一種獼猴桃自然雜合子的鑑定方法
2023-04-23 16:02:46 1
一種獼猴桃自然雜合子的鑑定方法
【專利摘要】本發明公開了一種獼猴桃自然雜合子的鑑定方法，涉及植物遺傳資源評價和生物【技術領域】。本方法具體步驟是：①採集待鑑定的自然雜合子樣本和假定的對照親本；②採用微衛星分子標記對所有樣本進行基因組遺傳分析；③構建所有樣本的微衛星分子基因表型資料庫；④利用分子表型數據的多元對應分析確定真正的對照親本；⑤基於對照親本鑑定自然雜合子。本發明相比傳統的獼猴桃自然雜合子鑑定方法，具有分子實驗方法簡便，分析鑑定流程快速高效等特點；同時本方法可以克服獼猴桃純和對照樣本確定困難、基因組倍性複雜數據不好處理等問題；本方法還可以減輕遺傳共祖對雜合子鑑定帶來的影響。
【專利說明】一種獼猴桃自然雜合子的鑑定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物遺傳資源評價和生物【技術領域】，尤其涉及一種獼猴桃自然雜合子 的鑑定方法。具體涉及獼猴桃屬植物不同物種內和物種間自然雜合子和對照親本的基因組 微衛星分子標記遺傳評價，利用改進的分子基因表型數據處理和分析方法輔助確定真正的 對照親本，在此基礎上利用參數優化的分析軟體對自然雜合子進行篩選和鑑定。
【背景技術】
[0002] 稱猴桃隸屬稱猴桃科（Actinidiaceae)稱猴桃屬（Actinidia Lindl.)，為多年 生木質藤本植物。該屬植物共有54個種，21個變種共約75個分類單元。中華獼猴桃 (A.chinensis Planchon)複合體的兩個變種中華稱猴桃（A.Chinensis var.chinensis) 和美味稱猴桃（A. chinensis var. deliciosa)是現代栽培稱猴桃育成品種的主要來源， 同時還包括毛花稱猴桃（A. eriantha Bentham)、軟麥稱猴桃（A. arguta(Siebold and Zuccarini))等其他物種。我國是獼猴桃的原產國，自然資源異常豐富。先前的研究表明， 獼猴桃屬植物種內種間存在廣泛的自然雜交漸滲現象，連同多倍化一起共同促進了獼猴桃 屬植物的形態和生態適應性多樣化。同時，對現有的獼猴桃主栽品種的分析表明，大多數 好的品種都源自於獼猴桃的自然雜交帶種質，經過短暫的一代或者幾代的人工馴化培育而 成。因此，自然雜合子種質的遺傳鑑定是利用其進行獼猴桃遺傳育種的前提。然而，由於獼 猴桃本身的植物學特性（如多年生和雌雄異株）和複雜的倍性基因組遺傳，迄今為止缺乏 快速高效的對獼猴桃自然雜合子的鑑定方法。
[0003] 植物自然雜交帶的出現是由於兩個或者多個具有不同地理分布、生物學特性或者 遺傳與生態屬性的物種或者種內進化單元相遇並交配形成可育的後代，從基因組遺傳變異 的角度即形成不同程度的基因組混合現象。對自然雜合子的遺傳鑑定評價，其關鍵在於對 其基因組遺傳混合情況的測定。現有的植物自然雜交帶雜合子的鑑定方法通常需要清晰 的雜交帶居群樣本取樣和雜交親本純和對照居群的設置，同時利用分子標記對雜交居群樣 本和對照樣本進行遺傳變異檢測，並進一步利用相關分析軟體對具有基因組遺傳混合的雜 合子進行識別鑑定。然而，對於獼猴桃而言，採用這一常規的方法具有幾個困難：（1)由於 不同獼猴桃物種種間或者變種間存在廣泛的重疊分布現象以及其固有的雌雄異株的特性， 加上本身獼猴桃自然分布的廣泛和地方適應性進化的存在，參與雜交的親本其自然純和對 照居群很難簡單的從形態學上確定；（2)獼猴桃物種間和物種內存在複雜的基因組倍性變 異，這樣常規的分子標記數據處理方法不適用於獼猴桃的分子數據分析；（3)獼猴桃屬於 富含多糖多酚類植物，獲取高質量的基因組DNA比較困難，不適用於大多數分子標記技術 的有效開展。如何平衡實驗方法的可用性和統計分析的困難之間的矛盾是獼猴桃雜合子鑑 定的難題之一。
[0004] 先前的研究表明，在獼猴桃植物的野生居群中，自然雜交的發生往往包含多於兩 個親本的網狀基因流，這為獼猴桃自然雜合子的鑑定帶來進一步的困難。不同於簡單的人 工雜交體系，有的獼猴桃自然雜合子可能同時混合了多個親本的基因組遺傳信息，其形成 過程也可能包括了不同形式或者多個不同世代的雜交漸滲。如何初步的分析和識別鑑定這 些不同類型的雜合子也是獼猴桃自然種質發掘利用的技術需求之一。同時，從進化遺傳學 的角度，基因組共有等位基因的共祖現象會在一定程度幹擾雜合子識別，因而需要優化識 別基因組混合頻率的起始值。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在於提供一種獼猴桃自然雜合子的鑑定方法。
[0006] 本發明的目的是這樣實現的：
[0007] -、方法
[0008] 通過對獼猴桃屬植物不同物種內和物種間自然雜合子和對照親本的基因組微衛 星分子標記遺傳評價，採用改進的分子分析方法識別確定對照親本並在此基礎上形成自然 雜合子快速高效的鑑定流程。
[0009] 其技術方案包括待鑑定獼猴桃自然合子和假定的對照親本居群進行樣本採集，利 用微衛星分子標記對採集樣本進行居群基因組遺傳變異檢測，同時利用改進的分子基因表 型數據處理和分析方法輔助確定真正的對照親本，在此基礎上利用參數優化的分析軟體對 自然雜合子進行篩選和鑑定。
[0010] 具體地，本方法包括下列步驟：
[0011] ①採集待鑑定的自然雜合子樣本和假定的對照親本；
[0012] ②採用微衛星分子標記對所有樣本進行基因組遺傳分析；
[0013] ③構建所有樣本的微衛星分子基因表型資料庫；
[0014] ④利用分子表型數據的多元對應分析確定真正的對照親本；
[0015] ⑤基於對照親本鑑定自然雜合子。
[0016] 二、應用
[0017] 基於該方法的應用：針對獼猴桃主要商業利用物種中華獼猴桃複合體的兩個變種 中華獼猴桃和美味獼猴桃，本實施例共鑑定出具有基因組遺傳混合的自然雜合子198份， 其中76份具有三種遺傳來源；針對闊葉獼猴桃和毛花獼猴桃等代表性的種間雜合子鑑定， 本實施例共鑑定到種間雜合子35份；本方法還成功應用到其他的獼猴桃種間雜合子鑑定， 涉及軟棗獼猴桃、黑蕊獼猴桃、大籽獼猴桃、山梨獼猴桃、京梨獼猴桃、柱果獼猴桃、黃毛獼 猴桃等。
[0018] 本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果：
[0019] ①利用分子標記數據的對應分析可以克服獼猴桃野生樣本採集過程中基於形態 確定對照親本的困難；
[0020] ②使用微衛星分子標記，具有操作簡便，擴增高效且對基因組DNA模板質量要求 低等特點，大大解決了獼猴桃乾燥葉片基因組DNA提取質量較差不能滿足其他類型分子標 記試驗需求的問題；
[0021] ③本發明採用分子基因表型處理分子標記數據，可以避免具有不同基因組倍性變 異樣本帶來的數據分析困難；
[0022] ④本發明優化了自然雜合子探測分析軟體的設置參數，減輕了遺傳共祖對雜合子 鑑定帶來的影響。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] 圖1為本方法流程圖；
[0024] 圖2為基於該方法篩選鑑定中華獼猴桃和美味獼猴桃種內變種間自然雜合子的 示意圖；
[0025] 圖3為基於該方法篩選鑑定闊葉獼猴桃和毛花獼猴桃種間自然雜合子的示意圖。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合附圖和實施例詳細說明：
[0027] -、方法
[0028] 1、如圖1步驟①採集待鑑定的自然雜合子樣本和假定的對照親本。根據現有的中 華稱猴桃複合體物種的地理分布，兩個變種中華稱猴桃（A. chinensis var. chinensis，AC) 和美味稱猴桃（A. chinensis var. deliciosa，AD)具有不同的地理分布區域和生態適應 性，其中中華獼猴桃變種在我國偏東南分布，主要適應中低海拔山地丘陵地帶，而美味獼猴 桃變種多分布在我國中西部山地和較高海拔的生態區域。然而，在我國中西部兩個變種存 在較大範圍的地理重疊分布區，涉及的省份包括陝西、河南、湖北、湖南、貴州、雲南、廣西等 從北到南連續的區域，主要重疊分布的垂直海拔範圍為800-1200m。本實施例基因組雜合 子待鑑定樣本的採集源自中華稱猴桃（A. chinensis var. chinensis，AC)和美味稱猴桃 (A. chinensis var. deliciosa，AD)自然重疊分布區的同域混生居群。樣本共米集自5個不 同地理混合分布點（陝西商南、河南西峽、湖北五峰、湖南遂寧、廣西資源），總共待鑑定種 質355份。兩個變種的純合對照樣本採自湖北利川（AD :50份）和廣西龍勝（AC :20份）。 兩個變種的形態初步判定依據獼猴桃UP0V標準的5個易觀察的形態描述特徵，分別為一年 枝芽眼大小、花枝被毛、成熟果實被毛、成熟果肉顏色、葉片質地。所有樣本分別採集一年生 枝條上的嫩葉若干，將其迅速放置於矽膠密封袋中乾燥保存。
[0029] 提取所有樣本的基因組總DNA，具體步驟包括：取50-100mg矽膠乾燥保存的葉片 組織樣本，在液氮中充分研磨，將粉末轉移至1. 5mL離心管，添加 lmLCTAB裂解試劑在65°C 水浴中充分裂解細胞核至少30分鐘，然後經過氯仿分層和異丙醇沉澱以及乙醇洗滌，最後 將獲取的基因組總DNA溶解於50uL的0. 1 X TE溶液中。DNA溶液通過凝膠電泳和紫外分光 光度計Nanodrop2000c (ThermoFisher scientific公司，下同）檢測其質量和產量，達到SSR 試驗要求（其DNA質量的純度衡量指標A260/280的吸收峰比值在1. 5-2. 5之間均可以使 用），隨即存於-20°C備用。
[0030] 2、如圖1步驟②採用微衛星分子標記對所有樣本進行基因組遺傳分析。植物微衛 星分子標記是散布在其基因組上的簡單重複序列，具有進化中性、實驗操作步驟簡單（僅 包括一步PCR擴增步驟）、遺傳穩定等特點。本實施例所用的基因組微衛星分子標記實驗方 法主要包括特異SSR引物的PCR擴增、PCR產物的聚丙烯醯胺凝膠電泳分型和銀染染色條 帶判讀三個步驟。PCR擴增所用的DNA模板濃度為50ng/ul，PCR反應總體系為10ul，其中 包括25-50ng模板DNA，0. 25uM的正向引物和0. 25uM的反向引物，0. 2mM的dNTPs，l. 5mM的 MgCl2, (λ 5單位的Taq PCR反應聚合酶以及lXTaq酶反應緩衝液（75mM Tris-HCl，pH8. 8 ; 20mM(NH4)2S04 ;0. 01% Tween20)等。所使用的微衛星引物的優化擴增條件為：95°C條件下 初始模板變性7min，然後接著33個循環，每個循環包括94°C變性30s，55°C引物結合40s， 72°C引物延伸55s，在這些循環完成後，最後為72°C延伸9min。PCR產物的分離可以在3% 的瓊脂糖膠或者6 %的聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離，然後利用溴化乙錠或者銀染染色進行 條帶的判讀。本實施例是利用6 %的聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離PCR擴增條帶並結合銀染 染色。主要步驟為：配置好凝膠出％的聚丙烯醯胺，7M尿素）後在Bio-Rad凝膠電泳儀（美 國）對PCR產物進行電泳分離，點樣前對PCR產物加入變性劑在95°C下變性7min，然後每個 點樣孔上樣3ul，電泳功率為55W，電泳緩衝液為1. 2XTBE，電泳時間為1. 5小時。電泳結束 利用銀染染色DNA譜帶，包括10%的冰醋酸固定液脫色5min，然後染色液（每100ml水中 溶解0· lgAgN03和150ul37%甲醛）染色30min，最後顯影液（每100ml水中溶解3gNaC03， 150ul37%甲醛和20ulNa 2S203)顯色5min並固定（10%的冰醋酸）。
[0031] 3、如圖1步驟③構建所有樣本的微衛星分子基因表型資料庫。樣本SSR分析指 紋條帶的判讀採用分子基因表型的形式進行，即只計算樣本間同一水平線上擴增條帶的有 (記為"1"）和無（記為"〇"），最終形成0-1矩陣資料庫。具體操作方式為，針對任意單一 的引物對，將所有樣本擴增的基因條帶依據DNA片段大小（根據50bp Ladder確定）排序， 然後從小到大對所有不同大小的等位基因按照所分析樣本擴增條帶的有無進行1或0的計 數，最終形成Excel表格的數據矩陣供後續分析。
[0032] 4、如圖1步驟④利用分子表型數據的多元對應分析確定真正的對照親本。為了確 定最能代表雜交親本遺傳屬性的純合對照樣本，本實施例利用多元對應分析對所採集的中 華獼猴桃和美味獼猴桃的兩個假定純合居群樣本（基於UP0V形態的特徵值判定）進行了 排序分析，其具體實施方法為：將湖北利川採集的美味獼猴桃和廣西龍勝採集的中華獼猴 桃的SSR指紋圖譜數據單獨挑出，將每一個等位基因座位（大小）作為一個單獨的屬性變 量，針對所有樣本形成數據表，利用任意方便的統計軟體進行多元對應MCA分析。本實施例 採用R軟體包中的ADE-4模塊進行多元對應MCA分析。對排序結果進行5%的雙尾置信區 間統計檢驗，篩選其中的90%的具有統計重要性的樣本形成兩個新的數據表，並作為兩個 變種分別的純合對照樣本共後續基因組雜合子鑑定分析。
[0033] 5、如圖1步驟⑤基於對照親本鑑定自然雜合子。在確定中華獼猴桃和美味獼猴 桃變種的對照樣本之後，利用基於貝葉斯分析方法的STRUCTURE軟體確定待鑑定樣本的基 因組雜合情況。其具體的實施方法為：將對照樣本和待檢測樣本（以樣本地理來源歸類） 的SSR指紋數據整合成一個完整的數據表並利用R軟體轉換成適用於STRUCTURE軟體分 析的數據輸入格式（此處還可以利用其他軟體轉換或者直接在STRUCTURE軟體中人工輸 入數據），缺失的數據輸入"-1"。STRUCTURE軟體參數設置為：採用Admixture模型（Use Admixture Model on)，獨立等位基因頻率（Allele Frequencies Independent on)，其他的 使用默認值。將預評估的K值（所分析樣本中潛在的不同的基因組遺傳類型）設置成所分 析樣本採樣群體的2倍（本實施例為7X2 = 14,即從Κ = 1到14進行評估）進行最合適 的Κ值篩選，估算時貝葉斯的迭代數為1000, 000,其中初始的50, 000個迭代數據不收集。 最合適Κ值的判斷根據公式Λ K = LnP⑶k-LnP⑶η進行，取最大Λ Κ對應的Κ值。本實 施例最合適為Κ = 3.
[0034] 依據Κ = 3,在STURCTURE軟體中鑑定基因組雜合子樣本。本實施例結果如圖2 所示。根據純和對照樣本95%的純和性確認優化的Q值（本實施例Q = 0. 2或0. 8)，即在 Q = 0. 2-0. 8的區間進行雜合子鑑定。
[0035] 二、應用
[0036] 基於該方法，本實施例篩選鑑定出中華獼猴桃和美味獼猴桃種內變種間具有基因 組遺傳混合的自然雜合子198份，其中76份具有三種遺傳來源（K = 3)的混合（圖2);針 對闊葉獼猴桃和毛花獼猴桃等代表性的種間雜合子鑑定，本實施例共鑑定到種間雜合子35 份（圖3);本方法還成功應用到其他的獼猴桃種間雜合子鑑定，涉及軟棗獼猴桃、黑蕊獼猴 桃、大籽獼猴桃、山梨獼猴桃、京梨獼猴桃、柱果獼猴桃、黃毛獼猴桃等。
【權利要求】
1. 一種獼猴桃自然雜合子的鑑定方法，其特徵在於： ① 採集待鑑定的自然雜合子樣本和假定的對照親本； ② 採用微衛星分子標記對所有樣本進行基因組遺傳分析； ③ 構建所有樣本的微衛星分子基因表型資料庫； ④ 利用分子表型數據的多元對應分析確定真正的對照親本； ⑤ 基於對照親本鑑定自然雜合子。
2. 按權利要求1所述一種獼猴桃自然雜和子的鑑定方法的應用，其特徵在於： 篩選出的獼猴桃自然居群中的各類種內和種間的雜合子種質。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152561SQ201410404558
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月15日 優先權日:2014年8月15日
【發明者】劉義飛, 黃宏文, 李大衛, 鍾彩虹 申請人:中國科學院華南植物園