豆甾烷-3,5,6-三醇及其衍生物用於製備抗病毒藥物的用途以及新的豆甾烷-3,5,6-三醇...的製作方法

2023-04-23 15:16:16 5

專利名稱：：豆甾烷-3,5,6-三醇及其衍生物用於製備抗病毒藥物的用途以及新的豆甾烷-3,5,6-三醇...的製作方法
技術領域：
：本發明涉及豆甾醇衍生物用於製備抗逆轉錄病毒藥物的用途，更具體地，本發明涉及豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用於製備抗愛滋病毒(HIV)和抗乙型肝類病毒(HBV)的藥物的用途。本發明還涉及含有豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物的藥物組合物以及使用豆甾烷-3，5,6-三醇及其衍生物治療愛滋病和B型肝炎的方法。
背景技術：
：HIV感染已對我國人們的健康構成嚴重威脅。HIV感染者在1989年後急劇上升，到目前為止，為84萬，其中愛滋病患者8萬，愛滋病死亡人數已達22萬。其疫情特點是持續增長，流行呈聚集性分布，擴散跡象形成。專家推測到2010年將達到1000萬人。目前，抗HIV藥物研究的重點為融合抑制劑、逆轉錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑及整合酶抑制。雖然已有IO餘種藥物可以有效地緩解症狀，延長病程，但仍存在很多問題，如不能徹底清除體內病毒、停藥反彈、易產生耐藥性、副作用大及每年的昂貴費用，使得這些藥物的應用受到很大限制。特別是佔全球感染者90%以上的廣大發展中國家的感染者根本無法接受治療。因此，進一步研製和開發低毒有效甚至能夠清除病毒的抗病毒藥物仍是一項迫切而艱巨的任務。式I豆甾烷-3，5，6-三醇為已知化合物，OHI但到目前為正,關予其本身及其衍生物在抗逆轉錄病毒,尤其是抗HIV病毒和抗HBV病毒方面的用途尚未見報導。
發明內容本發明人在研究中出人意料地發現具有下式II的豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物在抑制HIV病毒和HBV病毒方面顯示出良好的活性。因此，本發明的第一方面涉及式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用於製備抗HIV病毒的藥物的用途其中，R"R2和R3相同或不同，各自獨立地為H、C「Cs烷基、d-C6烷醯基、C廣Cu芳醯基、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、果糖，4R4為具有以下結構的基團本發明的第二個方面涉及上述式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用於製備抗B型肝炎病毒的藥物的用途。本發明的第三個方面涉及新的式II豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物其中，R丄，R2和R3相同或不同，各自獨立地為H，d-C6烷基，d-C6烷醯基，C廣Cu芳醯基，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，鼠李糖，阿拉伯糖，木R4為具有以下結構的基團條件是，當Ri,R2和R3同時為H時，匯不為II。本發明的第四個方面涉及含有式II豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物以及一種或多種藥學上可接受的載體的藥物組合物。本發明的第五個方面涉及治療愛滋病和B型肝炎的方法，該方法包括給予需要治療的對象治療有效量的式I或式II化合物。根據本發明的一個優選實施方式，在式III豆齒烷-3，5，6-三醇衍生物中，R"R2和R3相同或不同，為乙醯基、丙醯基、丁醯基或苯甲醯基。活性成分的提取根據本發明，式I豆甾烷-3，5，6-三醇是已知化合物，其可通過本領域已知方法得到，例如可以通過以下方法獲得用95%的乙醇加熱回流提取杜仲，減壓濃縮後的浸骨採用不同極性的溶劑依次進行提取，對其中的乙酸乙酯部分進行純化，以石油醚氯仿系統進行梯度洗脫，收集有關餾分，即可得到豆甾烷-3，5，6-三醇。抗病毒活性研究採用HIV病毒感染的MT4細胞為實驗模型，以病毒引起的合胞體的產生為評價指標，觀察藥物的作用。研究發現，式I豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物可以有效地保護病毒感染的細胞，使其不產生病變，並且效果顯著，ICs。值為9.38ng.mr，從而首次發現豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物具有抗HIV作用。另外，採用HepG2.2215細胞系對豆齒烷-3，5，6-三醇及其衍生物的抗HBV活性進行了測定。圖1和圖2顯示了正常的MT4細胞。圖3和圖4顯示了被HIV感染的MT4細胞。圖5顯示了豆甾烷-3，5，6-三醇對於,皮HIV感染的MT4細胞的抗細胞病理作用。具體實施方式儀器與材料MS:Zabspec高分辨質鐠儀(Micromass公司)。NMR:JNM-ECA-400超導核磁共振儀(日本電子林式會社)，TMS為內才示。VarianUNITYINOVA600超導核磁共振儀.熔點儀RY-1熔點儀(天津市分析儀器廠)。矽膠薄層層析用矽膠H、HF254(青島海洋化工廠)。纖維素板Merk公司。薄層顯色紫外燈254，366nm，碘蒸汽、1。/。FeCl3醇溶液。藥材來源中藥杜仲皮，購自廣州南方醫院中藥房。實施例l豆齒烷-3，5，6-三醇的提取、分離和結構鑑定將藥材(10Kg)用95°/。乙醇加熱回流提取三次，合併提取液，減壓濃縮至幹，得浸骨736g。將浸骨溶於水中，必要時加熱使其完全溶解。採用不同極性的溶液依次進行萃取，分為石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水四個部分，對乙酸乙酯部分進行純化分離。用石油醚-氯仿系統(50:1-5:1)作洗脫劑進行矽膠柱層析，收集第14-24餾分，合併後在甲醇中析出白色片狀結晶，mp:249-2521C，稱為式I化合物。上述白色片狀結晶的Libermann-Burchard反應呈陽性，EI-MS給出分子離子峰M/Z448(M+)，結合13C-DEPT和^醒R確定分子組成C29H5203，不飽和度為4，I3C-DEPT顯示29個碳信號，其中在560-80區域有2個連氧叔碳(CH):565.63和74.22,—個連氧季碳575.85。EI-MS鐠上可見連續脫水的碎片峰M/Z430,2(M-H20，100)，412.2(M-2H20，74)，上述數據表明為甾醇類化合物。進一步根據EI-MS譜所示有失去C17側鏈的離子峰M/Z290(M-H2O-d。H2。，26)，271(M-2H20-d。H21，22)，說明該化合物為具有10個飽和碳的側鏈，這與豆甾烷類化合物的質譜裂解規律基本吻合，故將化合物13C-DEPT7和^-NMR與類似母核的豆甾烷醇類化合物進行比較歸屬，化合物的EI-MS，^NMR，"CNMR與文獻報導的豆齒烷-3，5，6-三醇基本吻合(蔡雄，譚小秋，潘德濟，等.玉柏石松的甾體成分研究.中草藥，1989，7:44;Deshmane.S.S,SukhDev.HighIsoprenoids-IITriterpenoidsandSteroidsofSaccharumOfficinarum.Tetrahedron,1971,27:1109-1118;ZhaoM，DuanJ.A，HuangWZ，etal.SteroidsandAnthraquinonesfromj"r^司。試劑DMS0:軍事醫學科學院進口分裝；RPMI-1640培養基Invitrogen公司；小牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司。細胞和病毒MT4細胞林引自日本；HIV-1IIIB:引自美國。病毒毒力測定10倍稀釋8個濃度HIV在RPMI-l640培養液中觀察細胞病變，計算TCIDs。為10—6。式I化合物對細胞的毒性測定按照文獻(RudiPauwels，JanBalzarini，MasanoriBaba,etal.Rapidandautomatedtetrazolium-basedcolorimetricassayforthedetectionofanti-HIVcompounds.JVirolMeth，1988，20:309)描述的方法，將MT4細胞2x15個/ml接種於96孔板中，0.lml/孔，加入驗證化合物，驗證化合物二倍稀釋為lOOOMg/ml-7.8pg/ml，陽性對照藥AZT三倍稀釋為500pg/ml-6.3pg/ml，每個濃度接種3孔，同時設正常細胞對照，DMSO溶劑對照及空白MT4細胞對照(不加病毒)，置37X:5。/。C02培養箱內培養6天。MTT法測定細胞活性，確定CCs。值。式I化合物對HIV誘導的MT4細胞病變的抑制作用按照文獻(陳春英，黃學華，周井炎等，硫酸酯化箬葉多糖的結構修飾及其抗愛滋病病毒作用，藥學學報，1998，33:260所述方法，將MT4細胞2xl5個/ml接種於96孔板中，0.lml/孔，分別加入lOOOTCIDw的HIV病毒100n1，同時設正常細胞對照和病毒對照，然後分別加入成倍稀釋五個濃度的樣品及AZT100n1,每個樣品濃度設三個平行孔，置37X:5。/。C02培養箱內培養，72小時後在倒置顯微鏡下觀察細胞病變(CPE)。CPE判定標準無合胞體形成"-"，無合胞體形成但細胞不規則"±"，有合胞體形成"+"。ICs。的判定(1)只一復孔為"+，，，另兩復孔為"-，，或"-，，與"±，，，此藥物濃度可視為ICso。(2)三復孔分別為"+"，"-，，與"±"，此藥物濃度可視為IC5。。(3)三復孔均為"±"，此藥物濃度可視為IC5。。(4)三復孔均為"+"，下一個濃度作用下的三復孔均為"-"，兩個濃度的中間值可視為IC5。。選擇指數(SI):CC5。/IC5。。結果HIV誘導MT4細胞病變模型的建立正常MT4細胞為懸浮細胞，呈聚集狀生長，邊界清晰，折光性好(圖1和2)。HIV感染細胞3天，有合胞體產生，但細胞活性基本正常(圖3)。HIV感染細胞第7天，細胞出現死亡，合胞體產生，有大的空泡出現(圖4)，說明細胞病變明顯。式I化合物抑制細胞病變作用及細胞毒性結果顯示，式I化合物的抗HIV作用顯著，抑制細胞病變的IC5。值為9.38|ig/ml(表l)。細胞毒性實驗顯示，該化合物的CCs。值大於1000jug/ml。並且，式I化合物的SI值大於50，說明其抗HIV作用強。表1.在HIV-1/MT4培養體系中的式I化合物對於HIV-1誘導的CPE的抑制作用化合物IC5。(Pg/ml)CC5。(pg/ml)SIAZT0.15005000式I化合物9.38>1000>107由抑制細胞病變結果可見，式I化合物對細胞病變具有顯著的抑制作用。加藥後第三天，未見有病變產生，細胞狀態好，與正常對照組無差別。加藥第7天觀察，未見有細胞病變產生，細胞呈簇狀生長，邊界光滑，且細胞活性好於正常對照組細胞(圖5)。實施例3式I化合物的抗HBV作用研究材料和方法藥物將實施例1所得的式I化合物樣品用DMSO溶解，以DMSO二倍稀釋成六個濃度。對照藥物GS101(阿昔洛韋)由軍事醫學科學院二所提供。細胞培養HepG2.2215細胞係為HBVDNA克隆轉染的人肝癌細胞(HepG2)，由美國MountSinai醫學中心構建，軍事醫學科學院引進，用含10%胎牛血清、谷胺醯胺、100ng.mr青黴素、100]Lig.mr鏈黴素、100pg.mr卡那黴素的MEM培養液培養。定期用含380陣ml—418的培養液篩選。選取生長良好的HepG2，2215細胞，用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，濃度為lxl(T個.L-1。懸液接種於96孔培養板中，正常培養48小時後加入含有不同濃度藥物的培養液，培養4d後更換含相同藥物濃度的培養液，繼續培養4d。收集8d細胞上清檢測HBsAg、HBeAg及細胞存活率。試劑HBsAg、HBeAgELISA檢測試劑盒，HBVDNAPCR檢測試劑盒(北京華美生物工程有限公司)；噻唑藍(MTT);胰蛋白酶；EaglesMEM細胞培養乾粉，G-418(Geneticin)，美國GIBCO公司；胎牛血清，美國HycloneUb公司。藥物對細胞的毒性實驗藥物用DMSO配製成2mg.ml—、2倍稀釋成6個濃度加入96孔板，每濃度4孔，另設空白對照組，每4天換同濃度藥液，再培養4天，設無藥物細胞對照組。實驗第8天，傾去培養液，每孔加入含MTT的培養液(400|Lig.ml—D，每孔100pl，37X:,5。/。C02孵育4小時，棄上清，加DMSO100jil溶解，待甲纘顆粒完全溶解後，酶標儀WOnm波長測定OD值。結果顯示，豆甾烷-3，5，6-三醇的半數無毒濃度(CC5。)ii大於1000pg/ml。細胞存活實驗實驗釆用MTT法檢測，方法與上述細胞毒性實驗相同。藥物濃度為100jug.ml1-3.l"iig.m1—1。細胞用藥後，檢測得各個濃度孔中培養上清的光密度值，取均值後按下式計算細胞存活率，其中給藥組為給予不同濃度的實驗組；空白組為不加酶結合底物而平行操作的空白對照組；對照組為不加藥物處理的細胞對照組。細胞存活率-[(D給藥組-D空白組)/(D對歸-D空6組)]xlOO%。鏡檢未見給藥組與對照組細胞存在形態學差異。HBsAg、HBeAg含量的檢測收集用藥後培養上清，按HBsAg、HBeAgELISA檢測試劑盒說明書測得各個濃度孔中培養上清的OD值，取均值後按下式計算抗原抑制率，抗原抑制率-[(D對照組一以給藥組乂/(D對照組-D空白組)]xlOO%。實驗重複進行3次。藥物對抗原的半數有效濃度(IC5。)，按Logistic法計算，Logistic法擬和作圖，曲線形狀若為典型的S型濃度-效應曲線，可以說明藥物具有良好的量效關係，可以得到在不同濃度藥物處理時抗原生成量，測定最大值和最小值，最大抑制率、最低抑制率、抑制50%所需濃度(IC5。)。IC5。為抑制曲線中最重要的參數，濃度越低表示藥物的抑制活性越高。檢測半數無毒濃度CCs。。治療指數(SI)=CC5。/IC5。。結果見表2，經計算得到的抗原抑制率在30-40%之間。表2.式I化合物對HBV抗原表達和細胞增殖的作用(n-3，—x士s)tableseeoriginaldocumentpage12*屍<久。J""戶<7.d權利要求1.式II豆甾烷-3，5，6-三醇用於製備抗HIV病毒的藥物的用途其中，R1，R2和R3為H，R4為具有以下結構的基團全文摘要本發明涉及豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物用於製備抗愛滋病毒(HIV)和B型肝炎病毒(HBV)的藥物的用途。本發明還涉及新的豆甾烷-3，5，6-三醇衍生物、含有豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物的藥物組合物以及使用豆甾烷-3，5，6-三醇及其衍生物治療愛滋病和B型肝炎的方法。文檔編號A61K31/575GK101474190SQ20081017637公開日2009年7月8日申請日期2005年5月26日優先權日2004年7月28日發明者吳曙光,孫燕榮,張嘉傑,偉徐申請人:南方醫科大學