固定化水解酶及其製備方法和應用的製作方法

2023-04-24 03:08:56

固定化水解酶及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種固定化水解酶及其製備方法和應用。該固定化水解酶是將水解酶通過戊二醛吸附交聯於磁性殼聚糖複合微球上製備得到，磁性殼聚糖複合微球是由Fe3O4納米顆粒與殼聚糖通過戊二醛交聯而成。製備方法包括（1）將Fe3O4納米顆粒加入到殼聚糖溶液中，然後加入戊二醛溶液，得到磁性殼聚糖複合微球；（2）將磁性殼聚糖複合微球加入到戊二醛溶液中反應，所得載體產物加入水解酶溶液中，製得固定化水解酶。本發明的固定化水解酶對熱、強酸、強鹼、高離子強度、有機溶劑等穩定性較強，不易失活，可回收再利用。該固定化水解酶可應用於強化汙泥水解過程，解決酶強化汙泥水解過程中酶完全損失及酶的回收利用等問題。
【專利說明】固定化水解酶及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於汙泥水解領域，具體涉及一種固定化水解酶及其製備方法和應用。
【背景技術】
[0002]活性汙泥法是目前世界上應用最為廣泛的汙水生物處理技術之一，此技術最大的弊端就是產生大量的剩餘汙泥。目前，我國汙泥產生量約為2500萬噸/年(按含水率85%計算)，若不及時進行妥善的處理與處置，將會對環境造成直接或潛在的汙染。汙泥厭氧消化是目前國內外常用的汙泥處理技術，水解是此過程的限速步驟，而剩餘汙泥可降解性差是制約厭氧消化的瓶頸問題，因此研發提高汙泥水解速率的技術具有重要意義。
[0003]目前，促進汙泥水解的方法有機械法、超聲波法、熱鹼法和生物法等。酶處理技術是近年來環境領域迅速發展起來的一種處理汙泥的新技術，它可以縮短消化時間，改善汙泥消化性能，而且經濟高效，易控制，其產物對環境也無汙染副作用。
[0004]酶的化學本質是蛋白質，其具有高催化活性、高選擇性、反應條件溫和、環保無汙染等特點。游離狀態的酶對熱、強酸、強鹼、高離子強度、有機溶劑等穩定性較差，易失活，純化困難，不能重複使用。為了克服這些問題，可以用載體將酶束縛或限制在一定的區域內，使酶分子在此區域進行特有和活躍的催化作用，酶分子不易失活，並可將其回收及重複使用，從而降低酶強化汙泥處理技術的成本。
[0005]目前，固定酶的方法有吸附法、交聯法、包埋法和共價偶聯法等，固定化載體有殼聚糖、海藻酸、膠原和纖維素等。但是，由於汙泥中含有大量的有機顆粒物，在汙泥水解過程中運用常規有機載體固定的水解酶存在固定化水解酶與汙泥分離困難、回收再利用複雜、穩定性差等缺點，因此，需要尋求新方法來解決這些技術問題。

【發明內容】

[0006]本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種對熱、強酸、強鹼、高離子強度、有機溶劑等穩定性較強，不易失活，可回收再利用的固定化水解酶及其製備方法和應用。
[0007]為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案為一種固定化水解酶，所述固定化水解酶是將水解酶通過戊二醛吸附交聯於磁性殼聚糖複合微球上製備得到，所述磁性殼聚糖複合微球是由Fe3O4納米顆粒與殼聚糖通過戍二醒交聯而成。
[0008]上述的固定化水解酶中,優選的,所述水解酶包括蛋白酶或澱粉酶。
[0009]作為一個總的技術構思，本發明還提供一種固定化水解酶的製備方法，包括以下步驟:
(O將殼聚糖溶解於醋酸溶液中，配製成殼聚糖溶液，然後將Fe3O4納米顆粒加入到殼聚糖溶液中，再加入戊二醛溶液，其中Fe3O4納米顆粒、殼聚糖、戊二醛的質量比為1:1: 0.7~1.5，室溫下超聲振蕩使反應完全後，磁力分離並去除上清液，將所得沉澱洗滌至中性，再經真空冷凍乾燥後，得到磁性殼聚糖複合微球；(2)將磁性殼聚糖複合微球加入到戊二醛溶液中進行交聯反應，磁性殼聚糖複合微球與戊二醛的質量比為0.5~1: 1，室溫下水浴振蕩使反應完全後，將所得載體產物洗滌至中性，然後加入到水解酶溶液中，水解酶與載體產物的質量比為0.8~3: 1，室溫下利用水浴振蕩固定，再經磷酸緩衝溶液清洗和真空冷凍乾燥，得到固定化水解酶。
[0010]上述的製備方法中，優選的，所述Fe3O4納米顆粒是通過化學共沉澱法製備得到:用N2作保護氣，在室溫非磁性攪拌條件下，向鐵鹽溶液中逐滴加入氨水，直至pH值為9.5~10.5，將產物在78°C~82°C熟化30min~40min，得到Fe3O4懸浮液，在攪拌作用下將Fe3O4懸浮液降至室溫，磁力分離後，去除上清液，所得沉澱用水洗滌至PH值為6.8~7.2，真空冷凍乾燥24h~48h後,得到Fe3O4納米顆粒。
[0011 ] 上述的製備方法中，優選的，所述鐵鹽溶液是Fe3+和Fe2+的混合溶液，所述鐵鹽溶液中Fe3+和Fe2+的摩爾比為1.6~2: I。
[0012]上述的製備方法中，優選的，所述殼聚糖溶液中殼聚糖的濃度為3mg/mL~5mg/mL，所述醋酸溶液中醋酸的質量濃度為1%~1.5% ;所述戊二醛溶液中戊二醛的質量濃度為
1% ~2%。[0013]上述的製備方法中，優選的，所述水解酶溶液包括蛋白酶溶液或澱粉酶溶液。
[0014]上述的製備方法中，優選的，所述蛋白酶溶液是由以下方法製備得到:將工業級蛋白酶加入到磷酸緩衝溶液中，於48°C~52°C下充分攪拌溶解，然後進行離心處理，取上清液，得到蛋白酶溶液；
所述澱粉酶溶液是由以下方法製備得到:將工業級澱粉酶加入到磷酸緩衝溶液中，然後加入氯化鈉溶液作為澱粉酶的激活劑，所得混合液於48°C~52°C下充分攪拌溶解，再進行離心處理，取上清液，得到澱粉酶溶液。
[0015]作為一個總的技術構思，本發明還提供一種上述的固定化水解酶或者上述的製備方法製得的固定化水解酶在汙泥水解中的應用。
[0016]上述的應用包括以下步驟:將固定化水解酶加入汙泥中進行厭氧水解，水解溫度為48°C~52°C,水解時間為4h~5h,振蕩速度為IOOrmp~120rmp。
[0017]本發明中，磷酸緩衝溶液的pH值均可優選為6.8~7.2，濃度均可優選為0.08mol/L ~0.12mol/L。
[0018]本發明的固定化水解酶的製備方法中，步驟(1)和步驟(2)中的真空冷凍乾燥的時間可優選為24h~48h ;步驟(1)中的超聲振蕩時間可優選為30min~40min ;步驟(2)中，兩次水浴振蕩的時間均可優選為2h~4h ;步驟(1)中的沉澱和步驟(2)中的載體產物通常先用乙醇洗滌3次~4次，再用超純水洗滌至中性。
[0019]本發明中，在製備澱粉酶溶液時，氯化鈉在磷酸緩衝溶液中的最終質量濃度可優選為0.03%~0.1%，氯化鈉溶液的質量濃度可優選為0.3%~1%。
[0020]本發明的應用中，一般地，汙泥的總懸浮固體濃度(TSS)為8800mg/L~12000mg/L，揮發性固體濃度(VSS)為6050mg/L~8000mg/L，溶解性蛋白質的濃度為73.0mg/L~100.0mg/L，溶解性碳水化合物的濃度為14.0mg/L~20.0mg/L，但並不局限於此。
[0021]與現有技術相比，本發明的優點在於:
本發明的固定化水解酶中的固定化載體是由殼聚糖包裹Fe3O4納米顆粒構成的，從而賦予了其與水解酶吸附的基團，通過戊二醛交聯劑的交聯作用來提高固定化水解酶的穩定性。此外，Fe3O4納米顆粒在強化水解酶的催化性能的同時，賦予了固定化水解酶磁學特性，在外界磁場存在的條件下，固定化水解酶的分離回收和再利用簡單方便。
[0022]本發明的固定化水解酶對熱、強酸、強鹼、高離子強度、有機溶劑等穩定性較強，不易失活，回收再利用簡單方便，可以極大地降低酶強化汙泥水解過程的成本，具有良好的應用前景。
[0023]本發明的製備方法通過結合Fe3O4納米顆粒、殼聚糖和水解酶各自的特點，先將Fe3O4納米顆粒與殼聚糖交聯成磁性殼聚糖複合微球，再將水解酶固定於微球載體上。Fe3O4納米顆粒尺寸小、比表面積大、表面可修飾，具有良好的吸附性能，對汙泥中架橋的金屬離子具有吸附作用，可破壞汙泥的絮體結構，有利於有機物的溶出，同時水解酶能夠促進有機物的進一步降解，從而強化了汙泥水解效率。
[0024]本發明的固定化水解酶能有效促進汙泥絮體中有機物的水解，可以解決酶強化汙泥水解過程中酶完全損失及酶的回收利用這一關鍵性問題。
【具體實施方式】
[0025]以下結合具體優選的實施例對本發明作進一步描述，但並不因此而限制本發明的保護範圍。
[0026]以下實施例中採用的蛋白酶和澱粉酶均購於Solarbio生物有限公司，酶活分別為6000U/g和3700U/g，最適酶活溫度分別為40°C~50°C和50°C~70°C。
[0027]實施例1:
一種本發明的固定化水解酶，具體為固定化蛋白酶，該固定化蛋白酶是將蛋白酶通過戊二醛吸附交聯於磁性殼聚糖複合微球上製備得到，磁性殼聚糖複合微球是由Fe3O4納米顆粒與殼聚糖通過戊二醛交聯而成。
[0028]一種上述本實施例的固定化蛋白酶的製備方法，包括以下步驟:
1.製備Fe3O4納米顆粒
(I)稱取5.56g FeSO4.7H20和6.488g FeCl3，將其溶解於200mL的超純水中配製成鐵鹽溶液，其中Fe3+和Fe2+的摩爾比為2: I。
[0029](2)用N2作保護氣，在室溫非磁性快速攪拌條件下，向鐵鹽溶液中逐滴加入氨水，直至PH值為10，將產物在80°C熟化30min，得到Fe3O4懸浮液。
[0030](3)將Fe3O4懸浮液在攪拌作用下降至室溫，通過磁力分離，倒去上清液，所得沉澱用超純水洗滌多次直至PH值為7，再真空冷凍乾燥24h，得到Fe3O4納米顆粒。
[0031]2.製備磁性殼聚糖複合微球
(I)將2.0g殼聚糖溶解於500mL lwt%的醋酸溶液中，配製成4mg/mL的殼聚糖溶液。
[0032](2)將400mg Fe3O4納米顆粒加入到IOOmL殼聚糖溶液中，然後加入30mL lwt%的戊二醛溶液(即含約0.28g戊二醛)，在室溫下超聲30min。
[0033](3)通過磁力分離後，倒去上清液，所得沉澱先用乙醇洗滌3次，再用超純水洗滌至中性，真空冷凍乾燥24h，得到磁性殼聚糖複合微球。
[0034]3.製備固定化蛋白酶
(1)0.5g工業級蛋白酶(含雜質50wt%)溶解於IOmL pH為7.2、濃度為0.lmol/L的磷酸緩衝溶液中，然後加溫至50°C攪拌溶解5min，再將其於5000rmp轉速下進行離心處理，離心後取上清液，得到蛋白酶溶液。
[0035](2)將0.05g磁性殼聚糖複合微球加入到IOmL lwt%的戊二醛溶液(即含約0.09g戊二醛)中，25 °C水浴振蕩4h。
[0036](3)通過磁力分離後，所得載體產物先用乙醇洗滌3次，再用超純水洗滌至中性，然後再將其加入到5mL的蛋白酶溶液中，25°C水浴振蕩固定，轉速為lOOrmp，固定時間為2h，最後用磷酸緩衝溶液清洗，真空冷凍乾燥24h，得到固定化蛋白酶。
[0037]一種上述本實施例製備的固定化蛋白酶在汙泥水解中的應用，包括以下步驟:
分別稱取0.05g已製備好的固定化蛋白酶，投入到IOOmL總懸浮固體濃度(TSS)和揮發性固體濃度(VSS)分別為8800mg/L和6050mg/L，溶解性蛋白質和溶解性碳水化合物濃度分別為73.0mg/L和14.0 mg/L的剩餘汙泥中，於50°C、IOOrmp水浴振蕩器上進行4h的厭氧水解。反應結束後，取樣進行分析，溶解性蛋白質濃度從73.0mg/L增加到782.0mg/L,溶解性碳水化合物濃度從14.0mg/L增加到192.0mg/L，而空白未加固定化水解酶組的溶解性蛋白質濃度73.0mg/L增加到402.0mg/L，溶解性碳水化合物濃度從14.0mg/L增加到120.5mg/L。由此可知，固定化水解酶可以強化汙泥的水解過程。待水解反應結束後，通過磁力分離可回收固定化水解酶，從而使其重複使用。
[0038]實施例2:
一種本發明的固定化水解酶，具體為固定化澱粉酶，該固定化澱粉酶是將澱粉酶通過戊二醛吸附 交聯於磁性殼聚糖複合微球上製備得到，磁性殼聚糖複合微球是由Fe3O4納米顆粒與殼聚糖通過戊二醛交聯而成。
[0039]一種上述本實施例的固定化澱粉酶的製備方法，包括以下步驟:
1.製備Fe3O4納米顆粒
同實施例1的步驟I。
[0040]2.製備磁性殼聚糖複合微球 同實施例1的步驟2。
[0041]3.製備固定化澱粉酶
(1)0.5g工業級澱粉酶(含雜質45wt%)溶解於9mL pH為6.8、濃度為0.lmol/L的磷酸緩衝溶液中，然後加入ImL質量濃度為0.3%的氯化鈉溶液作為澱粉酶的激活劑，將所得混合液加溫至50°C攪拌溶解5min，再將其於5000rmp轉速下進行離心處理，離心後取上清液，得到澱粉酶溶液。
[0042](2)將0.05g磁性殼聚糖複合微球加入到IOmL lwt%的戊二醛溶液(即含約0.09g戊二醛)中，25 °C水浴振蕩4h。
[0043](3)通過磁力分離後，所得載體產物先用乙醇洗滌3次，再用超純水洗滌至中性，然後再將其加入到5mL的澱粉酶溶液中，25°C水浴振蕩，轉速為lOOrmp，固定時間為2h，最後用磷酸緩衝溶液清洗，真空冷凍乾燥24h，得到固定化澱粉酶。
[0044]—種上述本實施例製備的固定化澱粉酶在汙泥水解中的應用，包括以下步驟:
分別稱取0.05g已製備好的固定化澱粉酶，投入到IOOmL總懸浮固體濃度(TSS)和揮發性固體濃度(VSS)分別為8800mg/L和6050mg/L，溶解性蛋白質和溶解性碳水化合物濃度分別為73.0mg/L和14.0 mg/L的剩餘汙泥中，於50°C、IOOrmp水浴振蕩器上進行4h的厭氧水解。反應結束後，取樣進行分析，溶解性蛋白質濃度從73.0mg/L增加到710.0mg/L,溶解性碳水化合物濃度從14.0mg/L增加到185.0mg/L，而空白未加固定化水解酶組的溶解性蛋白質濃度從73.0mg/L增加到402.0mg/L,溶解性碳水化合物濃度從14.0mg/L增加到120.5mg/L。
[0045]以上所述僅是本發明的優選實施方式，本發明的保護範圍並不僅局限於上述實施例。凡屬於本發明思路下的技術方案均屬於本發明的保護範圍。應該指出，對於本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下的改進和潤飾，也應視為本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種固定化水解酶，其特徵在於，所述固定化水解酶是將水解酶通過戊二醛吸附交聯於磁性殼聚糖複合微球上製備得到，所述磁性殼聚糖複合微球是由Fe3O4納米顆粒與殼聚糖通過戊二醛交聯而成。
2.根據權利要求1所述的固定化水解酶，其特徵在於，所述水解酶包括蛋白酶或澱粉酶。
3.一種固定化水解酶的製備方法，包括以下步驟: (O將殼聚糖溶解於醋酸溶液中，配製成殼聚糖溶液，然後將Fe3O4納米顆粒加入到殼聚糖溶液中，再加入戊二醛溶液，其中Fe3O4納米顆粒、殼聚糖、戊二醛的質量比為1:1: 0.7~1.5，室溫下超聲振蕩使反應完全後，磁力分離並去除上清液，將所得沉澱洗滌至中性，再經真空冷凍乾燥後，得到磁性殼聚糖複合微球； (2)將磁性殼聚糖複合微球加入到戊二醛溶液中進行交聯反應，磁性殼聚糖複合微球與戊二醛的質量比為0.5~1: 1，室溫下水浴振蕩使反應完全後，將所得載體產物洗滌至中性，然後加入到水解酶溶液中，水解酶與載體產物的質量比為0.8~3: 1，室溫下利用水浴振蕩固定，再經磷酸緩衝溶液清洗和真空冷凍乾燥，得到固定化水解酶。
4.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於，所述Fe3O4納米顆粒是通過化學共沉澱法製備得到:用N2作保護氣，在室溫非磁性攪拌條件下，向鐵鹽溶液中逐滴加入氨水，直至PH值為9.5~10.5 ，將產物在78°C~82°C熟化30min~40min，得到Fe3O4懸浮液，在攪拌作用下將Fe3O4懸浮液降至室溫，磁力分離後，去除上清液，所得沉澱用水洗滌至pH值為6.8~7.2，真空冷凍乾燥24h~48h後，得到Fe3O4納米顆粒。
5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於，所述鐵鹽溶液是Fe3+和Fe2+的混合溶液，所述鐵鹽溶液中Fe3+和Fe2+的摩爾比為1.6~2: I。
6.根據權利要求3~5中任一項所述的製備方法，其特徵在於，所述殼聚糖溶液中殼聚糖的濃度為3mg/mL~5mg/mL，所述醋酸溶液中醋酸的質量濃度為1%~1.5% ;所述戊二醛溶液中戊二醛的質量濃度為1%~2%。
7.根據權利要求3~5中任一項所述的製備方法，其特徵在於，所述水解酶溶液包括蛋白酶溶液或澱粉酶溶液。
8.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述蛋白酶溶液是由以下方法製備得到:將工業級蛋白酶加入到磷酸緩衝溶液中，於48°C~52°C下充分攪拌溶解，然後進行離心處理，取上清液，得到蛋白酶溶液； 所述澱粉酶溶液是由以下方法製備得到:將工業級澱粉酶加入到磷酸緩衝溶液中，然後加入氯化鈉溶液作為澱粉酶的激活劑，所得混合液於48°C~52°C下充分攪拌溶解，再進行離心處理，取上清液，得到澱粉酶溶液。
9.一種如權利要求1或2所述的固定化水解酶或者如權利要求3~8中任一項製備方法製得的固定化水解酶在汙泥水解中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特徵在於，包括以下步驟:將固定化水解酶加入汙泥中進行厭氧水解，水解溫度為48°C~52°C,水解時間為4h~5h,振蕩速度為IOOrmp~120rmpo
【文檔編號】C12N11/14GK103898086SQ201410167562
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月24日 優先權日:2014年4月24日
【發明者】羅琨, 廖興盛, 龐婭, 李雪, 裴習君 申請人:長沙學院