高產聚蘋果酸的菌株及其應用和方法

2023-04-24 08:36:21

專利名稱：高產聚蘋果酸的菌株及其應用和方法
技術領域：
本發明涉及發酵領域，具體涉及高產聚蘋果酸的菌株，還涉及該菌株的應用及其方法。
背景技術：
聚蘋果酸(Polymalic acid，PMLA)以L-蘋果酸為唯一單體在體內聚合而成，是一種新型完全生物降解性高分子材料，具有高度的生物相容性、生物降解性和生物可吸收性等優點。由於PMLA在側鏈上具有懸掛羧基，容易與其他官能團反應而製備PMLA衍生物，與聚乳酸等材料相比，PMLA在體內易代謝性、易修飾性等方面表現出更好的優勢，在藥物制齊U、食品包裝、農業等方面應用前景廣闊。聚蘋果酸還可以水解為單體，即L-蘋果酸，又名
2-羥基丁二酸，是重要的有機酸和生物煉製平臺化合物。L-蘋果酸具有天然果實的酸味特徵，味覺自然豐厚，可作為酸味劑在食品及醫藥中廣泛應用。L-蘋果酸的酸感強度約相當於檸檬酸的I. 2倍，產熱量更低，可以替代檸檬酸作為食品添加劑加以應用。目前聚蘋果酸主要通過由出芽短梗黴pulIuIans')發藤 Π要以澱粉和葡萄糖為原料，其原料價格高，在一定程度上限制了工業應用。糖蜜是製糖工業的主要副產物，糖蜜中主要以蔗糖為主，能夠被出芽短梗黴利用，但是利用效率低，聚蘋果酸的產率低，無法在工業上大規模應用。因此，急需一種高產聚蘋果酸的菌株，能夠利用價格低廉的糖蜜為原料，利用效率高，聚蘋果酸產量高，為聚蘋果酸的生產提供一條新型經濟工藝路線。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的在於提供一種高產聚蘋果酸的菌株，具有較好的利用蔗糖能力，能夠以製糖工業的主要副產物糖蜜為糖源，利用效率高，聚蘋果酸產量高。為實現上述發明目的，技術方案為
高產聚蘋果酸的出芽短梗黴/7 77 7<3/ 5·) FMT1801,保藏號為CCTCCNO: M 2012223。本發明的目的之二在於提供出芽短梗黴FMT1801在生產聚蘋果酸中的應用，技術方案為
所述出芽短梗黴FMT1801 CCTCC NO: M 2012223在生產聚蘋果酸中的應用。本發明目的之三在於提供利用出芽短梗黴FMT1801生產聚蘋果酸的方法，工藝簡單，原料價格低，聚蘋果酸產量高。技術方案為
為了實現上述為目的，本發明的技術方案為
利用所述出芽短梗黴FMT1801在生產聚蘋果酸的方法，具體步驟為
a.種子活化
將出芽短梗黴FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接種於種子培養基，在溫度為23_30°C震蕩培養，得活化種子液；所述種子培養基為葡萄糖40-100g/L、NH4N03l-5 g/L、KH2PO4O. 005-0. 3g/L、ZnSO4 0. 005-0. 3g/L、MgSO4 0. 005-0. 3g/L、玉米漿 0. 05-3 g/L 和 CaCO310-50 g/L ；
b.發酵
將步驟a所得活化種子液接種於發酵培養基，在溫度為23-30°C震蕩培養96小時以上，離心收集液體，得發酵液；所述發酵培養基為糖蜜50-200g/L、氮源l_5g/L、KH2PO4O. 005-0. 3g/L、ZnSO4 O. 005-0. 3g/L、MgSO4 O. 005-0. 3g/L、玉米漿 0. 05_3g/L 和 CaCO310-50 g/L ；
c.聚蘋果酸提取
將步驟b所得發酵液中加入體積分數為95%的乙醇溶液，4°C冷凍，離心收集沉澱，得到
聚蘋果酸。 優選的，所述步驟a中，所述出芽短梗黴FMT1801按出芽短梗黴FMT1801種子液與種子培養基的體積比為1:100-1000接種，在轉速為180-300 rpm培養36-96小時。更優選的，所述種子培養基為葡萄糖60-80g/L、NH4NO3 2_4g/L、KH2PO4O. 05-0. 2g/L、ZnSO4 O. 05-0. 2g/L、MgSO4 0. 05-0. 2g/L、玉米漿 l_2g/L 和 CaCO3 20-40 g/L0優選的，所述活化種子液按活化種子液與發酵培養基的體積比為1:10-20接種，在轉速為180-1000 rpm條件下培養96-200小時。更優選的，所述發酵培養基為糖蜜100-150g/L、氮源2_4g/L、KH2PO4 O. 05-0. 2g/L、ZnSO4 O. 05-0. 2g/L、MgSO4 0. 05-0. 2g/L、玉米漿 0. 5_2g/L 和 CaCO3 20-40 g/L。優選的，所述步驟c是加入相當於發酵液體積1-5倍的體積分數為95%的乙醇溶液，4°C冷凍12-36小時，在轉速不低於3000rpm的條件下離心不少於5分鐘。更優選的，所述步驟c是加入相當於發酵液體積2倍的質量分數95%的乙醇溶液，4°C冷凍24小時；在轉速為3500rpm的條件下離心45分鐘。最優選的，所述氮源為硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀或硝酸鈉。
本發明使用的發酵菌株為出芽短梗黴(Aureobasidiuni pullulans )FMT1801,將出芽短梗黴FMT1801製備成0D_= O. 4左右的菌液，即出芽短梗黴FMT1801種子液，備用。本發明有益效果在於本發明公開了高產聚蘋果酸的菌株為出芽短梗黴(Aureobasidium /wJJWafldFMTlSOl 為發酵菌株，保藏號為 CCTCC NO: M 2012223，該菌株具有較好的利用蔗糖的能力，還能以工業副產物糖蜜為糖源，通過發酵產生濃度高的聚蘋果酸，原料成本低，聚蘋果酸產量高，具有較好的經濟效益。本發明中糖蜜為製糖工業的主要副產物因此原料來源廣泛，價格低廉，同時由於出芽短梗黴FMT1801發酵的終產物為聚蘋果酸，解決了傳統路線發酵終產物為蘋果酸，抑制菌種活性，降低產量的問題，因而能夠獲得高濃度的聚蘋果酸發酵液，發酵液中聚蘋果酸最高達29g/L。本發明使用的出芽短梗黴FMT1801菌株生產的聚蘋果酸能直接分泌到胞外，用體積分數為95%的乙醇溶液即可沉澱，容易提取，工藝步驟簡單，適合大規模工業生產。菌種保藏
本發明中出芽短梗黴FMT1801 (Aureobasidium pullulans FMT1801)是從出芽短梗抱NRRL Y2311經過自然分離獲得能高效利用蔗糖為碳源產生聚蘋果酸的菌株，送中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NO: M 2012223，地址位於中國武漢武漢大學，保藏日期為2012年6月12日，分類命名為出芽短梗黴(AureobasidiumFMT1801。
具體實施例方式以下將結合實施例對本發明進行詳細的描述。優選實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件。實施例I
生產聚蘋果酸的方法，具體步驟為 a.種子活化
將出芽短梗黴FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接種於種子培養基中，接種量按照出芽短梗黴FMT1801種子液與種子培養基的體積比為1:100，種子培養基配方為葡萄糖60g/L、硝酸銨 2 g/L、KH2PO4 O. 05g/L、ZnSO4 O. 05g/L, MgSO4 O. 05g/L、玉米漿 0. 05g/L 和 CaCO3 20 g/L在溫度為25°C、轉速為250 rpm條件下震蕩培養48小時，得活化種子液。b.發酵
將步驟a所得活化種子液接種於含50mL發酵培養基的搖瓶中，接種量按照活化種子液與發酵培養基的體積比為1:10，發酵培養基配方為糖蜜100 g/L、硝酸鉀2 g/L、KH2PO4O. 05g/L,ZnSO4 O. 05g/L,MgSO4 O. 05g/L、玉米漿 O. 5g/L 和 CaC0320 g/L，在溫度為 25°C、轉速為220 rpm條件下震蕩培養144小時，培養液用板框過濾機過濾，收集濾液,得發酵液。c.聚蘋果酸提取
將步驟b所得發酵液中加入相當於發酵液體積2倍的體積分數為95%的乙醇溶液，40C冷凍24小時，轉速為4000rpm離心30分鐘，收集沉澱，得到聚蘋果酸。本實施例中，聚蘋果酸產量為29 g/L，製得的聚蘋果酸用體積分數為95%的乙醇洗滌3次後，將沉澱溶解在濃度為2 M硫酸中，在80°C條件下水解12小時，得到蘋果酸，蘋果酸產量為32. 9 g/L。實施例2
生產聚蘋果酸的方法，具體步驟為 a.種子活化
將出芽短梗黴FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接種於種子培養基中，接種量按照出芽短梗黴FMT1801種子液與種子培養基的體積比為1:100，種子培養基配方為葡萄糖80g/L、硝酸銨 4 g/L、KH2PO4 O. 2g/L, ZnSO4 O. 2g/L, MgSO4 O. 2g/L、玉米漿 2g/L 和 CaCO3 40 g/L在溫度為25°C、轉速為180rpm條件下震蕩培養96小時，得活化種子液。b.發酵
將步驟a所得活化種子液接種於含50mL發酵培養基的搖瓶中，接種量按照活化種子液與發酵培養基的體積比為1:10，發酵培養基配方為糖蜜150g/L、硝酸鈉4 g/L、KH2PO4O. 2g/L、ZnSO4 O. 2g/L、MgS04 O. 2g/L、玉米漿 2g/L 和 CaCO3 40 g/L，在溫度為 23°C、轉速為180 rpm條件下震蕩培養96小時，培養液用板框過濾機過濾，收集濾液,得發酵液。c.聚蘋果酸提取
將步驟b所得發酵液中加入相當於發酵液體積3倍的體積分數為95%的乙醇溶液，40C冷凍12小時，轉速為3500rpm離心45分鐘，收集沉澱，得到聚蘋果酸。
本實施例中，聚蘋果酸產量為27.9 g/L，所得聚蘋果酸，用體積分數為95%的乙醇洗滌2次後，將沉澱溶解在濃度為2 M硫酸中，在85°C條件下水解10小時，得到蘋果酸，蘋果酸產量為31. 7 g/L。實施例3
生產聚蘋果酸的方法，具體步驟為 a.種子活化
將出芽短梗黴FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接種於種子培養基中，接種量按照出芽短梗黴FMT1801種子液與種子培養基的體積比為1:100，種子培養基配方為葡萄糖100 g/L、硝酸銨 5 g/L,KH2PO4 O. 3g/L,ZnSO4 O. 3g/L, MgSO4 O. 3g/L、玉米漿 3 g/L 和 CaCO3 50g/L在溫度為28°C、轉速為300 rpm條件下震蕩培養36小時，得活化種子液。b.發酵
將步驟a所得活化種子液接種於含50mL發酵培養基的搖瓶中，接種量按照活化種子液與發酵培養基的體積比為1:10，發酵培養基配方為糖蜜200 g/L、硝酸銨5 g/L、KH2PO4O. 3g/L、ZnSO4 O. 3g/L、MgS04 O. 3g/L、玉米漿 3g/L 和 CaCO3 50 g/L，在溫度為 30°C、轉速為300rpm條件下震蕩培養150小時，培養液用板框過濾機過濾，收集濾液，得發酵液。c.聚蘋果酸提取
將步驟b所得發酵液中加入相當於發酵液體積4倍的體積分數為95%的乙醇溶液，40C冷凍36小時，轉速為5000rpm離心5分鐘，收集沉澱，得到聚蘋果酸。本實施例中，聚蘋果酸產量為26g/L，所得聚蘋果酸，用體積分數為95%的乙醇洗滌I次後，將沉澱溶解在濃度為2 M硫酸中，在90°C條件下水解9小時，得到蘋果酸，蘋果酸產量為29. 5g/L。實施例4
生產聚蘋果酸的方法，具體步驟為 a.種子活化
將出芽短梗黴FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接種於種子培養基中，接種量按照出芽短梗黴FMT1801種子液與種子培養基的體積比為1:100，種子培養基配方為葡萄糖40 g/L、硝酸銨 O. 005 g/L、KH2PO4 O. 005g/L、ZnSO4 O. 005g/L、MgSO4 O. 005g/L、玉米漿 0. 5g/L和CaCO3 10g/L，在溫度為23°C、轉速為250 rpm條件下震蕩培養72小時，得活化種子液。b.發酵
將步驟a所得活化種子液接種於含3L發酵培養基的5L發酵罐中，接種量按照活化種子液與發酵培養基的體積比為1:15，發酵培養基配方為糖蜜50 g/L、氯化銨I g/L、KH2PO4O. 005g/L、ZnSO4 O. 005g/L、MgSO4 O. 005g/L、玉米漿 0. 005g/L 和 CaCO3 10 g/L，在溫度為28°C、轉速為500 rpm，通氣量為1:0. 8條件下培養200小時，培養液用板框過濾機過濾，收集濾液，得發酵液。c.聚蘋果酸提取
將步驟b所得發酵液中加入相當於發酵液體積5倍的體積分數為95%的乙醇溶液，40C冷凍24小時，轉速為4500rpm離心20分鐘，收集沉澱，得到聚蘋果酸。本實施例中，聚蘋果酸產量為21. 2g/L，所得聚蘋果酸，用體積分數為95%的乙醇洗滌3次後，將沉澱溶解在濃度為2 M硫酸中，在70°C條件下水解15小時，得到蘋果酸，蘋果酸產量為24. lg/L。實施例5
生產聚蘋果酸的方法，具體步驟為 a.種子活化
將出芽短梗黴FMT1801 CCTCC NO: M 2012223接種於種子培養基中，接種量按照出芽短梗黴FMT1801種子液與種子培養基的體積比為1:100，種子培養基配方為葡萄糖70 g/L、硝酸銨 3 g/L、KH2PO4 O. lg/L、ZnSO4 O. 15g/L，MgSO4 O. lg/L、玉米漿 lg/L 和 CaCO3 30g/L在溫度為25°C、轉速為220 rpm條件下震蕩培養48小時，得活化種子液。b.發酵
將步驟a所得活化種子液接種於含5L發酵培養基的IOL發酵罐中，接種量按照活化種子液與發酵培養基的體積比為1:10，發酵培養基配方為糖蜜120 g/L、硝酸鉀3 g/L、KH2P04 O. lg/L、ZnSO4 O. 15g/L、MgSO4 O. lg/L、玉米漿 lg/L 和 CaCO3 30 g/L，在溫度為 25°C、轉速為1000 rpm,通氣量為1:1.6條件下培養96小時，培養液用板框過濾機過濾，收集濾液,得發酵液。c.聚蘋果酸提取
將步驟b所得發酵液中加入相當於發酵液體積2倍的體積分數為95%的乙醇溶液，40C冷凍24小時，在3000rpm條件下離心20分鐘，收集沉澱，得到聚蘋果酸。本實施例中，聚蘋果酸產量為34. 4g/L，所得聚蘋果酸，用體積分數為95%的乙醇洗滌I次後，將沉澱溶解在濃度為2 M硫酸中，在85°C條件下水解10小時，得到蘋果酸，蘋果酸產量為39g/L。最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和範圍。
權利要求
1.高產聚蘋果酸的出芽短梗黴/w/Bw/afl^OFMTlSOl,保藏號為CCTCCNO: M 2012223。
2.權利要求I所述出芽短梗黴FMT1801在生產聚蘋果酸中的應用。
3.利用權利要求I所述出芽短梗黴FMT1801在生產聚蘋果酸的方法，其特徵在幹，具體步驟為 a.種子活化 將出芽短梗黴FMT18 OI接種於種子培養基，在溫度為2 3 -3 (TC震蕩培養，得活化種子液；所述種子培養基為葡萄糖 40-100g/L、NH4NO31-5 g/L、KH2PO4 O. 005-0. 3g/L、ZnSO4O.005-0. 3g/L、MgSO4 0. 005-0. 3g/L、玉米漿 0. 05-3 g/L 和 CaCO3 10-50 g/L ； b.發酵 將步驟a所得活化種子液接種於發酵培養基，在溫度為23-30°C震蕩培養96小時以上，離心收集液體，得發酵液；所述發酵培養基為糖蜜50-200g/L、氮源l_5g/L、KH2PO4O.005-0. 3g/L、ZnSO4 O. 005-0. 3g/L、MgSO4 O. 005-0. 3g/L、玉米漿 0. 05_3g/L 和 CaCO310-50 g/L ； c.聚蘋果酸提取 將步驟b所得發酵液中加入體積分數為95%的こ醇溶液，4°C冷凍，離心收集沉澱，得到聚蘋果酸。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述步驟a中，所述出芽短梗黴FMT1801按出芽短梗黴FMT1801種子液與種子培養基的體積比為1:100-1000接種，在轉速為180-300 rpm 培養 36-96 小時。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述種子培養基為葡萄糖60-80g/L、NH4NO3 2-4g/L、KH2PO4 O. 05-0. 2g/L、ZnSO4 O. 05-0. 2g/L、MgSO4 0. 05-0. 2g/L、玉米漿1-2g/L和CaCO3 20-40 g/L。
6.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述步驟b中，所述活化種子液按活化種子液與發酵培養基的體積比為1:10-20接種，在轉速為180-1000 rpm條件下培養96-200小吋。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述發酵培養基為糖蜜100-150g/L、氮源2-4g/L、KH2PO4O. 05-0. 2g/L、ZnSO4 O. 05-0. 2g/L、MgSO4 O. 05-0. 2g/L、玉米漿 0. 5_2g/L和 CaCO3 20-40 g/L。
8.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述步驟c是加入相當於發酵液體積1-5倍的體積分數為95%的こ醇溶液，4°C冷凍12-36小時，在轉速不低於3000rpm的條件下離心不少於5分鐘。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述步驟c是加入相當於發酵液體積2倍的質量分數95%的こ醇溶液，4°C冷凍24小時；在轉速為3500rpm的條件下離心45分鐘。
10.根據權利要求3-9任一項所述的方法，其特徵在於所述氮源為硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀或硝酸鈉。
全文摘要
本發明公開了高產聚蘋果酸的菌株，具體為出芽短梗黴(Aureobasidium pullulans)FMT1801，保藏號為CCTCC NO:M2012223；能夠利用工業副產物糖蜜為原料，原料成本低，並且聚蘋果酸產率高；還公開了該菌株的在生產聚蘋果酸中的應用和生產聚蘋果方法，具有工藝簡單，成產成本低的優點，具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12P7/62GK102827778SQ201210200500
公開日2012年12月19日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者鄒祥, 戢運超 申請人:西南大學