西紅柿染色體圖及拷貝脫氧核糖核酸庫的製作方法
2023-04-24 03:07:56 5
專利名稱:西紅柿染色體圖及拷貝脫氧核糖核酸庫的製作方法
本發明涉及使用重組DNA克隆的遺傳工程及植株的培育。
人們已經發展了多種生物體的基因連鎖圖，它們把特定的染色體或染色體片段滲入到種種遺傳背景中時具有不可估量的價值(參見Rick，C.M.及Khush，G.S(1969)「西紅柿基因組中細胞基因組的探索」45～68頁，發表在「遺傳學講座」(Genetic Lectures Bogart編)，俄勒崗州立大學出版社，Corvalis;以及C.Rhyne(1960)」由於二倍體種基因轉移而產生的異源四倍體G.hirsutum L.連鎖群中Gossypium Ⅱ重組值改變的連鎖研究」。遺傳學45673～683頁。有關基因的定位也可以用做過圖譜的標記物通過連鎖分析來實現，如Patterson，E.B(1982)「用染色體畸變及多標記物品系作基因圖譜」85～88頁(發表在「生物研究用玉米」，W.F.Sheridan編，North Dakota大學，大學出版社出版)一文所述。這裡加以引用作為參考。
在高等植物中，西紅柿(Lycopersicon esculentum)是具有最詳盡的連鎖圖的一個。在西紅柿中曾使用標記物位點來組成染色體替代體系(Rick，C.M.(1969)「Solanum Pennellii染色體基因有控制地有滲入Lycopersicon esculentum分離及重組」，遺傳學62753～768頁;以及Rick，C.M.(1971)「二倍體植株種基因組的某些細胞基因特徵」，Stadler Symposia卷1/2153～174頁，以及在自不親和性中作為基因鑑別的一種輔助方法(Tanksley，S.D及Loaiza-Figueroa，F.(1985)「遺傳自不親和性被Lyco-per-sicon Peruvianum中染色體1上的一個單一的主位點所控制」，Proc.Nat′l.Acad.Sci.825093～5096頁)具有經濟價值的特定基因滲入諸如雄不育性(Tanksley，S.D.，Rick，C.M及Vallejos，C.E(1964)，「西紅柿中核的雄不育位點及一個酶標記物之間的緊密連鎖」Theor.Appl.Genet.68109～113頁)及nematode抗性(Medina-Filho，H.P(1980)，「染色體6上的APS-1，mi及其他標記物的連鎖」，Rep.Tomato Genet.Coop.3026～28頁)也由於使用比較容易選擇的連鎖標記物位點而比較方便。
雖然西紅柿的遺傳圖上有著良好分布的標記物，但是，它和大多數植株種一樣，是由基本上是形態突變位點所組成。一般說來，這些形態標記物在植株培育的選擇方案中是沒有什麼用處的，因為它們通常是隱性的，並且它們具有不希望有的表(現)型。
電泳以及酶專門染色劑的發展擴大了西紅柿基因圖並且提供了許多新的標記物，它們的變異體往往對於顯性(型)沒有顯著的影響。這些同功酶標記物雖然非常有用，但為數極少而且只能用於西紅柿基因組的一小部分(Tanksley，S.D.及Rick，C.M.(1980)，「西紅柿的同功酶基因連鎖圖在遺傳學及育種中的應用」，Theor.Appl.Genet.57161～170頁;Tanksley，S.D.(1985)，「西紅柿中的酶編碼基因(Lycopersicon esculentum)，Isozyme Bulletin1843～45頁)。由於這些原因，人們希望發展一種基於從信使核糖核酸RNA(cDNA)中衍生的單拷貝DNA序列的更為詳盡的連鎖圖。
近年來，相應於特定染色體位點的單拷貝DNA序列曾在人身上用作遺傳標記物(Botstein，D.White，R.L.，Skolnick，M.及Davis，R.(1980)，「用限制片段長度多形質組成人的遺傳連鎖圖」，Am.J.Hum.Genet.32314～331頁;Jeffreys，A.J.，Wilson，V.及Thein，S.L.(1985)，「人類DNA中的超可變『小型衛星』區域」，Nature 31467～73頁;及White，R.，Leppert，M.，Bishop，D.T.，Barker，D.，Berkowiz，J.，Brown，C.，Callahan，P.，Holm，T.，Jerominski，L.(1985)，「用DNA標記物組成人類染色體連鎖圖」，Nature 313101～105頁;有人提出此法可用於植物(Helentjaris，T.G.，PCT應用，發表於1984年12月6日，「植物遺傳圖譜(遺傳基因作圖)及雜交育種」方法)。使用這種方法時，先用一種限制性核酸內切酶消化從被分析的個體中取得的DNA來檢測出等位基因變異，然後用電泳將所得片斷分離並轉移到膜上。然後，用放射性同位素標記的、克隆及同種序列探查過濾器而鑑別等位基因片段。用這種方法探查得的遺傳變異常常被稱作限制片段長度多形質(RFLP)。RFLP的數目實際上是無限制的。它們對顯性型沒有任何影響。它們是等顯性並且是以孟德爾方式遺傳的(Bostein等，1980，Supra)。
用RFLP檢測的位點圖譜工作(作圖工作)在人體上進展得很快，所得到的信息已開始在若干遺傳疾病的產前脫光期的診斷方面得到應用(Murray，J.M.，Davis，K.E.，Harper，P.s.，Meredith，L.，Muller，C.R.，Williamson，R.(1982)，「X染色體短臂上克隆DNA序列與Duchenne遺傳性肌肉萎縮症之間的關係」，Nature 30069～70頁)。雖然人類(方面的)遺傳學家採用RFLP迅速地發展基因圖分析(Solomon，F.及Goodfellow，P.(1983)，「人類基因圖不斷向前展開」，Nature 306223～224頁)，但是，到目前為止，在高等植物的基因圖分析方面，進展很少(Polans，N.O.，Weeden，N.F.及Thompson，W.F.(1985)，「豌豆中rbcs及cab多基因家系的遺傳、機體組成及基因圖分析」，Proc.Nat′l.Acad.Sci.325083～5087頁)。特別要提一提的是，對西紅柿植株的作過基因圖分析的克隆DNA序列(順序)前此沒有有過任何報導。
西紅柿中的DNA標記物將為許多單純遺傳特徵的早期篩選以及深入了解複雜特性的遺傳機體形成提供一個基礎。這樣的篩選過程可以用於將人們所需要的特徵用基因滲入法滲入到西紅柿的種種品種中去。基於DNA序列的、良好的分布的連鎖圖可以提供有關植株基因組的演化。雜交到各探查物上的植株DNA片斷可以被認為是真正同源的，這樣，複製物及多基因系成員的基因組的分布就可以在不同種類或種屬之間進行比較。
本發明提供標記有大量cDNA克隆和同功酶標記物位點的西紅柿染色體的基因圖。cDNA克隆存放在In Vitro International並且可以通過找出西紅柿植株及所需或可觀察的培育特性之間的連鎖而與圖共同使用。這些連鎖是通過本技術領域：
內都熟悉的方法來建立的，即將所需特性的百分重組和cDNA標記物克隆進行比較，並且把具有所需特性的，百分重組值最低的，最好低於30%，(低於10%更好)的稱為有著所需特性cDNA標記物克隆。所需的特性可以畫在西紅柿基因組上，辦法是把它放在距離以前根據它和這些標記物的重組率已經作過基因圖分析的cDNA標記物一個經過計算的數目的圖單位上。cDNA標記物和可觀察到的特性之間的連鎖可以用來迅速地通過測試連鎖標記物RFLP特性的存在與否而測定出在西紅柿植株中是否存在或不存在這些特徵。這種用不著生長培育所有植株而能夠對遺傳材料進行測試的能力在育種中把所需特性用基因滲入法從一種西紅柿滲入另一種西紅柿時是非常有用的。
附圖的說明圖1是基於cDNA和同功酶的西紅柿連鎖圖。本發明的cDNA位點用CD數或克隆數表示。CD數後面的英文字母A，B，C，D只用來表示克隆第一、第二及多位點。帶有英文字母的克隆的名字被認為與不帶字母的克隆的名稱是等同的。其他DNA標記物是核糖核蛋白體RNA(R45S)，核酮糖二磷酸羧基岐化酶(Rbcs)的小的亞單位，主葉綠素a/b結合蛋白(Cab)及肌動蛋白(Act).所有其他標記物都是同功酶。染色體數標在上部，沿著邊線上的值是圖的距離單位是CM.不和任何已作過基因圖分析標記物連鎖的連鎖群在圖的下面示出。
圖2(A)是用克隆3-41(CD14)探查的L.Pennellii(P)及L.esculentum(e)的限制酶。左面的值是片斷的大小，單位是千鹼基。圖2(B)是逆代雜交的子代DNA(L.Pennellii作為輪迴親本)是用EcoRⅤ消化並用3-41進行探查的。
最優實施例(方案)的詳細描述本發明基於使用DNA限制片斷長度多形質(RFLP)來揭示從不同植株所取得的DNA的差別。
先從西紅柿分離出DNA並用限制性內切酶按本技術領域：
的人所熟知的方法切割成DNA片段。一種特定的限制性內切酶只在含有特定核苷酸序列(順序)的位點切割DNA，例如，限制性內切酶EcoRⅠ只切割GAATTC序列中的雙鏈DNA。每種限制性內切酶將把一特定植株的DNA切割成不同長度的片段。具體長度由限制性內切酶所識別的部位之間的距離而定。插入、消去、突變都能改變限制性內切酶識別部位之間的距離。
本技術領域：
內的人都知道，DNA片段可以用凝膠電泳技術按大小加以分離。當需要比較兩植株的DNA時，人們用同樣的限制性內切酶切割每一個DNA樣品，切割成的片段用電泳法按片段的大小(長度)加以分離。一個品種的許多片段，其長度可能和別的品種的片段不同。因為任何特定的片段都代表片段的一個很小的部分，所以用帶有特定順序(序列)的探查物來鑑別每一DNA樣品中的特定的同源片段從而可以對片段長度的大小進行比較。
本發明提供的一組獨特的cDNA探查物，用以鑑別不同西紅柿品種中的相應的DNA片段。這些探查物是用以下步驟(將在下面的舉例說明中加以詳細描述)製取的從西紅柿品種VF36中分離mRNA，用逆轉錄酶複製mRNA的雙鏈拷貝DNA(cDNA)，把cDNA插至細菌質粒，例如PBR322及PUC8，分離含有克隆的質粒供進一步測試之用。分離的質粒中含有大於約400～450鹼基對的cDNA插入(cDNA克隆)。所有以上這些步驟都是本技術領域：
內的人所熟知的。
各個單獨的cDNA克隆用放射性同位素標記以提供特定的cDNA雜交(雜化作用)探查物。這些CDNA探查物可以識別出任何西紅柿品種中的同源序列。西紅柿DNA片段，在經過電泳按大小進行分離之後，從電泳介質(一般是瓊脂糖凝膠)轉移到固體支承物(例如硝化纖維素或尼龍薄膜)這樣使在凝膠上分離在並被保存在薄膜上。此膜在探查物雜交到相應特定的DNA序列期間同放射性同位素探查物一起保溫。通過觀察探查物在薄膜上的位置，就有可能測定出相應於不同西紅柿品種的限制性片段之間的區別或「長度多形質(多態性)。此過程用不同的限制性內切酶及不同的探查物反覆進行直到出現一定數量的限制片段長度多形質(多態性)(RFLP)使兩植株的DNA能夠區別為止。
在雜交基質上只有為數不多的幾個DNA片段顯示對每一cDNA探查物的同源性，這一情況表明，每一單倍體西紅柿基因組相應基因只出現一次。大多數克隆雜交到不同的限制片段上，表明它們各白代表一個不同的基因。
然後取出一組獨特的(單拷貝)cDNA探查物，每一探查物鑑別西紅柿基因組上的特定的位點。這些探查物見後面的表3。它們都是根據它們在克隆過程期間原來的名稱及按照它們的位點命名的。整個庫包含質粒中的60個cDNA探查物都按照布達佩斯協議規定存放在密執安州48103，Ann Arbor，Jackson Road 7885號的Vitro International)庫房，存放日期是1986年3月19日。標題字是」西紅柿核cDNA克隆」，登記入冊號是IVI-10107。cDNA的名稱如下CD15;CD24;CD47;CD12;CD9;CD52;CD16;CD20;CD44;CD28;CD49;CD37;CD1;CD33;CD30;CD11;CD43;CD35;CD50;CD13;CD31;CD6;CD29;CD51;CD59;CD55;CD41;CD64;CD38;CD14;CD61;CD58;CD65;CD48;CD54;CD57;CD62;CD46;CD60;CD7;CD40;CD21;CD56;CD45;CD34;CD27;CD4;CD3;CD8;CD25;CD42;CD5;3-91;3-167;3-185;3-48;3-131;CD2;CD32及CD39。
使用若干不同的探查物及限制性內切酶分析不同植株的DNA，可以為每一植株建立一個DNA輪廓圖，這個輪廓圖實際上就是每一個品種中的RFLP變異體或等位基因。這些輪廓圖通過一種植株的DNA輪廓圖與另一植株的DNA輪廓圖進行比較時比較出現的RFLP而區別植株的品種。
本發明不僅提供了一種鑑定和區別植株品種的方法，而且，因為希望在計劃安排好的植株培育方案中使用cDNA克隆，相應於西紅柿染色體上每一cDNA克隆的DNA序列的位置也做成了圖譜。使用本發明的方法，西紅柿種種品種的各個特徵或可觀察到的特徵可以和具體的DNA標記物連鎖起來，這種連鎖被用於把所需的特徵轉移到別的品種上去。
cDNA克隆的圖譜陳述如下，圖1中用圖的形式示出了同樣的內容染色體1CD15-22CM-CD24-17CM-CD47-4CM-CD12-27CM-CD98及/或CD52A-5CM-CD9A及/或CD16B-5CM-CD16A及/或CD20-10CM-CD44-CM-CD28;
染色體2CD49B-1CM-CD37-7CM-CD1-7CM-3-91-15CM-CD33A-9CM-CD30B-14CM-3-131及/或CD11-25CM-CD43-4CM-CD35-6CM-CD9C-27CM-CD30A及/或CD33B;
染色體3CD50-2CM-3-167-7CM-CD13A及/或CD318及/或CD68及/或CD29C及/或CD52B-17CM-CD51;
染色體4CD59-5CM-CD49A-39CM-CD55;
染色體5CD41-9CM-CD64-8CM-CD31A-10CM-CD38B;
染色體6;CD14-8CM-CD13B-18CM-CD29B;
染色體7;CD61-3CM-CD58及/或CD65-8CM-CD48-57CM-CD54和或CD57染色體8;CD46-10CM-C60-10CM-CD7-10CM-3-185-26CM-CD40-1CM-CD21A及/或CD16C;
染色體9;無染色體10;CD56-7CM-CD45-15CM-CD38A-10CM-CD34B-10CM-CD34A;
染色體11;無染色體12;CD21B-1CM-CD27-7CM-CD4B及/或CD16D-2CM-CD6A-53CM-3-48未定位(配位)的連鎖群1)CD32A-11CM-CD3-3CM-CD82)CD29D-9CM-CD25B3)CC42-8CM-CD25A4)CD5-5CM-CD32B克隆3-48可以雜交到所有cab位點，但最好是雜交到cab-5位點(部位)。
本申請人的發明包括製備和鑑定上列特定的克隆，也包括測定這些克隆彼此之間的有用的關係如它們在染色體圖上的相對位置。其它以製備和可以代替上述克隆並且畫到染色體同樣部位(位點)的克隆與上面所述的克隆是等同的，在此，使用了順序的數字來命名它們，並且按照它們之間在染色體圖上的相對位置列出如下。應該理解，克隆1的功能與CD15等同，克隆2的功能與CD24等同，如此等等。每一用數字順序編號的克隆都是根據它和被提到的克隆與之雜交的染色體DNA相距染色體DNA0-10圖單位進行雜交的能力定義的。
染色體1克隆1-22CM-克隆2-17CM-克隆3-4CM-克隆4-27CM-克隆5-5CM-克隆6-5CM-克隆7-10CM-克隆8-1CM-克隆9;
染色體2克隆10-1CM-克
-7CM-克隆12-7CM-克隆13-15CM-克隆14-9CM克隆15-14CM-克隆16-25CM-克隆17-4CM-克隆18-6CM-克隆19-27CM-克隆20;
染色體3克隆21-2CM-克隆22-7CM-克隆23-17CM-克隆24;
染色體4克隆25-5CM-克隆26-39CM-克隆27;
染色體5克隆28-9CM-克隆29-8CM-克隆30-10CM-克隆31;
染色體6克隆32-8CM-克隆33-18CM-克隆34;
染色體7克隆35-3CM-克隆36-8CM-克隆37-57CM-克隆38;
染色體8克隆41-10CM-克隆42-10CM-克隆43-10CM-克隆44-26CM-克隆45-1CM-克隆46;
染色體10克隆47-7CM-克隆48-15CM-克隆49-10CM-克隆50-10CM-克隆51;
染色體12克隆52-1CM-克隆53-7CM-克隆54-2CM-克隆55-53CM-克隆56。
未定位(配位)的連鎖群1)克隆-57-11CM-克隆58-3CM-克隆59;
2)克隆60-9CM-克隆61;
3)克隆62-8CM-克隆63;
4)克隆64-5CM-克隆65。
將兩個品種的親本(L.pennellii及L.esculentum)進行雜交和逆代雜交，用L.pennellii作為回交親本(輪迴親本)，具體詳情見例2(Example2)所述，DNA標記物和已知遺傳標記物的分離在BC1後代中進行了評價。
這些已知遺傳標記物包括本技術領域：
的人所熟知的同功酶標記物，例如Tanksley，S.D.(1983)「植物育種中的分子標記物」Plant Mol.Biol.11 3～8頁所述的標記物。Tanksley，S.D.的文章在此列出作為參考。已知的西紅柿染色體圖包括本發明的DNA標記物及以前已知的標記物，該染色體圖如圖1所示。利用遺傳基因連鎖分析中已成熟的方法，用分離數據畫出了cDNA標記物在西紅柿基因組上的位置。這涉及到一個cDNA標記物和一已知標記物在其中共分離的子代百分比的計算。遺傳圖的距離是用兩位點間觀察到的重組百分比定義的。例如，如果一給定的DNA標記物和一以前已圖譜分析過的標記物共分離(100%)，那未重組百分比為零，則DNA標記物和以前已圖譜分析過的標記物的距離是0CM(Centimorgans;圖譜單位)。而10%重組率則表示與以前已圖譜分析過的標記物的距離為10CM，如此類推。下面的一些文章記論了使用RFLP進行遺傳圖譜分析法的已知的方法以及它們的各種實際應用。Beckmann，J.S.及Soller，M.(1983)，「遺傳改進中的限制片段長度多形質(多形態)方法論、圖譜及成本」Theor.and Appl.Genetics 6735～43頁;以及Soller，M.及Beckmann，J.S.(1983)，「品種鑑定及遺傳改進中的遺傳多形質(多形態)」，Theor，and Appl.Genetics 6725～33頁，這兩篇文章都列在這裡供參考。此外，還可以參考Burr，B.，Evola，S.D.，Burr，F.A.及Beckmann，J.S.(1983)，「應用限制片段長度多形質(多形態)於植物育種」，Genetic Engineering Principle and methods(遺傳工程原理及方法)(Setlow及Hollander編，遺傳工程原理與應用)卷5，45～49頁，這裡一併列出供參考。本發明的詳細圖譜可以用來把西紅柿植株的表現型特徵和某一特定的標記物或多個標記物連鎖起來。為了把西紅柿植株的可觀察到的特徵和一cDNA標記物克隆或同功酶標記物連鎖起來，觀察了該標記物的可觀察特徵的百分重組。通常把低於30%的重組率(表示圖距離為30CM或30CM以下)作為有用的連鎖，重組率最好是10%或低於10%。
更具體地說，在本發明的把一個可觀察到的性狀或特徵如高實心體內含和一cDNA克隆的連鎖中，選擇一具有可觀察到的特性的西紅柿植株和一沒有可觀察到的該特性的西紅柿植株。(可觀察到的特性是指可以用眼睛檢查、用物理或化學方法進行測試或其他方法觀察得到的特性並且包括通過使用探查物觀察到的RFLP)。將該兩親本進行雜交，F1子代或者進行自雜交或者進行逆代雜交以提供一群個體植株。這些個體植株進行分離以獲得現在已知的DNA標記物和可觀察到的特徵或性狀。從分離的個體提取DNA並用限制性內切酶進行處理，接著用凝膠電泳進行分開然後轉移到雜交載體上。在和一cDNA探查物進行雜交後，就可以測定每一個體中有哪些相應親本DNA片段存在，親本DNA的輸廓是前此已經測定的。這一過程用外加的cDNA探查物反覆進行以確定在每一個體分離子代中有哪些親本染色體或哪些親本染色體部份。最好所有cDNA探查物都使用以形成最大的分離信息。同功酶標記物也可以使用以提供進一步的信息。必要時可以用附加限制性內切酶以測定多形質(多形態)。
對每個分離個體進行記錄打分以獲得所需要的表現型特徵(例如高實心體的含量)。然後用遺傳連鎖分析法來分析已知標記物的可觀察到的特性的分離。對可觀察到的特性，重組超過時間的50%的授與親體的DNA標記物被認為是與控制該可觀察到的特徵的DNA序列沒有連鎖。出現30%或不到30%重組百分比的標記物可以認為是和該特性有著有用的連鎖。出現10%或10%以下重組的(與可觀察到的特性)被認為是與控制該特性的基因有緊密的連鎖。
事實上，可以先用一組為數不多的能夠揭示每一親本的親代染色體組成的標記物子集。然後使用一組針對特定的染色體的標記物。例如，如果在染色體5上的標記物表明與高百分比固體實心內含的連鎖具有中等程度，則可以再選一些染色體5上的標記物進行試驗，直到鑑定出一種對高百分比固體實心內含顯示最低重組的標記物為止。然後用重組頻率來畫出控制該可觀察到的特性的基因的基因圖譜。
具體說來，本發明的測定一西紅柿植株的可觀察到的特性和一cDNA克隆之間的遺傳關聯的方法包括(a)選擇一具有可觀察到的特性的西紅柿植株和一沒有可觀察到的特性的西紅柿植株作為親本進行雜交育種;(b)從親本植株提取DNA並對該DNA用限制性內切酶進行處理以獲得DNA片段，在一中性凝膠電泳中分離從每一植株來的片段並把電泳處理的片段轉移到一固體載體上以獲得每一植株的雜交基質;(c)將上述步驟(b)的基質與從本發明的cDNA克隆群中選出的表明可能含有相應於所述可觀察特徵的一個染色體或一未定位連鎖群的cDNA克隆進行雜交(例如，先前的實驗可以根據是否含有控制該特性的基因而指明或排除某些染色體);(d)比較每一植株的雜交型式以決定是否存在多形質(多形態);(e)重複步驟(b)～(d)，至少再使用一個選自那些表明可能含有相應於所述可觀察特性的其他染色體或未定位(配位)連鎖群的cDNA克隆及/或必要時增加使用限制性內切酶直到鑑定出多形質(多形態)為止，通過多形質(多形態)的鑑定，親本之間至少在每一染色體上或含有相應於上述可觀察到的特性的DNA的未給定的連鎖群上有一個可以使彼此有所區別的差異;(f)將親本植株雜交以獲得一F1子代。自雜交或逆代雜交F1子代以獲得一含有具有可觀察到特性的個體的分離子代;(g)選擇和評選具有統計意義數量的分離個體，最好至少對可觀察的特性有40左右的出現百分比;(h)從步驟(g)的分離個體提取DNA並且做步驟(b)～(e)以獲得當與不具有該可觀察到的特性的親本的基質相比時顯示多形質(多形態)的每一個體的雜交基質;(i)鑑別出位於該可觀察到特性的基因的10個圖單位以內的cDNA克隆;(j)如果鑑別不出這樣的cDNA克隆，鑑別出那些位於距控制該可觀察到的特性30圖單位(CM)以內的cDNA克隆;(k)再從本發明的cDNA克隆群中選擇cDNA克隆，該cDNA克隆在圖上的位置離步驟(j)的cDNA克隆不到30圖單位，將該克隆與步驟(h)的分離個體的DNA進行雜交;(l)鑑別出那些位於離控制可觀察到的特徵的基因10個圖單位(CM)以內的cDNA克隆;(m)如果鑑別不出這樣的cDNA克隆，再從本發明cDNA克隆群選擇若干cDNA克隆，該cDNA克隆的圖的位置比起具有較低百分比同一性的測試過的cDNA克隆來較接近於以前測試過的，具有高百分比特性的cDNA克隆，把所述克隆與步驟(h)的分離個體的DNA雜交並且鑑定出離控制該可觀察到的特性的基因不到10個圖單位的CDNA克隆;(n)如果鑑定不出這樣的cDNA克隆，重複步驟(m)直到這樣的克隆鑑定出為止。
除了cDNA克隆以外，同功酶和其他標記物也可以用來和具有可遺傳特徵進行連鎖，辦法是把具有該可觀察到特性的親本中每一同功酶的出現率與分離子代個體中的該可觀察到的特性的百分(比)出現率進行關聯。
控制該可觀察到的特性的DNA可以在染色體圖上定位，辦法是把它置於離特定標記物一定圖單位數的距離上，這個圖單位數對應於它和這樣的標記物的百分重組率。
本發明的cDNA克隆可以用來發展畫到基因組的同一或相鄰區域的另外的或替代克隆(由重組率定義的0圖單位)。例如，用本發明的一個cDNA克隆探查一個噬菌體或其他克隆庫，就可以鑑定另外的與該cDNA克隆有足夠同源性可以進行雜交的克隆。這種新鑑定的克隆可以利用限制性內切酶再進行子克隆，並對獲得的新鑑定的克隆或片段測試其和以前作過基因圖譜的cDNA克隆或連鎖特性的重組率。那些顯示0～10%重組率的就是和本發明已命名的克隆等價的替代克隆。這裡所述的方法中所用的雜交條件如例1(Exampe 1)所述。用眾所周知的已發表的方程式，凡是熟悉本技術領域：
的人都可以使用與這裡所描述的其他具有同等效果的雜交條件。例如利用Hames，B.D.及Higgins，S.J.編的(1985)，Oxford IRL出版社出版的「核酸雜交-一種實用的方法」(Nueleic Acid Hybridization A Practical approach一文所述的方程。這裡把這篇文章列出來供參考。
一旦建立了一項可觀察到的特性和一標記物之間的連鎖，就可以在植株生長的早期通過觀察已知與該特性連鎖的標記物的出現而鑑定其是否有控制該特徵的基因存在。因此，一項所需特徵就可以從一個西紅柿品種用基因滲入法滲入另一個具有其他所需特性的西紅柿品種中去。例如從一種野生西紅柿品種身上把一種抗鐮刀菌特性(除了這種特性外，這種野生西紅柿的其他特性都不足取)移入我們食用的西紅柿品種可以因為使用與抗鐮刀菌特性緊密連鎖的標記物而變得非常方便。如上面的例子所敘述的那樣，首先要鑑定出與控制抗鐮刀菌的基因緊密連鎖的DNA標記物。對從抗鐮刀菌供體與受體的雜交所得的分離子代進行測試，測試它是否具有此標記物。只有具有此標記物的那些個體才需要保留。例如，如果所需要的特性來自一個基因，則75%的個體可以捨棄。在此過程中，用外加的標記物來估記(評估)每一個攜帶抗鐮刀菌基因的個體代表每一親代基因組的程度，將最緊密地代表所需親代基因組的那些個體保留下來再和所需家植即我們食用的品種進行逆代雜交循環。逆代雜交和篩選一直進行到得到對所需特性來說是純合子但其他方面DNA輪廓非常接近家植親本的個體為止。這一方法的最為關鍵的優點是，它使育種者只要用最小的田間試驗就可以很快地找到所需的基因型具體地說，一種人勻所需要的特性可以從一西紅柿植株轉移到另一種西紅柿中，其步驟是(a)把所希望的特性和從本發明的標記物中選擇的一個標記物，圖1的同功酶或其他標記物進行連鎖;(b)用本發明的cDNA探查第二個西紅柿品種的DNA以測定它的DNA輪廓;(c)把一具有所需特性的西紅柿植株和另第二西紅柿品種的植株進行雜交培育以獲得一F1子代;(d)用連鎖的標記物篩選出對所需特性是純合的F1個體;(e)用本發明的cDNA探查具有所需特性的F1個體的DNA以測定它們的DNA輪廓;(f)選擇具有所需特性以及與第二西紅柿品種的親體的輪廓最相似的DNA輪廓的F1個體進行培育;(g)把步驟(f)的經選擇的個體和第二西紅柿品種的一個親本進行逆代雜交以產生-BC1子代;(h)用連鎖的標記物篩選具有所需特性的BC1個體;(i)用本發明的cDNA探查具有所需特性的BC1個體的DNA以測定它們的DNA輪廓;(j)選擇具有所需特性的並具有與該第二西紅柿品種的親本的DNA輪廓相似的DNA輪廓的BC1個體;(k)對BC2及其後的子代重複步驟(g)～(i)直到產生對所需特性是純合的以及與第二西紅柿品種的親本具有所需相似度的個體為止。
使用本發明的克隆測試遺傳材料有沒有控制某些特性的DNA的這種能力的一個重要用途是把抗疾病基因用基因滲入法滲入已經具有別的控制抵抗該同一疾病的基因的植株品種中。當植株具有幾種不同的控制對某一疾病抵抗的基因時，對該疾病的總的抵抗力就比較大，但是很難測試出植株中是否有多種疾病抵抗基因存在，因為一種抵抗基因的存在對別的基因的抵抗性的鑑定起著掩蓋作用。採用本發明的作過基因圖分析的標記物鑑定別的抵抗基因使培育者可以容易地選擇出多種抗病基因並把它們培育到已經有某種抗病基因的品種中去。
本發明的cDNA標記物，染色體圖以及篩選方法對另外的許多場合也是有用的，這一點對熟悉本技術領域：
的人來說是顯而易見的。例如，這些標記物及方法可以用於非親緣雜交率的估計，鑑定有性及體細胞雜交(超性雜交)種，鑑定多年生植物苗圃中的培育用的原種，量度遺傳變異性，測定雜交種籽的遺傳純度，鑑定專利保護植物品種和重組DNA範圍的侵權，鑑定來自其他培養物的單倍體衍生植物等。
例1每克隆的位點數cDNA的合成和克隆。按照Kamalay及Goldberg(1980)，「菸草中結構基因表達的調節」，Cell 19935～946頁，及Jackson、Larkin(1976)，「離子強度、PH及兩價金屬的螯合對菸葉多核糖體分離的影響」，Plant Physiol.575～10從西紅柿品種L.esculentum VF36的嫩葉中分離出多核糖體，上述兩文都在這裡註明出處供參考，按照製造廠商的說明書(BRL)用寡-dT纖維素提純多腺苷酸mRNA，然後按照Murray，MG，Hoffman，L.M.及Jarvis，N.P.(1983)，「通過控制早熟抗補體DNA合成提高全長phaseolin cDNA克隆的得率」，Plant Molec.Biol.275～84頁(Approach C以多Am RNA作模板合成雙鏈C尾cDNA，上述文章在這裡註明出處以供參考。將大約20ng的cDNA退火到80ng的dG尾PstⅠ切割的p BR(BRL)用以轉化競爭株HB101細胞，這可以按照Mandel，M，及Higa，A.(1970)，「與鈣有關的噬菌體DNA感染」，J.M01.Biol.53154，Dagert，M.及Erlich，S.D.(1979)，「延長在氯化鈣中培育提高Escherichia coli細胞的感受性(感受態)」Gene623，一文的方法實現，上述文章這裡註明出處以供參考。
質粒DNA的分離及插入物大小的測量。在1.5毫升培養物中生長TetR及AmpS集落，然後按照Birnboim，H.C.及Doly，J(1979)，「篩選重組質粒DNA的快速提取法」，Nucleic Acids Res.71513，分離質粒。質粒用PstⅠ消化並經過0.9%瓊脂糖凝膠處理而以經HaeⅢ消化過的φX174 DNA作為大小標準。其質粒的插入物大於400鹼基對的細菌在大的培養物中生長。用一種類似的方法分離經過Cs Cl平衡密度梯度離心作用進一步提純的質粒(Maniatis，T.，Fritsch，E.F.及Sambrook，J.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，93～94頁。
基因組DNA分離。從個體植株的約25克新鮮葉組織中提取了植物全細胞DNA。所用方法是Murray，M.及Thompson，W.F(1980)，「高分子量植物DNA的快速分離」，Nucl.Acid Res.84321～4325，一文中所述的方法，其中部分作某些改進。上述文章在這裡註明出處以供參考。該組織在高速混和器中用150毫升提取緩衝液中打成勻漿(100mM Tris(三羥甲基氨基甲烷緩衝劑)PH8.0.0.35M Sorbitol(山梨糖醇)，5mM EDTA(乙二胺四乙酸)及1.0%β巰基乙醇)，通過乾酪包布/Miracloth過濾(Calbiochem)並在JA10轉子以700Xg的速度旋轉15分鐘(Beckman)。每小片重新在5毫升提取緩衝劑裡懸浮並轉移到50毫升螺旋帽離心管。重新懸浮的懸浮液調節到1.0%CTAB(Hexadecyltrimethylamminium bromids，六癸基三甲基溴化銨Sigma)，IM Nacl，25mM EDTA。然後調節到1.0%肌氨酸Sarcosyl並加熱到60℃為時20分鐘。用氯仿/辛醇(24∶1v/v)提取溶胞產物。該水相與三分之二體積異丙醇混合以沉澱DNA。用76%乙醇，10mM醋酸銨PH7.0洗滌沉澱物。溶解該DNA然後進一步用Cs Cl/溴乙錠離心法進一步提純(Maniatis等，1982，Supra)。
遺傳原種。在Lycopersicon esculentum CV.VF36(LA916)和野生種Lycopersicon pennellii(LA716)之間進行雜交。兩個親本都是高度近親交配的。對F1雜交物進行自交獲得了F2種子。
限制性消化，電泳，吸附，雜交及缺口轉譯(切口複製)。上述每一親本原種及46F2子代的DNA用下列限制性內切酶進行消化DraⅠ(New England Biolab)，EcoRⅠ，EcoRⅤ，HindⅢ，BstNⅠ，SstⅠ，PstⅠ及XbaⅠ(都是BRL的)進行消化。消化物經過0.9%瓊脂糖凝膠處理並根據Southern，E.M.(1975)，「在經電泳分離的DNA片段中除去特定的序列」J.Mol.Biol.98503～517頁，用Zetabind過濾器中吸附(AMF Cuno)。在濾器上用36放射性同位素標記的含有隨機(不規則cDNA插入物質粒的每一個進行探查。質粒的切口複製(缺口轉譯)按Rigby，P.W.J.，Dieckman，M.，Rhodes，C及Berg，P.(1977)，「用DNA聚合酶Ⅰ缺口轉譯在體外把脫氧核糖核酸標記到高度專一活性」，J.Mol Biol.113815～817頁一文所述的方法進行並產生108～109dpm/μg的專一活性。濾器在一含有5XSSC，50mM Na H2PO4PH7.4，0.4%SDS，5×Dennardt′s，2.5mM EDTA，5%硫酸葡聚糖(dextran sulfate)及100μg/ml切變、變性salmon測試DNA的溶液中在65℃的溫度下前(預)雜交6～12小時。標記的探查物然後以106dpm/ml的速率加入。雜交在65℃發生12～24小時，之後，在2×SSC，0.1%SDS洗滌兩次計20分鐘，在1×SSC，0.1%SDS在65℃溫度下洗滌兩次。洗滌過的過濾器放在Kodak XAR-5 X射線底片上12～72小時，溫度為-70℃，使用的是Dupont公司的Cronex Lightening-Plus增強性濾網。
重組實驗。為了得到基因組拷貝數量的估計值、在重組實驗中使用了含有克隆得來的西紅柿c DNA片段的幾個個體質粒。按照Rivin，C.(1986)在「分析植株中基因組的變異」，Meth.Enzymol.11875～85頁一文中所述的方法把變性植株DNA的兩個1μg的部分用縫槽-吸附(Slot-blot)樣板直接放到Zetbind濾器上。在同一Zetbind濾器上，還加上了不同數量的攜帶有特定西紅柿cDNA克隆的變性質粒。質粒的數量大約加到在1μg植株DNA中能得到0.5，1及3拷貝西紅柿插入物的數量。重組中所用的質粒數量是基於文獻報導的0.74pg西紅柿C值＝7.14×108鹼基對而定的(Galbraith，D.W.Harkins，K.R.，Maddox，J.M.Ayres，N.M.，Sharma，D.P.，Firoozabady，E.(1983)，「完整植株組織中細胞循環的快速流測曲面量度分析」，Science 2201049-1051.)每個濾器然後和相應的放射性同位素標記的西紅柿插入物進行雜交。雜交以後濾器洗滌到0.2×SSC的程度，溫度為65℃。所得到的放射自顯影用光密度計進行光密度掃描。相應於0.5，1，3的密度相對於拷貝數畫成圖以估計這兩變量之間的線性關係。所得的圖接著用於估計同一底片上植株DNA的樣品中序列的拷貝數。每一測試的克隆估計出最小兩個最多4個獨立的重組估計值。3-41是唯一的例外，3-41隻做一個估計值。對每一克隆的拷貝數估計值計算了平均值和平均標準誤差(表1)。克隆這裡的是按照它們的位點(CD數)及它們的定位(配位)數命名的。這些名字是等效和可以互換的。表2列出了名字和位點的相互對照關係。
表1拷貝數估計用的克隆。注意Ave.no.RF′S-欄中(的限制片段)是基於用DraⅠ，EcoRⅠ，EcoRⅤ，HindⅢ，BstNⅠ消化的。
克隆 鹼基對 位點 Ave.no. 最小RF 拷貝數估計值RF′S 長度平均限制 (鹼基對)片段數 X SX3-17 1250 CD2 1.00 3.7 0.7 0.103-14 400 CD3 1.20 1.0 1.7 0.342-14 550 CD5 1.00 1.0 2.1 0.872-24 625 CD8 1.80 4.5 4.1 0.403-41 650 CD14 1.75 3.1 1.9 -3-82 575 CD15 1.40 1.0 2.1 0.40光密度掃描。用放射自顯影術所得的底片在一臺Bio Med軟雷射掃描光密度計進行了掃描，對應於各波段的面積並用Bio Med軟體在APPⅠeⅡ計算機上進行了積分。
結果業已獲得大約100個cDNA克隆的插入物大小的估計值(bp)。大約50%插入物大於400bp。對具有小於400bp插入物的克隆未作進一步估算。
在插入物大於400bp的克降中，36被單獨地進行缺口轉譯，並雜交到兩個親本蕃茄(西紅柿)物種之DNA的限制消化所得到的濾體(過濾器)上。在大多數情況下，只有少數基因組片段顯現出與探查體(探查物)的同源性，這意味著植物基因組中的各個基因並非以高複製數出現，大部分克隆雜交到不同的限制片段上，由此表明它們分別代表不同基因。僅僅克隆3-91和3-167是例外，這兩種克隆的雜交圖象與克隆3-185和3-131相同。這些克隆組的圖譜實際上與以前分別與二磷酸核酮糖羧化酶(RBCS)的小亞單位和主吐緣素a/b結合多肽(CAB)的異種克隆雜交所得的圖譜相同(Vallejos，C.E.，Tanksley，S.D.和Bernatzky，R.(1986)，「含有與r RNA(45s)、主葉綠素a/b結合多肽和二磷酸核酮糖羧化酶基因同源的順序(序列)的DNA限制片段之蕃茄(西紅柿)基因組的定位」，Genetics 11293-105)。3-91和3-167與矮牽牛屬植物(pSSU71)(Dunsmuir，P.S.Smith，S.Bedrook，J.A.(1983)，「二磷酸核酮糖羧化酶小亞單位的一些不同核基因在矮牽牛屬植物中的轉錄」Nucleic Acid Res.114177-4183)cDNA RBCS克隆的雜交證明這兩個蕃茄克隆確實適合於RBCS。同樣，雜交到綠豆CAB cDNA克隆(pMB123)(Thompson，W.F.，Everett，M.，Polans，N.O和Jorgensen，R.A.(1983)，「在碗豆和綠豆葉子生長過程中RNA含量對植物色素的控制」，Planta 158487-500)的克隆3-185和3-131證實了對它們所推測的同一性。
每個克隆的位點數採用親本檢測，並用一個給定克隆作為探查物，以選出在兩個親代之間共用的雜交片段數最少的這種圖象的限制酶。含有F2 DNA(來自46株植物)的濾體(過濾器)經這些所選出的酶消化後，用標記質粒探查，以探測限制片段的分離。共分離的片段被認為是屬於相同位點，而不能共分離的片段，則認為屬於不同的位點。因此，對探測出的位點均給於位點標號(表2)。各位點的分離比也示於表2。
所估算的34個獨特克隆中的28個，其95%以上的基因組雜交信號(由放射性自顯影的密度計掃描測得)可歸因於分離的片段(表2)。另外4個克隆中所引起的信號在85%以上。而一個克隆，即3-31，僅能引起60%的信號。
基於對34個克隆所進行的遺傳分析，有可能確定相應於每個cDNA克隆的位點數(表2)。53%克隆(18個克隆)雜交到屬於單個染色體位點的基因組片段上;而32%(11克隆)相應於二個位點。其餘的克隆中，有兩個克隆(6%)相應於3個位點，兩個相應於4個位點(6%)，而一個相應於5個單獨的位點(3%)。無一克隆屬於安排在5個位點以上的基因族。
多位點克隆 對同源於1個以上位點的克隆，基因組雜交信號在所有位點上的分布(來自放射性自顯影)常不相同(表2)，例如，克隆3-87雜交到兩個獨立位點-CD13A和CD13B。然而，CD13A的雜交信號約為CD13B的5倍(表2)。。當基因組DNA用4種不同的限制酶消化，並雜交到3-87中，則相應於CD13A和CD13B的基因組DNA片段的大小往往比較短(小於3.0kb)。在3-87長約750bp的條件下，似乎難以確定是否在每個位點有可容納1或2個以上的結構基因複製體的餘地。這意味著CD13A和CD13B之間的不同雜交信號並非由於各位點中基因複製體數目的差異，而可能是兩個位點中所容納的結構基因的重要順序分岐的結果。
在同源於兩個位點的其他10個克隆(2-23，3-6，3-93，3-99，3-140，3-136，3-159，3-190，3-176，3-275)中，7個給出與3-87類似的結果，即一個位點產生多得多的雜交信號(表2)。對於其中一些克隆不能排除這樣的情況，即給出最大雜交信號的位點具有1個以上的基因複製體。
三個克隆(3-91，3-167，2-21)系來自三個單獨位點中存在的基因族。通過將來自矮牽牛屬植物的此基因雜交到異種克隆上，發明這二個克隆(3-91和3-167)為二磷酸核酮糖羧化酶的小亞單位(pSSU71，Dunsmuir et al.1983，supra)。3-91和3-167的雜交圖象與所報導的將茄蕃基因組DNA雜交到矮牽牛屬植物RBCS克隆上的雜交圖象非常相似(Vallejos et al.1986，supra)。事實上，用同源蕃茄探查物未揭示新的雜交片段，這意味著以前用異種矮牽牛屬植物克隆的研究中所報導的位點數(3個位點)也許是正確的。
克隆2-21與3個遺傳位點CD9 A，CD9 B和CD9 C雜交，強度大致相同。此結果可能是由於以下述情況之一1)導致三個位點的複製活動是最近的活動，對於還沒有足夠的時間產生重要的順序分岐的足夠時間並未消逝;2)這些基因處強選擇壓力下降低了分歧速率;3)基因通過某種尚未知曉的機理共同進化。而屬於茄科族親緣屬的胡椒(辣椒屬annuum)僅有一個同源於2-21的位點之發現，則支持了第一種解釋。
業已發現兩個克隆(3-95和3-155)各相應於四個位點。對於3-95來說，其中3個位點(CD16A，CD16B，CD16C)產生大致相同的雜化強度，而第4個位點-CD16C給出的雜交信號約為其他位點的1/3(表2)。相應於3-155的位點具有不同的雜交強度，意味著每個位點的基因數各不相同，或者在位點之間有顯著的分岐。
雜交到4個以上位點的克隆僅有3-185和3-131。對於主葉綠素A/B結合多肽(CAB)經豆克隆的雜交(pMB123，Thompson et al.1983 supra)揭示了這些克隆均系從CAB基因中得到。最近已發表了通過與綠豆異種克隆的基因組雜交所確定的蕃茄(西紅柿)CAB順序的遺傳學(Vallejos et al.(1986)，supra)。此處所報導的從兩個蕃茄cDNA克隆所得的雜交圖譜與用綠豆探查物所得的圖譜相似，反映了該基因編碼區的高度保守性。
表2相應於隨機cDNA克隆的蕃茄基因組中位點特性[除另行註明外，x2的吻合度(擬合優良度)為1∶2∶1的比例。雜交信號百分數系由放射自顯影的密度計掃描測得(參見材料和方法)]
克隆大小測得的位點標號雜交信號 e/e e/p p/p x2(鹼基對)位點數 %2-13 2450 1 CD1 100 5 25 15 5.003-17 1250 1 CD2 100 11 20 12 0.253-14 400 1 CD3 100 8 23 14 1.622-23 600 2 CD4A 52 7 27 12 2.48CD4B 48 7 25 13 2.162-14 550 1 CD5 100 6 25 13 3.053-6 900 2 CD6A 95 7 24 13 2.00CD6B 5 30 12 0.26 A3-13 600 1 CD7 100 10 20 13 0.632-24 625 1 CD8 100 8 24 14 1.652-21 no site j CD9A 35 13 17 12 1.57CD9B 35 13 17 12 1.57CD9C 30 2 25 15 9.57 ＊＊3-50 625 1 CD11 100 14 24 4 5.623-31 550 1 CD12 60 5 24 15 4.913-87 750 2 CD13A 83 4 30 12 7.04 ＊CD13B 17 9 24 13 0.783-41 650 1 CD14 100 9 22 11 0.293-82 575 1 CD15 100 8 17 18 6.53 ＊＊3-95 750 4 CD16A 33 15 19 10 1.95CD16B 25 15 16 13 3.45CD16C 31 35 11 0.03 ACD16D 8 31 13 0.48 A3-109 700 1 CD20 100 15 21 10 1.433-93 575 2 CD21A 10 11 23 12 0.04CD21B 20 7 21 16 3.773-111 575 1 CD24 100 5 19 16 6.15 ＊3-99 550 2 CD25A 80 8 28 8 3.27CD25B 20 9 20 13 0.863-132 550 1 CD27 100 7 23 16 3.523-152 500 1 CD28 100 14 23 9 1.093-155 650 4 CD29A 58 12 17 15 2.68CD29B 15 6 29 9 4.86CD29C 7 6 26 12 3.09CD29D 7 9 22 13 0.733-140 900 2 CD30A 88 6 28 11 3.80CD30B 12 3 18 21 16.53 ＊＊3-126 775 2 CD31A 95 9 24 10 0.63CD31B 5 2 15 5 3.373-159 700 2 CD32A 63 4 26 16 7.04 ＊CD32B 37 6 24 9 2.54
3-190 550 2 CD33A 90 5 20 19 9.27 ＊＊CD33B 10 4 11 7 0.823-176 600 2 CD34A 28 3 25 17 9.27 ＊＊CD34B 60 3 28 15 8.43 ＊3-231 1300 1 CD35 100 6 21 15 3.863-288 1125 1 CD37 100 8 23 15 2.133-275 775 2 CD38A 20 2 26 14 9.24 ＊＊CD38B 80 10 23 9 0.433-287 1250 1 CD39 100 9 20 16 2.733-249 575 1 CD40 100 12 22 12 0.09(3-91，650 3 Rbc-1＝A 8 6 24 15 3.803-167) 400 Rbc-2＝B 43 5 28 12 4.87Rbc-3＝C 48 5 25 14 4.50(3-185，625 5 Cab-1＝A 62 5 26 14 4.693-131) 600 Cab-2＝B 5 12 21 12 0.20Cab-3＝C 22 8 25 10 1.33Cab-4＝D 8 15 23 6 3.77Cab-5＝E 3 8 32 4 9.82 ＊＊A未發現Allelic L.pennllii限制片段。F2分離數據係指L.esculentum等位基因存在(第1個數)或不存在(第2個數)。X的擬合優良度為3∶1的比例。
0.05的顯著偏差0.01的顯著偏差位點大小的估計值近交系L.EsulentumCV VF36的基因組DNA用DraⅠ，EcoRⅠ，EcoRⅤ，HindⅢ和Bst NⅠ限制酶消化。所得的Southern氏汙斑(Southern blots)進而用所知的相應於單個位點的6個克隆，即3-17(CD2)，3-14(CD3)，2-14(CD5)，2-24(CD8)，3-41(CD14)和3-82(CD15)逐一進行探查。大部分克隆僅雜交到一個限制片段上。對於任何給定消化的雜交限制片段的平均數和最小長度示於表1。最小限制片段長度被認為相當於遺傳位點編碼部分大小的估計值。這一分析的結果表明，在考慮之中位點大到足以容納一個或幾個基因複製體(表1)，並已為基因組重組實驗所支持(參見下文)。
每個位點的基因複製數在以上列出的相同克隆上進行基因組重組實驗(參見材料和方法)，試圖獨立地估計每個位點中存在的基因複製體數。6個克隆中有5個克隆的複製估計值相當於每個位點容納1或2個基因複製體(表1)。克隆2-24(CD8)具有較高的估計值(4個複製體)。也已發現這種克隆通過用大多數限制酶進行基因組消化而雜交到一個以的片段上。從分離數據確定，所有這些片段均屬於相同的位點。這一信息，並連同較高複製數的估計值意味著該位點可以容納幾個基因複製體。
例2 位點圖植物材料分離群體系從蕃茄屬esculentum(LA1500)和L.pennelli(LA716).親交系之間的雜交而得到。對L.pennellii(雄蕊親代)的回交和對46株植物中的BCI群體一一予以分析。上述兩個親本系在下列同功酶位點處存在等位基因差Aco-1，Aco-2，Aps-1，Aps-2，Pgm-1，Pgm-2，6Pgdh-2，Skdh-1，Prx-1，Prx-2，Prx-4，Pgi-1，Tpi-2，sod-1，Sod-2，Est-3，Est-7，和Est-8.除Sod-1，Sod-2和Est-8外，所有同功酶以前均被繪製成圖(Tanksley，S.D.(1985)「蕃茄(蕃茄屬esculentum)中酶編碼基因」，Isozyme Bull.1843-45，此處列入以供參考)。有關同源於主葉綠素a/b結合蛋白質(Cab)、二磷酸核酮糖羧化酶(Rbcs)的小亞單位和核糖體RNA(R45s)的大亞單位的基因組順序的同功酶標記物的連鎖分析業已由Vallegos et al.(1986)supra報導(列入此處僅供參考)，此研究工作提供了用以標繪隨機cDNA克隆圖的附加分離位點。
在這些群體中分離的同功酶並不代表染色體5，9和11。為在染色體5上試驗cDNA標記物，使用雜交(L.esculetum x L.pennelli)的後代，分離作為形態標記物af和tf，如Rick，C.M.[(1980)，「蕃茄連鎖研究」，Rep.Tomato Genet.Coop，302-17)]所述，這兩種形態標記物業已配位到上述染色體中。
DNA抽提物 採用例1所述的Murray和Thompson(1980)，supra的稍加改進方法，從植物材料中提取DNA。
m RNA分離和cDNA克隆按例1所述的方法將全部多腺苷酸葉m RNA分離出來，並克隆到p BR322中。
限制消化、電脈、suthorn氏吸附和雜交親本系的DNA和它們的後代分別用下述限制酶消化DraⅠ，HindⅢ(New England Bio Labs)，EcoRⅠ，EcoRⅤ，SstⅠ，PstⅠ和XbaⅠ(Bethesda Research Labs)。按例1所述方法進行植株DNA電泳、Southern氏除去特定序列(吸附)、雜交和探查物的缺口轉譯。
cDNA篩選對隨機cDNA克隆進行插入體(物)大小的篩選，將插入體(物)大於450鹼基對(bp)的那些克隆用作探查體。親本DNAs用各種限制酶消化，電泳、吸附處理，以及用cDNAs探查，以確定產生片段長度多態性酶(圖2a)。然後將合適的酶用於後代DNA。對於回交後代，將L.pennellii用作輪迴親本，以致僅有L.esculentum片段分離為有或無。對於每個位點，F2後代分離成預計的三種基因型，並偶爾向L.pennelliii純合體偏斜。
連鎖分析採用SAS Proc Freq軟體程序，在Amdahl 470/V5計算機上完成了基於X分析的同功酶標記物和cDNA順序的獨立分類的雙向偶然性試驗。若x概率值大於0.05，則認為位點是獨立的。染色體圖距離(CM)系根據Allard，R.W(1954)，「簡化遺傳重組計算用的公式和圖表」，Hilgardia 24235-278(列入之內僅供參考)所述的最大似然方程式進行計算。
表3 cDNA克隆，每個克隆的位點數及其配位的染色體克隆 位點標號 染色體配位 克隆 位點標號 染色體配位2-13 CD1 2 3-176 CD34A 103-17 CD2 CD34B 103-14 CD3 3-231 CD35 22-23 CD4A 3-288 CD37 2CD4B 12 3-275 CD38A 102-14 CD5 10 CD38B 53-6 CD6A 12 3-287 CD39CD6B 3 3-249 CD40 83-13 CD7 8 3-217 CD41 52-24 CD8 3-218 CD422-21 CD9A 1 2-17 CD43 2CD9B 1 3-4 CD44 1CD9C 2 3-10 CD45 103-50 CD11 2 3-16 CD46 83-31 CD12 1 3-27 CD47 13-87 CD13A 3 3-38 CD48 7CD13B 6 3-44 CD49A 43-41 CD14 6 CD49B 23-82 CD15 1 3-81 CD50 33-95 CD16A 1 L4 CD51 3CD16B 1 L1 CD52A 1CD16C 8 CD52B 3CD16D 12 L3 CD54 73-109 CD20 1 L2 CD55 43-93 CD21A 8 L5 CD56 10CD21B 12 L9 CD57 73-111 CD24 1 L17 CD58 73-99 CD25A L16 CD59 4CD25B L13 CD60 83-132 CD27 12 L18 CD61 73-152 CD28 1 L20 CD62 73-155 CD29A L22 CD64 5CD29B 6 L10 CD65 7CD29C 3CD29D 3-91，Rbc-1 23-140 CD30A 2 3-167 Rbc-2 3CD30B 2 Rbc-3 23-126 CD31A 5CD31B 3 3-131，Cab-1 23-159 CD32A 3-185 Cab-2 8CD32B 10 Cab-3 33-190 CD33A 2 Cab-4 7CD33B 2 3-48 Cab-5 12
克隆3-41(CD14)的限制酶抽樣檢驗示於圖2a。四種不同限制酶用於消化二個親本DNAs。如圖所示，限制酶EcoRⅤ和BstNⅠ適用於區分這兩個親代(L.esculentun的Bst NⅠ片段較小，並逸出凝膠)。BC和F2後代DNA用EcoRⅤ的消化示於圖2b和2c。僅L.esculentun(非輪迴親本)和雜交基因型分離出回交後代，而所有三種基因型均顯示於F2。
一個連鎖分析的例子示於表4。部分染色體2之標記體的對偶連鎖值列於此表中，同時也指出了獨立試驗的X2概率大小。雖然推想的基因序列通常可單獨地從對偶連鎖比較而導出，但三點連鎖試驗常用於證實聯接標記體的直線序例。
表4在部份染色體2上的標記物間的連鎖關係(表中數值以cM為單位，其X2數值置於括號內。相應於概率大於0.05的X2值被認為是不重要的(NS)。
Cab-1 Est-7 Prx-2 CD35 CD9C Rbcs-3 CD30ACab-1 - 12.8 23.2 23.5 NS NS NS(0.001) (0.007) (0.001) (0.211) (0.727) (0.832)Est-7 - 8.5 14.2 25.9 25.9 NS(0.001) (0.001) (0.002) (0.047) (0.147)Prx-2 - 10.0 15.0 18.8 NS(0.001) (0.001) (0.001) (0.069)CD35 - 6.4 13.1 24.7(0.001) (0.001) (0.015)CD9C - 13.0 21.7(0.001) (0.024)Rbcs-3 - 13.8(0.001)
推出的基因序列Cab-1 Est-1 Prx-2 CD35 CD9C Rbc-3 CD30A
13 8 10 6 13 14大多數蕃茄(西紅柿)染色體的cDNA標記物已標製成圖(圖1)。染色體1，2和12均很好地進行了標記。例如，在染色體2，包括同功酶和DNA片段的標記體之間的距離平均約為8cM，而這些標記物所復蓋的全部染色體圖的距離為115cM。全部的現已繪成圖的同功酶和DNA標記物所復蓋的標記物之間的距離約為779cM，並且有能力在每端外至少再探測出10cM的距離。以整個基因組的估計值為1200cM計，則這些標記體能探查88%以上蕃茄基因組的連鎖。
由於若干cDNA標記物與本研究中所用的已繪製成圖的任何標記體沒有連鎖，因而未將它們配位到染色體位置上。未配位的連鎖群示於圖1的底部。未顯示任何連鎖的單個克隆列於表3，並由缺少染色體配位而加以識別。染色體5沒有任何與其相關的分離同功酶標記物。然而，使用了一種具有業已配位到這一染色體的形態突變體的原種。從F2群體(L.esculentum X L.pennellii)的20個個體中分離出DNA，後者分離得到染色體5上的兩個標記體(af和tf)，並使各種未配位的連鎖群受這些標記體的檢驗。cDNA標記物CD41顯現了與tf的緊密連鎖，以致由CD38B，CD31A和CD41所組成的連鎖群能被配位到染色體5上。在染色體9和11上無參考標記物，因而可能一些(若不是全部的話)未標繪成圖的標記物存在於這些染色體上。
大部cDNA片段被發現是相應於單個染色體位置的。然而一些克隆用安排為2、3或4個位點的順序表示(表3)。這些多位點克隆中，大多數在成員之間表現出遺傳獨立性，亦即位點分散在整個基因組中。例如，用3-275(CS38A和B)以及F2群體的後代DNA探查的親本DNAs的限制酶檢測表明，該克隆能和兩個親本DNAs的兩個片段雜交，並如後代DNA所示，這兩個片段代表兩個遺傳上獨立的位點。但對多位點克隆的獨立性有一些例外。兩個均雜交到片段兩個位點上的克隆2-21(CD9)和3-176(CD34)在重複位點之間的連鎖值分別為5和10cM(圖1，染色體1和10)。一些其他的多位點克隆包含位於相同染色體上的成員，雖然它們相隔50cM以上(圖1)。從染色體2上可以看出，代表CD30，CD33和Rbcs的克隆被聯結成兩束，意味著一個相當大區段的重複。
上述例子系用於說明本發明，而並非對這些發明的範圍進行限制。
正如上面所討論的那樣，本發明的標記物是用統計方法製圖的。圖距與圖1中距離上下5～10cM仍在本發明的等效範圍之內。
權利要求
1.一對應於西紅柿(蕃茄)DNA的cDNA庫，包括至少兩個選自一個組群的克隆，該組群由下列組成CD15；CD24；CD47；CD12；CD9；CD52；CD16；CD20；CD44；CD28；CD49；CD37；CD1；CD33；CD30；CD11；CD43；CD35；CD50；CD13；CD31；CD6；CD29；CD51；CD59；CD55；CD41；CD64；CD38；CD14；CD61；CD58；CD65；CD48；CD54；CD57；CD62；CD46；CD60；CD7；CD40；CD21；CD56；CD45；CD34；CD27；CD4；CD3；CD8；CD25；CD42；CD5；CD32；3-91；3-167；3-185；3-48；3-131。
2.權利要求
1的cDNA庫，其中所述的兩個克隆選自同一染色體。
3.權利要求
1的cDNA庫，該庫包括所有權利要求
1的克隆。
4.一選自組群的cDNA克隆，該組群包括CD15;CD24;CD47;CD12;CD9;CD52;CD16;CD20;CD44;CD28;CD49;CD37;CD1;CD33;CD30;CD11;CD43;CD35;CD50;CD13;CD31;CD6;CD29;CD51;CD59;CD55;CD41;CD64;CD38;CD14;CD61;CD58;CD65;CD48;CD54;CD57;CD46;CD60;CD7;CD40;CD21;CD56;CD45;CD34;CD27;CD4;CD3;CD8;CD25;CD42;CD5;3-91;CD32;3-167;3-185;3-48;3-131.
5.一包含權項要求4的一個cDNA克隆的質粒。
6.權利要求
5的質粒包含pBR322或pUC8。
7.一對測定西紅柿染色體上的一西紅柿DNA片段的原位置或位置有用的染色體圖，該圖包括至少一個染色體或一未定位連鎖群的圖示，其中的標記物按序列次序彼此相隔的距離以圖單位(CM)表示如下染色體1CD15-22cM-CD24-17cM-CD47-4cM-CD12-27cM-CD9B和/或CD52A-5cM-CD9A和/或CD16B-5cM-CD16A和/或CD20-10cM-CD44-1cM-CD28;染色體2CD49B-1cM-CD37-7cM-CD1-7cM-3-91-15cM-CD33A-9cM-CD30B-14cM-3-131和/或CD11-25cM-CD43-4cM-CD35-6cM-CD9C-27cM-CD30A和/或CD33B;染色體3CD50-2cM-3-167-7cM-CD13A和/或CD31B和/或CD6B和/或CD29C和/或CD52B-17cM-CD51;染色體4CD59-5cM-CD49A-39cM-CD55;染色體5CD41-9cM-CD64-8cM-CD31A-10cM-CD38B;染色體6CD14-8cM-CD13B-18cM-CD29B;染色體7CD61-3cM-CD58和/或CD65-8cM-CD48-57cM-CD54和/或CD57;染色體8CD46-10cM-CD60-10cM-CD7-10cM-3-185-26cM-CD40-1cM-CD21A和/或CD16C;染色體10
CD56-7cM-CD45-15cM-CD38A-10cM-CD34B-10cM-CD34A;染色體12CD21B-1cM-CD27-7cM-CD4B和/或CD16D-2cM-CD6A-53cM-3-48.未定位的連鎖群1)CD32A-11cM-CD3-3cM-CD82)CD29D-9cM-CD25B3)CD42-8cM-CD25A4)CD5-5cM-CD32B
8.權項要求7所述的圖還包括如下的同功酶染色體1Idh-1-18cM-Prx-1-21cM-CD15-18cM-sdkh-1-4cM-CD24-17cM-CD47-4cM-CD12-27cM-CD9B和/或CD52A-5cM-CD9A和/或CD16B-5cM-CD16A和/或CD20和/或Act-3-10cM-CD44-1cM-CD28-18cM-Est-3;染色體2R45S和/或CD49B-1cM-CD37-7cM-CD1-7cM-Rbcs-1和/或3-91-15cM-CD33A-9cM-CD30B-14cM-Cab-1和/或3-131和/或CD11-11cM-Est-7-8cM-Prx-2-6cM-CD43-4cM-CD35-6cM-CD9C-13cM-Rbcs-3-14cM-CD30A和/或CD33B;染色體3Cab-3-12cM-Pgm-1-18cM-CD50-2cM-Rbcs-2和/或3-167-7cM-CD13A和/或CD31B和/或CD6B和/或CD29C和/或Act-4和/或CD52B-17cM-CD51;染色體46Pgdh-1-11cM-CD59-5cM-CD49A-11cM-Act-1和/或Tpi-2-15cM-Pgm-2-4cM-Adh-1-9cM-Act-10和/或CD55;染色體5CD41-9cM-CD64-8cM-CD31A-10cM-CD38B;染色體6CD14-8cM-CD13B-7cM-Aps-1-11cM-CD29B;染色體7CD61-3cM-CD58和/或CD65-8cM-CD48-16cM-Got-3-7cM-Aco-2-18cM-Got-2-7cM-Cab-4-9cM-CD54和/或CD57;染色體8CD46-10cM-CD60-10cM-CD7-10cM-Cab-2和/或3-185-12cM-Aps-2-14cM-CD40-1cM-CD21A和/或CD16C;染色體10CD56-7cM-CD45-10cM-EstB-10cM-CD34A和/或Act-6;染色體12CD21B-1cM-6Pgdh-2和/或CD27-7cM-CD4B和/或CD16D-2cM-CD6A-3cM-Pgi-1-40cM-Aco-1-10cM-Cab-5 and/or 3-48.未定位的連鎖群(1)-CD32A-11cM-CD3-3cM-CD8;(2)-Sod-1和/或Act-5-7cM-CD29D-9cM-CD25B;(3)-CD42-8cM-CD25A;(4)-Act-2-6cM-CD5-5cM-CD32B.
9.權利要求
7或權利要求
8的圖上至少有這裡提及的cDNA克隆的一個。
10.把一西紅柿植株的可觀察到的特徵和權利要求
7的一cDNA標記物克隆連鎖的方法，包括比較該可觀察特徵與權利要求
7的cDNA標記物克隆的重組百分率及把與該可觀察特徵的重組百分率最低的cDNA標記物克隆定為與可觀察特徵連鎖的cDNA標記物克隆。
11.權利要求
10所述的方法，其特徵在於，其中與可觀察特徵顯示30%以下的重組率的cDNA克隆被定為與該特徵連鎖的cDNA克隆。
12.一種鑑定替代DNA標記物的方法，包括用權利要求
7的一cDNA標記物探查一DNA庫以鑑定對所述cDNA標記物基本上是同源的庫DNA，觀察所述庫DNA或其一個片段與所述cDNA標記物或一與其連鎖的可觀察特徵的重組百分率，以及把具有0-10%重組率的庫DNA定為替代DNA標記物。
13.一種測定一西紅柿植株的可觀察特徵與權利要求
7的一cDNA克隆之間的可遺傳關聯的方法，包括(a)選擇一具有可觀察特性的西紅柿植株與另一沒有可觀察特性的另一西紅柿植株作為雜交育種的親本;(b)從親本植株提取DNA，將該DNA用限制酶處理以獲得DNA片段;在一中性凝膠上通過電泳分離每一植株的片段，並把這些經過電泳的片段轉移到一固體載體以為每一植株獲得一雜交基質;(c)把步驟(b)的基質和選自權利要求
7的標明可能含有與所述可觀察特性相應的DNA的一個染色體或未定位(配位)連鎖群的cDNA克隆的一個cDNA克隆進行雜交;(d)比較每一親本的雜交型式以決定是否有多形態存在;(e)重複步驟(b)～(d)，至少再用一個選自那些標明可能含有相應於可觀察特徵的DNA其他染色體的cDNA克隆的cDNA克隆及/或必要時再用一些限制酶直到鑑定出多形態以便在可能含有相應於所述可觀察特徵的DNA的每一染色體或未定位連鎖群上至少有一個差別(差異)可以使親本之間彼此有所區別。(f)將親本植株進行雜交以獲得F1子代，將F1子代進行自雜交或逆代雜交以獲得含有具有該可觀察特性的個體的分離子代;(g)選擇並獲得一在統計學上有意義的分離個體的數目以獲得可觀察特徵的百分存在率。(h)從步驟(g)的分離個體提取DNA，通過步驟(b)到步驟(e)以便為每一當與沒有可觀察特性的親本的基質相比時顯示多態性的個體獲得雜交的基質。(i)鑑定出位於授於可觀察特徵的基因的10個圖單位以(10cM)內的cDNA克隆;(j)如果鑑定不出這樣的cDNA，鑑定那些距控制可觀察特徵的基因30個圖單位(30cM)以下的cDNA克隆;(k)再從權利要求
7的cDNA克隆選擇一些cDNA克隆，所述克隆在圖上的位置離開步驟(j)和cDNA克隆30個圖單位(cM)以下，並將所述克隆與步驟(h)的分離代DNA進行雜交;(l)鑑定位於離控制該可觀察特徵的基因10圖單位(10cM)以內的cDNA克隆;(m)如果鑑定不出這樣的cDNA克隆，再從權利要求
7的cDNA克隆中選擇一些cDNA克隆，所述克隆在圖上的位置比那些具有較低百分一致性的cDNA克隆更為接近以前測試過的、具有較高百分一致性的cDNA克隆。把這些克隆與步驟(h)的分離個體的DNA進行雜交並鑑定離開控制可觀察特徵10個圖單位以下的cDNA克隆。(n)如果鑑定不出這樣的cDNA克隆，重複步驟(m)直到鑑別出這樣的克隆為止。
14.權利要求
10的方法，其特徵在於，除了cDNA克隆以外，還用了同功酶，在具有可觀察特性的親本中發生的每一同功酶的存在或發生率與分離代個體中的可觀察特徵的百分存在率相關聯;
15.權利要求
10中的方法，包括對染色體圖上的控制可觀察特徵的DNA的定位。
16.篩選存在可觀察特徵的西紅柿植株的一種方法，包括(a)把可觀察的特徵與選自權利要求
7的cDNA克隆的標記物進行連鎖;(b)測試西紅柿植株的DNA以了解所選擇的標記物是否存在RFLP的特徵。
17.把所需特徵從一西紅柿植株轉移到一第二西紅柿品種的方法，包括(a)把所需特徵和一以前已作過圖的標記物進行連鎖;(b)用權項要求4的cDNA探查第二西紅柿品種的DNA以測定它的DNA輪廓;(c)把具有所需特徵的西紅柿植株和第二西紅柿植株品種進行雜交育種以獲得F1子代;(d)用連鎖的標記物篩選對所需特性是純合性的F1個體;(e)用權項要求4的cDNA探查具有該特徵的F1個體的DNA以測定它們的DNA輪廓;(f)選擇具有所需特徵並在其他方面具有與第二西紅柿品種的親本的特性最相似的DNA輪廓的F1個體進行育種;(g)把步驟(f)的經過選擇的個體與第二西紅柿品種的親本進行逆代雜交以產生BC1子代;(h)用連鎖的標記物篩選有所需特徵的BC1個體;(i)用權利要求
4的cDNA探查具有所需特徵的BC1個體的DNA以測定它們的DNA輪廓;(j)選擇具有所需的特徵並在其他方面具有與第二西紅柿品種的親本具有類似DNA輪廓的BC1個體;(k)對BC2及其後的各子代重複步驟(g)～(i)，直到產生出對所需特徵是純合且與第二西紅柿品種的親本達到所需相似程度的個體為止。
專利摘要
本發明提供了一種用大量c DNA克隆和同功酶標記物的位置標識的蕃茄(西紅柿)染色體圖。c DNA克隆存放在In Vitro International，通過找出蕃茄植物所需育種特性之間的連鎖，可將所說c DNA克隆連同圖一起使用。建立這種連鎖後，即可用來快速確定蕃茄(西紅柿)植株中有無這種所需的特性，並將所需的特性用基因滲入法滲入到其他蕃茄品種中。
文檔編號C12Q1/68GK87102210SQ87102210
公開日1988年6月1日 申請日期1987年3月20日
發明者史蒂芬·D·坦克斯列, 羅勃特·博納滋基 申請人:盧布瑞佐遺傳公司, 新墨西哥州大學董事會董事導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan