定量檢測血漿腎素用磁微粒化學發光試劑盒的製作方法
2023-04-24 08:23:21 1
專利名稱：定量檢測血漿腎素用磁微粒化學發光試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫用診斷試劑技術領域，尤其是涉及一種定量檢測血漿腎素用磁微粒化學發光試劑盒。
背景技術：
腎素(renin)是腎小球旁器、球旁細胞釋放的一種蛋白水解酶。腎素經腎靜脈進入血液，能催化血漿中的血管緊張素原(在α 2球蛋白中)轉變成血管緊張素I (10肽)，血液和肺組織中的轉換酶使血管緊張素I降解為血管緊張素II (8肽)，後者可被氨基肽酶水解為血管緊張素111(7肽)。這三種血管緊張素均有生物活性，其中血管緊張素II、ΙΙΙ的生物活性較強，而後者在血中的濃度較低，故以血管緊張素II的生物活性最強。血管緊張素原和轉換酶等經常存在於血漿中，腎素的釋放是決定血漿中血管緊張素濃度的關鍵性條件。血漿腎素含量的檢測，可用於診斷由於腎動脈狹窄導致的高血壓或腎血管性高血壓，幫助臨床醫生決定是否進行腎血管的影像學研究，診斷原發性醛固酮增多症，以及為原發性高血壓病人心血管系統的併發症的發生提供有效的信息等。另外對於指導用藥和治療效果的評價有很重要的意義，例如，對於一些腎上腺功能低下並採用類固醇激素替代治療的病人，當治療效果充足時，腎素水平正常，當治療效果不足時，腎素水平過高。腎素活性-血管緊張素II-醛固酮，在臨床應用中，通常被稱為高血壓三項。目前對於腎素含量的檢測，常通過檢測血漿中血管緊張素I的濃度，來間接衡量腎素含量，稱之為腎素活性。腎素活性的測定是由於血漿樣本內的腎素在一定PH值和反應時間內，將樣本中內源性的血管緊張素原轉化為血管緊張素I，採用競爭法檢測樣本中的血管緊張素I的濃度，根據單位時間內生成血管緊張素I濃度的不同，來計算血漿樣本的腎素活性，腎素活性的這種測定方法對標本處理、環境條件、PH值、時間等都要求極為苛刻，室內及室間重複性差。對於直接測定腎素濃度的方法目前還鮮有報導，特別是採用均相的磁微粒發光技術， 國內外尚未有該技術的建立。
發明內容
本發明的目的在於提供一種定量檢測血漿腎素用磁微粒化學發光試劑盒，該試劑盒直接用抗腎素抗體作為包被和標記，測定血漿中的腎素含量，實現了腎素含量的直接評價。為實現上述目的，本發明可採取下述技術方案
本發明所述的定量檢測血漿腎素用磁微粒化學發光試劑盒，包括偶聯有抗腎素抗體的磁微粒混懸液、校準品、辣根過氧化物酶標記的抗腎素單克隆抗體、化學發光底物Α、化學發光底物B以及洗液。所述磁微粒混懸液中的抗腎素抗體為小鼠抗腎素單克隆抗體，磁微粒為表面含有羧基的活性基團。所述校準品是以0. 05Μ的Tris_NaCl、l%的EDTA_Na2、和m的牛血清白蛋白組成PH7. 4的緩衝液為基質，加入腎素純品配製而成，校準品形態為液態且具有良好的穩定性。辣根過氧化物酶標記的抗腎素單克隆抗體為大鼠抗腎素單克隆抗體，該抗腎素單克隆抗體是以0. OlM的PBS和1%酪蛋白作為緩衝液基質，工作濃度為1:1000。所述化學發光底物A由Luminol 0. 15mM、羥基香豆素0. 59 mM、沒食子酸0. 35 mM、 Tris-HCl緩衝液0. 2M組成，最後調pH7. 4 ；化學發光底物B由0. 2M乙酸-乙酸鹽緩衝液、 維生素C 0. 12 mM、胺基酸氧化酶0.85 mM組成，最後調pH7. 4。本發明的優點在於採用雙抗體夾心法聯合磁微粒化學發光技術，直接採用抗腎素抗體作為包被和標記，測定血漿中的直接腎素含量，實現了腎素含量的直接評價；本發明試劑盒實現了操作的簡便性和自動化性，具有檢測時間短、靈敏度高、穩定性好、結果準確、變異性小的特點。
圖1是本發明試劑盒檢測血漿腎素的校準曲線圖。
具體實施例方式本發明所述的定量檢測血漿腎素用磁微粒化學發光試劑盒，包括偶聯有抗腎素抗體的磁微粒混懸液、校準品、辣根過氧化物酶標記的抗腎素單克隆抗體、化學發光底物A、化學發光底物B以及洗液。偶聯有抗腎素抗體的磁微粒混懸液中的抗腎素抗體為鼠抗腎素單克隆抗體，磁微粒為表面含有羧基的活性基團；採用雙抗體夾心法，所用的兩株配對抗體均為鼠抗腎素單克隆抗體，因此具有優異的特異性；磁微粒混懸液採用氨基戊二醛法製備，通過化學鍵聯結磁性微粒和腎素抗體，腎素抗體的濃度控制在0. 30ug/人份，以0. OlM的PBS和1%BSA作為緩衝體系和保護體系；
所用的校準品是以0. 05M的Tris-NaCl、l%的EDTA_Na2、和m的牛血清白蛋白組成 PH7. 4的緩衝液為基質，加入腎素純品配製而成，校準品形態為液態。辣根過氧化物酶標記的抗腎素單克隆抗體為大鼠抗腎素單克隆抗體，用0. OlM的 PH7. 4的PBS和1%酪蛋白組成的稀釋液將其稀釋至工作濃度1 1000。化學發光底物A由Luminol 0. 15mM、羥基香豆素0. 59 mM、沒食子酸0.35 mM、 Tris-HCl緩衝液0. 2M組成，最後調pH7. 4 ；化學發光底物B由0. 2M乙酸-乙酸鹽緩衝液、 維生素C 0. 12 mM、胺基酸氧化酶0. 85 mM組成，最後調pH7. 4。洗液由0. IM磷酸鹽緩衝液和l%TWeen20配製而成，使用時用蒸餾水20倍稀釋。本發明試劑盒使用操作程序如下
1、在反應杯中依次加入100μ 1校準品及待測樣本；
2、在上述反應杯中再加入磁微粒混懸液20μ1 ；
3、將反應杯中的溶液混合均勻，37°C溫育15分鐘；
4、使用磁分離器洗滌設備，將反應杯中的磁微粒用洗液洗滌3次；
5、在反應杯中加入酶標記物50μ1，37°C溫育15分鐘；
6、使用磁分離器洗滌設備，將反應杯中的磁微粒用洗液洗滌3次；7、加入發光底物A和發光底物B各50μ 1，混勻後室溫避光反應5分鐘；
8、使用化學發光檢測儀檢測發光信號值並記錄；
9、採用四參數擬合方式，建立定標曲線，計算測定結果。使用本發明試劑盒按照上述程序檢測血漿腎素濃度，所用時間較短，測定結果僅需45分鐘即可得出，方便快捷，且準確性高、重複性好。本試劑盒檢測血漿腎素可達到如下指標
校準曲線範圍0pg/ml — 500pg/ml ；
校準曲線線性濃度值和檢測發光值以四參數擬合方式進行線性擬合，線性係數R > 0. 999，見圖1 ；圖1原始數據，用四參數擬合，X為濃度值，Y為發光值取log;
權利要求
1.一種定量檢測血漿腎素用磁微粒化學發光試劑盒，其特徵在於它包括偶聯有抗腎素抗體的磁微粒混懸液、校準品、辣根過氧化物酶標記的抗腎素單克隆抗體、化學發光底物 A、化學發光底物B以及洗液。
2.根據權利要求1所述的定量檢測血漿腎素用磁微粒化學發光試劑盒，其特徵在於 所述磁微粒混懸液中的抗腎素抗體為小鼠抗腎素單克隆抗體，磁微粒為表面含有羧基的活性基團。
3.根據權利要求1所述的定量檢測血漿腎素用磁微粒化學發光試劑盒，其特徵在於 所述校準品是以0. 05M的Tris-NaCl、l%的EDTA_Na2、和m的牛血清白蛋白組成pH7. 4的緩衝液為基質，加入腎素純品配製而成，校準品形態為液態。
4.根據權利要求1所述的定量檢測血漿腎素用磁微粒化學發光試劑盒，其特徵在於 所述辣根過氧化物酶標記的抗腎素單克隆抗體是大鼠抗腎素單克隆抗體。
5.根據權利要求1所述的定量檢測血漿腎素用磁微粒化學發光試劑盒，其特徵在於 所述化學發光底物A由Luminol 0. 15mM、羥基香豆素0. 59 mM、沒食子酸0. 35 mM,Tris-HCl 緩衝液0. 2M組成，最後調pH7. 4 ；化學發光底物B由0. 2M乙酸-乙酸鹽緩衝液、維生素C 0. 12 mM、胺基酸氧化酶0. 85 mM組成，最後調pH7. 4。
全文摘要
本發明公開了一種定量檢測血漿腎素用磁微粒化學發光試劑盒，包括偶聯有抗腎素抗體的磁微粒混懸液、校準品、辣根過氧化物酶標記的抗腎素單克隆抗體、化學發光底物A、化學發光底物B以及洗液。本試劑盒採用均相的磁微粒發光技術和抗體夾心法直接測量血漿中的腎素濃度，具有檢測時間短、靈敏度高、穩定性好、結果準確、變異小的特點，本試劑盒替代了腎素活性的檢測，直接測定血漿中腎素的含量，實現了腎素含量的直接評價。
文檔編號G01N33/577GK102565037SQ20121000688
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者付光宇, 劉功成, 吳學煒, 李文娟, 渠海, 王敏, 秦東春, 趙鵬, 鄭立運, 陸瑩, 陳科, 馬建軍 申請人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司