一種慢病毒綠色螢光自噬報告載體及構建方法與流程
2023-04-23 19:18:12 2
本發明屬於細胞研究領域，涉及一種基於慢病毒載體骨架的、穩定株篩選、觀察細胞內自噬體變化的慢病毒綠色螢光自噬報告載體及構建方法。
背景技術：
自噬是細胞內的一種「自食」的現象，凋亡是「自殺」的現象，二者共用相同的刺激因素和調節蛋白，但是誘發閾值和門檻不同，如何轉換和協調目前還不清楚。自噬是指膜包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等形成自噬體，最後與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物，以實現細胞穩態和細胞器的更新。
由於自噬過程很快，所以在研究自噬時要進行動態觀察，自噬體屬於亞細胞結構，所以要在投射電鏡下觀察自噬體，但是投射電鏡耗時太長，不利於監測自噬形成。利用lc3在自噬形成過程中發生聚集的現象開發出了gfp-lc3技術：沒有發生自噬時，綠色螢光自噬標記基因lc3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬發生時，綠色螢光自噬標記基因lc3融合蛋白轉位至自噬體膜，在螢光顯微鏡下形成多個明亮的綠色螢光斑點，一個斑點相當於一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。可見構建一種綠色螢光自噬載體對研究的重要性。
目前已有一些商品化的自噬檢測的綠色螢光載體，但存在一些局限性：1、載體骨架為普通質粒載體，難以獲得穩定表達的細胞株；2、價格昂貴且使用受限制。售價從5000元到上萬元不等；3、含有綠色螢光蛋白的載體質粒不能特異性的觀察自噬體的變化情況。4、有的載體含有g418篩選基因，篩選周期長，穩定性不高。因此構建一種慢病毒綠色螢光自噬報告載體在細胞和相關領域的研究具有重要的意義和廣闊的應用前景。
技術實現要素：
本發明解決的問題在於提供一種慢病毒質粒為骨架、插入綠色螢光自噬標記蛋白lc3基因，獲得慢病毒綠色螢光自噬報告載體及構建方法。
本發明通過以下技術方案來實現：
一種慢病毒綠色螢光自噬報告載體，包含氨苄青黴素抗性、嘌呤黴素篩選標記和綠色螢光自噬標記蛋白lc3基因序列。
本發明所述的綠色螢光自噬標記蛋白lc3基因序列如seq.id.no.1所示。
一種慢病毒綠色螢光自噬報告載體的構建方法，包括以下步驟：
(1)根據綠色螢光自噬標記蛋白lc3基因序列信息，設計併合成引物，以pex-gfp-hlc3wt載體質粒為模板，pcr擴增獲得綠色螢光自噬標記蛋白lc3基因序列；
(2)根據綠色螢光自噬標記蛋白lc3基因序列和plenti-puro序列，用bamhi和xhoi酶切綠色螢光自噬標記蛋白lc3基因的pcr產物和plenti-puro載體質粒，將酶切產物連接，獲得目的載體plenti-puro-gfp-lc3，載體完整序列seq.id.no.2；
(3)無內毒素提取驗證載體plenti-puro-gfp-lc3質粒，用bamhi和xhoi酶切載體plenti-puro-gfp-lc3質粒，核酸電泳檢測基因序列大小，同時將載體plenti-puro-gfp-lc3質粒測序驗證序列是否與預期一致；
(4)用載體plenti-puro-gfp-lc3質粒轉染hep2細胞,48h後雷射共聚焦顯微鏡觀察gfp-lc3的表達情況。
與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
1、本發明的綠色螢光自噬標記蛋白lc3質粒以慢病毒作為骨架，有利於獲得穩定表達綠色螢光細胞系的建立，而且由於慢病毒對哺乳動物細胞廣泛的適用性，本發明的綠色螢光質粒可用於多種細胞。與使用普通載體昂貴的價格和特異性相比，成本很低。
2、本發明的綠色螢光plenti載體綠色螢光和目的基因lc3使用cmv啟動子，該啟動子在哺乳動物細胞中高表達。
3、本發明的綠色螢光自噬標記蛋白lc3基因融合蛋白能夠利用螢光標籤觀察並判斷自噬體的變化情況。
4、本發明的慢病毒綠色螢光自噬報告載體含有嘌呤黴素篩選基因，篩選的周期短，穩定性更高。
附圖說明
圖1為plenti-puro載體結構圖譜；
圖2為plenti-puro-gfp-lc3目的載體酶切電泳鑑定結果圖；
圖3為pex-gfp-hlc3wt載體結構圖譜；
圖4為綠色螢光自噬標記蛋白lc3目的基因pcr產物電泳鑑定結果圖；
圖5為plenti-puro載體質粒及綠色螢光自噬標記蛋白lc3目的基因酶切圖譜；
圖6為plenti-puro-gfp-lc3目的載體電泳鑑定結果圖；
圖7為plenti-puro-gfp-lc3載體測序結果部分峰圖；
圖8為雷射共聚焦顯微鏡檢測綠色螢光自噬標記蛋白lc3表達結果圖。
具體實施方式
本發明提供一種慢病毒綠色螢光自噬報告載體構建方法，包括插入目的載體plenti-puro-gfp-lc3構建、插入目的基因的驗證、轉染細胞螢光顯微鏡觀察自噬體的驗證。下面結合具體的實驗過程和實驗結果對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
一種慢病毒綠色螢光自噬報告載體的構建方法，包括以下步驟：
首先提供質粒和主要試劑的來源或製備方法：
plenti-puro載體和pex-gfp-hlc3wt載體由本實驗室所提供。dh5α感受態細胞購於北京全式金生物技術公司。lipofectamine3000轉染試劑購自thermofisherscientific公司。限制性內切酶購自neb公司。pcr酶購於北京全式金生物技術公司。連接酶購自vazyme公司。
lb液體培養基配方(1l)：胰蛋白腖10g；酵母提取物5g；nacl10g。加1lddh2o攪拌至完全溶解，高壓滅菌。
lb固體培養基配方(1l)：胰蛋白腖10g；酵母提取物5g；nacl10g。加1lddh2o攪拌至完全溶解，高壓滅菌。
氨苄青黴素(100mg/ml):1g溶於10ml1lddh2o，0.22μm濾器過濾除菌。
1、構建載體plenti-puro-gfp-lc3
1)設計併合成以下引物：f：5』-cgcggatccgccaccatggtgagcaagggcgaggagctg-3』核苷酸序列如seq.id.no.4；r：5』-ccgctcgagttacactgacaatttcatcccgaacgtc-3』核苷酸序列如seq.id.no.5。引物中下劃線部分分別為bamhi和xhol的酶切位點。以pex-gfp-hlc3wt(載體結構如圖3)質粒為模板，使用該引物對進行pcr反應獲得含有目的基因綠色螢光自噬標記蛋白lc3的產物，核苷酸序列如seq.id.no.1所示，pcr反應條件為：95℃，3min；95℃,30sec,57℃,30sec,72℃1min，35個循環；72℃，3min。核酸電泳，結果顯示和目的片段大小相符，電泳結果如圖4所示，膠回收綠色螢光自噬標記蛋白lc3產物。
2)使用bamhi和xhol切割2ug的綠色螢光自噬標記蛋白lc3和1ug的plenti-puro質粒(核苷酸序列如seq.id.no.2)，核酸電泳，結果如圖5所示，膠回收酶切產物。
3)酶切後回收的綠色螢光自噬標記蛋白lc3與plenti-puro質粒片段按照1：5的摩爾比用連接酶4度過夜連接。
4)連接產物轉化大腸桿菌dh5α感受態細胞，塗布含100μg/ml氨苄青黴素的lb平板，37℃過夜培養，挑取單克隆進行擴大培養和質粒提取。
5)提取的質粒進行電泳鑑定，結果見圖6。使用bamhi和xhol酶切質粒進行電泳鑑定，結果見圖2。電泳檢測陽性的質粒進行dna測序，驗證序列方向和部分峰圖，結果見seq.id.no.3和圖7。plenti-puro-gfp-lc3部分序列如seq.id.no.1所示。
2、無內毒素小量提取plenti-puro-gfp-lc3質粒
1)取測序驗證正確的plenti-puro-gfp-lc3菌液20微升，接種至含100μg/ml氨苄青黴素的15mllb液體培養基中，37℃搖床過夜培養。
2)無內毒素質粒小提試劑盒提取培養的菌液中的plenti-puro-gfp-lc3質粒，測定濃度。
3、目的基因表達和驗證
1)將hep2細胞按適當濃度傳代到60mm培養皿中，轉染時細胞密度在60-70％。
2)用lipofectamine3000轉染試劑將plenti-puro-gfp-lc3質粒轉染hep2細胞。
3)轉染48小時後在雷射共聚焦顯微鏡下觀察結果如圖8。
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山西醫科大學第一醫院
一種慢病毒綠色螢光自噬報告載體及構建方法
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