對照E.coli。
圖3.酶切分析S1菌所含質粒箭頭所指的地方為雙酶切切下小片段。1.重組質粒2.分子量標記3.對照。
圖4.菌總蛋白分析箭頭所指的地方為表達差異蛋白。1.E.coli JM109/pUC18總蛋白；2.E.coli JM 109/pUC18-S1總蛋白；M.分子量標記。
圖5.大腸桿菌BL21中重組表達Rv0621。1.重組Rv0621，2.未誘導，3.pET32a(+)-BL21(DE3)對照。
具體實施例方式
1.材料和方法1.1材料1.1.1菌株和質粒滅活的結核分枝桿菌耐藥菌株580購自重慶市肺科醫院，試驗所用載體pUC18，pET32a(+)、大腸桿菌JM109，DH5a和BL21(DE3)、肺癌細胞株A549為本試驗室保存。
1.1.2主要試劑和儀器各種限制性內切酶，小牛腸鹼性磷酸酶CIAP，T4DNA連接酶，膠回收試劑盒購自大連寶生物(TaKaRa)公司；RNase，蛋白酶K，溶菌酶，氨苄青黴素，SDS為上海生工產品。fu DNA聚合酶，dNTP，IPTG購自北京鼎國生物技術有限公司。其它試劑為國產分析純。引物由上海英俊公司合成，DNA測序由上海博亞生物技術有限公司完成。脂肪酸分析由Thermo的Trace GC ultr a Trace DSQ型號的氣相色譜-質譜連用儀完成。
1.2培養基和培養條件大腸桿菌(Escherichia coli)JM109菌株用LB培養基，篩選平板由M9基本培養基加入0.4％SDS構成，氨苄青黴素(Amp)的使用終濃度為100μg/ml。培養溫度均為37℃。
1.3 DNA的提取結核分枝桿菌耐藥菌株總DNA的提取按文獻[4]進行；質粒DNA的提取按文獻[5]進行。
1.4結核分枝桿菌基因文庫的構建選擇合適的濃度Sau 3A I部分酶切MTB基因組，使切得的基因組片段大多數在1-6kb之間。以Bam H I完全酶切載體pUC18，用CIAP對酶切產物進行末端去磷酸化，然後與製備的結核基因組酶切片斷進行連接反應，將連接產物轉化大腸桿菌JM109，在含有Amp的LB平板上培養20h，長出的克隆保存於4℃保存。
1.5耐SDS大腸桿菌陽性克隆的篩選用牙籤將上述平板上長出的菌落點種到含有Amp、0.1mMIPTG及0.4％SDS的M9篩選平板上，數量為100-150個/板，在37℃下培養20h，挑選能夠生長的菌落。接入液體LB，搖菌8h(相當於傳代28代)，再接M9篩選平板上，挑取能生長的菌落，20％甘油保種。
在以一系列逐漸升高的SDS梯度逐級篩選，最後選取能在含1.6％SDS的M9平板上生長的轉化子，提取質粒重新轉化大腸桿菌JM109。將能夠生長的菌落質粒進行下一步分析。
1.6 DNA序列和蛋白序列分析DNA測序由上海博亞生物技術有限公司完成，通過GanBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行核酸序列的同源分析，通過ncbi中的ORFFinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)分析測序結果中含有的ORF，以及重組蛋白的序列。用Tmpred分析重組蛋白的跨膜結構，signalP分析信號肽，Vector NTIsuite 9分析其分子量，等電點等。
1.7 Rv0621的重組表達依據ncbi中公布的Rv0621序列，設計引物P1 GTAGGATCCATGGCAGGCGATCGAG(劃線鹼基為Bam HI酶切位點)P2 CATGTCGACCGAACCCGTTCGAG(劃線鹼基為Sal I酶切位點)以MTB H37Rv基因組為模板，PCR反應條件為96℃ 5min；96℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 2min30s，35個循環；72℃ 10min用TaKaRa膠回收試劑盒切膠回收PCR產物。
以BamHI和SalI雙酶切回收後的PCR產物以及質粒pET32a(+)，T4 DNA連接酶連接過夜，轉化DH5α，通過菌落PCR以及重組質粒雙酶切驗證後，將重組質粒轉化BL21，再次驗證後，將E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-Rv0621及E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)接種於含有100μg/mL氨卞青黴素的LB培養基中，37℃培養。當OD600達到0.6左右時，加入IPTG(終濃度為1mmol/ml)，在30℃培養4h，收集菌體，SDS-PAGE分析。
1.8重組菌及對照脂肪酸分析將誘導後的重組菌以PBS清洗菌體，依據文獻[6]進行脂肪酸提取。將處理好的樣品進行GC-MS分析，條件為進樣口溫度250℃，50℃ 5min，以25℃/min升到250℃，保持7min；載氣∶氬氣；分流比100∶1；程序升溫初溫80℃，20℃/min升到210℃，再以3℃/min升到225℃，保持12min。離子源200℃，60-150m/z1.9與細胞相互作用分析將相同量的重組菌以及重組菌重旋於Tris-HCl pH8.0緩衝液中，超聲破碎菌體，15000rpm離心，取上清，沒有稀釋的液體濃度設為1，每個梯度稀釋四倍。共設八個梯度，在96孔板中，以每孔100μl的量處理相同量的細胞。3天後，以MTT法[7]測定活細胞量。
2.結果2.1 580基因文庫的構建將Sau 3A I部分酶切的MTB580總DNA產物與Bam H I酶切後去磷酸化的pUC18載體連接，轉化到大腸桿菌JM109中，共獲得約3000個重組克隆。選用0.025 U/μgDNA的濃度酶切基因組。
2.2結核基因Rv0621的分離基於大腸桿菌JM109不能在含有0.4％的表面活性物質SDS上生長，首先挑選在0.4％SDS的M9培養基上生長的轉化子，為了檢測這些轉化子性狀是否穩定，將其轉入液體LB培養基中，培養8h，在LB中大腸桿菌的代時為12.5-17min，由此推斷，經過了至少28代的傳代，再塗到篩選培養基上，有五個轉化子仍然能夠生長。對這些菌的質粒進行序列分析後，挑選一個含有結核基因Rv0621的轉化子進行進一步分析。結核基因Rv0621是一個預測的功能未知的含有GTP或ATP結合位點的膜蛋白，在NCBI中序列比對結果發現，僅H37Rv，CDC1551以及BCG中有該基因存在，其它基因的Score都低於48.1 Bits(完全匹配有2111 Bits)。目前還沒有發現關於該基因的任何報導。
2.3 Rv0621編碼蛋白的序列分析結核基因Rv0621編碼一個含354個胺基酸殘基的蛋白質，預測分子量37KD，等電點6.0，四次跨膜，經signalP分析，N端不含信號肽，含有GTP或ATP結合位點基序A(P環)結構為[AG]-x(4)-G-K-[ST].，篩選到的菌株中的重組蛋白含有開始跨膜前N端的所有序列。
2.4菌株S1總蛋白分析與空質粒對照相比，能在含0.4％SDS平板上生長的菌株S4與對照菌相比，在44.3KDa-29.0KDa以及29.0KDa處有明顯新增蛋白條帶。
2.5 Rv0621的重組表達經過IPTG誘導E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-Rv0621以可溶形式表達重組蛋白，分子量約66.4KDa，與預期分子量相符。
權利要求
1.一種基於大腸桿菌的結核菌表達文庫，其特徵是將結核菌基因組DNA酶切為適宜大小的片段後克隆到合適的大腸桿菌細胞，構建基於大腸桿菌的結核菌表達文庫，利用該文庫在普通實驗室篩選結核菌功能基因。
2.權利要求1所述的功能基因是Rv0621。
3.權利要求1所述的功能基因Rv0621在抗表面活性劑中的運用。
4.含有功能基因是Rv0621的重組菌，重組宿主是大腸桿菌。
全文摘要
本發明屬於醫藥生物技術領域，構建了一種基於大腸桿菌的結核菌表達文庫並篩選到了與抗表面活性劑的結核菌功能基因Rv0621，純化了重組Rv0621，利用該重組菌篩選調控抗表面活性劑的分子。
文檔編號C12R1/19GK1995351SQ20061009533
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月25日 優先權日2006年12月25日
發明者謝建平, 廖丹, 郭茹珍, 王洪海 申請人:西南大學