新的益生長雙歧桿菌的製作方法

2023-04-23 23:38:46

專利名稱：新的益生長雙歧桿菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)益生抗炎菌株，其用於預 防、減輕或治療疾病以及用於製備人類或寵物食品的用途，或藥物組合物。此外，本發明涉 及由所述菌株獲得的細菌多糖、其用於治療疾病的用途、以及包含該多糖的藥物組合物。
背景技術：
乳酸菌已經長時間知曉發酵糖產生酸尤其是主要的新陳代謝組分乳酸的細菌。此類細菌 可以在牛奶或乳品、活著的或腐敗植物中發現，也可以在人類和動物腸道中發現。傳統上， 這類細菌被稱為「乳酸菌」。乳酸菌指發酵糖產生酸(包括乳酸)的革蘭氏陽性、無運動微 需氧或厭氧細菌的相當異種的一類，乳酸菌包括，例如，雙歧桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、 乳球菌屬、明串珠菌屬和片球菌屬。幾個世紀以來，乳酸菌已用於製備食品和飼料產品，包括大部分乳製品，現在，乳 酸菌在製備所有發酵乳品例如酸奶、發酵全脂牛奶、乳凍食品(junket)、乳酪和黃油中是必 不可少的。大量記載各種乳酸菌有益影響人類和/或動物健康的報導的發表吸引了對這類 細菌進一步的興趣。尤其是，發現乳桿菌屬或雙歧桿菌屬的特定菌株能夠在腸黏膜集群，並 輔助維持宿主健康。這類細菌通常被稱為益生菌或益生菌劑。益生菌益生微生物已經被定義為「在足量施用時賦予宿主健康益處的活的微生物」(FAO/ WHO 2002)。儘管已經鑑別很多益生菌(尤其是乳桿菌屬或雙歧桿菌屬菌株)，然而大量的研 究也表明參考其系統分類並不能準確地預測益生菌。而相反地，每一菌株應當分別評價。研 究也表明即使是密切相關的益生菌也可能對健康產生相當不同的影響。然而，清楚的是，大部分鑑別的益生菌除了其健康有益效果之外，具有一些額外的 特徵。抗膽汁酸通常認為，益生菌劑發揮其對腸道上皮的有益效果的先決條件是足量的活益生菌 存在。進入腸上部後，益生菌接觸高水平的膽汁鹽。因此，最重要的是益生菌抗膽汁酸。腸屏障功能腸屏障功能在黏膜與外界的交界處調節運輸和宿主防禦機制。細胞間和旁細胞流 受到膜泵、離子通道和緊密聯結的嚴密調控，調節滲透性至生理需求。任何水平的幹擾、特 別是由於增加滲透性引起的細菌易位和由於受損上皮細胞和T細胞相互作用引起的口腔 耐受性破壞，可以導致炎症和組織損傷。上皮屏障抑制諸如LPS及其他炎性化合物的高分子量物質從腸腔側進入循環系統。
緊密聯結引起該上皮屏障的功能之一。緊密聯結或閉合帶是膜連接在一起形成對 液體實質上的非滲透屏障的兩個上皮細胞的緊密結合區域，其將血管系統與消化道腔相分 離。因此，已經證明，降低所述緊密聯結屏障功能導致不需要的物質諸如LPS由腸腔進入循 環系統的侵入增加。相反地，預期誘導緊密聯結屏障功能引起不需要的物質諸如LPS的侵 入減少。胞外多糖和生物膜形成儘管存活對於粘附和集群能力(即生物膜形成)是重要的，但是它也被認為是益 生菌發揮它的有益效果所需的一個重要的促成因素，無論它是通過免疫調節、病原體排除 或與黏膜的接觸增強(1)。很多細菌在生物膜發生中的重要特徵是粘液樣物質，已知為胞外多糖(EPQ或胞 外基質。胞外多糖是包括乳桿菌屬和雙歧桿菌的很多細菌表面上存在的胞外聚合物O)。 EPS形成粘液層，其鬆弛地附著於細胞表面或分泌到環境中(3)。通過比較非EPS產生菌和EPS產生菌等基因變體研究了這些分子的生理功能。表 明細胞結合EPS保護細菌抵禦噬菌體和細胞壁降解酶⑷。最近，Mao等人發現，由大腸杆 菌菌株產生的胞外多糖增強該菌在模擬胃腸流體中的存活(5)。這些發現表明，某些細菌產 生的胞外多糖事實上可能對於它們在腸中生存是必不可少的。可用於乳業製備諸如酸奶的發酵乳品的菌株很重要的技術特徵是其在發酵乳品 的流變學和質地改善中的用途(30)。在很大程度上菌株的結構特徵與EPS的產生相關 (30)。儘管這是重要的技術特徵，EPS很可能由於其特定的化學結構對接受者產生有益的 健康效果。已經顯示，乳酸菌所產生的一些種類的EPS對於人類健康具有有益效果，例如降 低膽固醇的能力(6)、免疫調節活性(7 ;8)、對胃腸粘液的微生物粘附(9;10)、抗氧化劑和 自由基清除活性(11)以及益生(雙歧(bifidogenic))作用(12)。近來，已經表明，產生高水平EPS的德氏乳桿菌(LactcAacillus delbrueckii)顯 著降低結腸炎的鼠模型中炎症的嚴重性(1 。因此，看起來清楚的是高產量特定EPS可能 與益生菌的免疫調節作用有關。涉及腸微生物群的胃腸併發症炎症是先天免疫系統的複雜反應，涉及在侵染、毒素暴露或細胞傷害位點處的白 細胞和血漿蛋白質的累積和活化。儘管炎症在控制感染和促進組織修復中起到防護功能， 其也會引起組織損傷和疾病。胃腸機能紊亂諸如炎症性腸病(克羅恩病)、潰瘍性結腸炎和 過敏性腸症候群是自發性炎症。涉及胃腸炎症的其它疾病為隱窩炎、食物過敏、和食物過敏 引起的異位性皮炎(14-16)。克羅恩病和潰瘍性結腸炎在北歐、英國和北美洲最為流行，其中每100，000達500 人受影響。雖然這些疾病具有不同的病因學，但均涉及機能紊亂的黏膜免疫系統對土著菌 群及其他腔抗原的不當響應(6)。這些紊亂的急性治療依賴於抗生素和抗炎藥，而在嚴重病 例中，手術則是必要的。長期的治療包括生活方式改變、飲食調整和停止吸菸(7)。已經表 明益生菌通過對胃腸上皮和黏膜免疫系統發揮正效應而延長免於這些病症(8)。過敏性腸症候群(IBS)影響7-31%的已經克服由於沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬或志 賀氏菌屬感染導致的感染性胃腸炎患者。具有腹瀉但不具有感染性起始的IBS可以在經歷
4「不利」生活事件的個體中發生(17)。儘管臨床試驗表明在IBS中益生菌的效力變化大，但 是雙盲安慰劑對照研究已經表明，某些益生菌的混合物可對IBS具有有益效果(18-20)，因 此突出了識別新的益生菌的重要性。益生菌劑的免疫調節效應已經表明，益生菌具有減輕具有胃腸炎性併發症如克羅恩病和潰瘍性結腸炎的患 者症狀的能力01;22)。具體地說，雙歧桿菌已經被描述為在胃腸疾病的預防和治療中具 有潛力的益生菌，如 EP 1 688481、EP 0 199535、EP 0 768 375、WO 97/00078、EP 0 577 903 和 WO 00/53200 所述。EP 0 768 375 (Nestle SA)描述了雙歧桿菌屬的具體菌株，其能夠埋入腸內菌叢 並能夠競爭性地排除病原菌粘著至腸細胞。據報導，這些雙歧桿菌幫助免疫調節並因此幫 助個體健康的維持。雙歧桿菌的免疫調節效應甚至可賦予未出生的兒童。WO 01/97822例 如描述了通過母親攝入動物雙歧桿菌屬(Bifidobacterium animal is)菌株BB-12 ,減少 了兒童中特應性疾病的發生。此外，WO 03/099037 (Nestec SA)描述了動物雙歧桿菌屬菌 株BB-12 能夠有利地調節免疫反應。儘管已經描述了相當多的具有抗炎性質的雙歧桿菌屬菌株，但只有少數菌株已經 被報導在體內有效治療實驗誘導的腸炎。W004052462A1 (B. Pot, Danisco A/S)描述了某些兩歧雙歧桿菌和乳雙歧桿菌 (Bifidobacterium lactis)菌株能夠在結腸炎的實驗鼠模型中減少炎症的嚴重性。W02007/09369A1 (Nestec SA)描述了長雙歧桿菌菌株 BL999 (ATCCBAA-999)在結 腸炎的實驗鼠模型中減少炎症的嚴重性。EP 1688481 和EP 1141235B(University College of Cork)描述了嬰兒長雙歧杆 菌菌株UCC356M在結腸炎的鼠模型中減少炎症的嚴重性。Foligne等Q007)描述了在結腸炎的實驗鼠模型中減少炎症嚴重性的三種雙歧 桿菌。然而，這些文件對於EPS產生、菌株的EPS組成、緊密聯結的強度都並未描述，並 且，除了 EP1688481之外，對於雙歧桿菌屬菌株的膽汁酸抗性也沒有描述。由於即使是密切相關的益生菌也對健康產生頗為不同而特定的效應，因此對新的 益生菌存在持續的需求，包括能夠調理炎性腸疾病、抗膽汁酸和由於高水平的EPS而能夠 集群於腸的新的抗炎雙歧桿菌屬菌株。發明概述本發明出乎意料地發現特定長雙歧桿菌菌株綜合了膽汁抗性、改善腸屏障功能 和體內大量產生具有優異抗炎性的胞外多糖這些重要的益生特徵。特別地，本發明人出乎意料地鑑別了長雙歧桿菌的一個特定益生菌株，即長雙歧 桿菌DSM 21062，其綜合了所有上述重要的益生特徵。預期直接來源於該益生菌的菌株很可能保持其益生特徵。因此，在第一方面，本發明涉及長雙歧桿菌細菌細胞的菌株，其可用於益生菌劑， 耐受膽汁鹽，產生高量的胞外多糖(EPS)，並在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的結腸炎模 型中具有抗炎效應，其特徵在於所述菌株為登記號DSM 21062的長雙歧桿菌菌株或其突變 株，其中所述突變株通過使用保藏菌株作為起始材料獲得，並且其中所述突變株具有保留的或進一步改善的表徵DSM 21062的抗炎效應、膽汁耐受性和/或EPS表達。如在實施例中表明，長雙歧桿菌DSM 21062菌株在體內具有一些非凡的免疫調節 性能，表明其可以有效防禦多種疾病。因此，在第二方面，本發明涉及包含長雙歧桿菌DSM 21062細菌細胞或其突變株的組合物用於製備藥物的用途。特別地，所述菌株可用於製備治療哺乳動物胃腸道炎性病症的藥物。許多益生菌劑用於製備食品或飼料產品；因此，本發明的另一重要方面是提供包 含長雙歧桿菌DSM 21062或其突變株的人類或寵物食物組合物。當製備所述食品或飼料產品時，製造商通常使用用於加工食品和飼料產品的所謂 的起子培養物。起子培養物廣泛用於乳品業。一般地，起子培養物給予各種食品或飼料產 品特定的特徵。沿用已久的事實是稠度、質地、主體和口感與用於製備所述食品或飼料的起 子培養物的EPS產生強烈地相關。因此，本發明的另一方面是包含長雙歧桿菌DSM 21062 或其突變株的起子培養物組合物，優選地其中所述起子培養物組合物具有以下濃度的活細 胞，所述濃度的範圍為每克所述組合物IO4至1012CFU。本發明也設計一種製備食品或飼料產品的方法，所述方法包括向食品或飼料產 品起始材料添加包含長雙歧桿菌DSM 21062或其突變株的起子培養物組合物，並將由此接 種的起始材料保持在所述乳酸菌代謝活躍的條件下。由實施例可見，長雙歧桿菌DSM 21062不僅產生高量的胞外多糖，也產生相當不 常見類型的EPS，該EPS通常富含甘露糖和葡萄糖殘基。眾所周知，一些類型的EPS涉及對人類健康的特定效應(6)、(9 ； 10)、(11)、(12)。 因此，本申請考慮，長雙歧桿菌DSM 21062EPS異常結構可能參與甚至負責由該菌株產生的 獨特免疫調節效果。因此，另一個方面，本發明涉及由長雙歧桿菌DSM 21062或其突變株分 離的多糖。包含所述長雙歧桿菌DSM 21062或其突變株的多糖的藥物組合物也是本發明的
一方面。進一步考慮，長雙歧桿菌DSM 21062的EPS的獨特結構可能通常涉及炎性疾病。先 前表明，當施用於哺乳動物時，含有甘露糖的複雜聚合物(甘露聚糖)具有顯著的生物學活 性。因此，在本發明的一方面，長雙歧桿菌DSM 21062細胞或所述細胞的部分通常用於治療 炎性疾病。特別地，本發明涉及一種治療炎性疾病的方法，其特徵在於向需要治療的人施用 有效量的包含多糖的組合物，所述組合物包含獲得自DSM 21062或DSM 21062的突變株的 EPS。定義在討論本發明的詳細實施方案之前，提供與本發明的主要方面相關的特定術語的定義。本文中所用的術語「胞外多糖」指高分子量聚合物，其由通過微生物分泌到周圍環 境中的糖殘基組成。表達「益生菌劑(probiotics或probioticum)指的是包含益生微生物的組合物。 益生菌定義為對宿主的衛生和健康具有有益效果的微生物細胞。益生微生物已經被定義為 「在足量施用時賦予宿主健康益處的活的微生物」(FA0/WH0 2002)。表達「益生元」指增加腸內益生菌的數量的組合物或組合物的組分。因此，益生元 指任何由土著菌在結腸中特別發酵的任何非活的食品組分，認為其具有積極價值，例如，雙
6歧桿菌屬，乳桿菌屬。聯合施用益生菌與一種或多種益生化合物可以提高施用的益生菌劑 在體內的生長，產生更加顯著的健康益處，稱為協同益生(symbiotic)。表達「相對富含甘露糖殘基的EPS」指其中甘露糖是存在的至少第二最豐富種類的 單糖的EPS。表達「「Glu-N 甘露糖比」指葡糖胺(Glu-N)和甘露糖的量之間的比。表達「相對富含葡萄糖殘基的EPS」指其中葡萄糖是存在的最豐富種類的單糖的 EPS。表達「「Glu-N 葡萄糖比」指葡糖胺(Glu-N)和葡萄糖的量之間的比。僅通過例舉的方式，如下描述本發明的實施方案發明詳述本發明旨在鑑別一種新的益生菌株，其可用於預防、減輕或治療與炎症、尤其是腸 炎相關的紊亂、病症或疾病。這裡，我們第一次描述了益生長雙歧桿菌菌株，其特徵在於耐受膽汁鹽，產生大 量胞外多糖(EPS)，加強體外上皮細胞的緊密聯結，並在小鼠三硝基苯磺酸(TNBQ誘導的 結腸炎模型中具有抗炎效應。在本發明的優選實施方案中，所述長雙歧桿菌菌株是長雙歧桿菌菌株(DSM 21062)。根據國際承認用於專利程序的布達佩斯條約，所述益生長雙歧桿菌菌株DSM 21062 於 2008 年 1 月 23 日保藏於德國 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)Inhoffenstra β e 7B,38124 Braunschweig。實施例1表明長雙歧桿菌菌株(DSM 21062)能夠在實驗結腸炎小鼠模型中預防 炎症。從

圖1可見，長雙歧桿菌菌株(DSM 21062)對TNBS誘導的結腸炎的防護效應明 顯好於其它測試菌株的效應。用DSM 21062處理的小鼠的宏觀炎症分數(macroscopic inflammation score) (Wallace分數)為2. 85+/-0. 52，而該分數高於其它菌株(菌株9555 3. 5+/-0. 53 ；菌株 9553 :3. 55+/-0. 58，菌株8773 :4. 75+/-0. 77，菌株 8818 :4. 0+/-0. 58)。 TNBS參照的平均Wallace分數為5. 15+/-0. 62，而防護的陽性對照(潑尼松龍)為高度防 護性的，平均Wallace分數為2. 35+/-0. 31。在健康小鼠中沒有檢測到炎症跡象(Wallace 分數0. 5賦予所有乙醇-處理的小鼠)。Caco-2細胞單層的跨上皮電阻(TEER)使得能夠測量與緊密聯結破壞相關的旁細 胞離子流變化(Velarde et al. (1999) Toxicology in Vitro 13，723-727)，因此該測定可 用於定量益生菌對緊密聯結的保護效應。在實施例6中，表明長雙歧桿菌菌株(DSM 21062) 在其響應於緊密聯結破壞性癸酸鈉(ClO)時減少Caco-2細胞層跨上皮電阻(TEER)降低的 能力優於其它益生菌。不囿於理論，我們預期緊密聯結強度與腸屏障功能和腸上皮的緊緻 度正相關，因此可能當採用小鼠(TNBS)誘導的結腸炎模型時與上皮的響應相關。所述長雙歧桿菌菌株(DSM 21062)在所述研究中進一步產生與其它菌株相比大 量的EPS。DSM 21062在實施例2所描述獲得的並通過HPLC在PAlO柱(高pH陰離子交換 色譜法)測量的EPS提取物中產生至少3mg/ml，諸如超過5mg/ml，或者甚至7mg/ml或更多。然而，EPS的量和實際組成對於其功能皆是重要的。先前表明，當施用於哺乳動物 時，含有甘露糖的複雜聚合物(甘露聚糖)具有顯著的生物學活性。這包括活化免疫系統，然後將甘露糖結合於識別分子例如在巨噬細胞和樹突細胞上表達的甘露糖受體(CD206) (23-25)。近來已經表明甘露糖受體為新疫苗的靶標，不僅用於使免疫防禦針對癌症和傳染 病，也用於在自身免疫性疾病的治療中特異性誘導耐受性06)。腸樹突細胞(DC)被認為取 樣並呈遞共生菌至腸相關免疫系統07)並表明具有高含量甘露糖的EPS能夠調節對腸微 生物群落的免疫反應。已經表明來自真菌的EPS具有免疫刺激和抗腫瘤效應，並且來自這 些真菌的EPS含有甘露糖08 ；29)。就我們所知，尚未教導真菌EPS選擇其免疫刺激效應 的機制是通過與甘露糖結合受體的相互作用，我們考慮，情況正是如此。因此，認為本發明 長雙歧桿菌菌株(DSM 21062)的重要特徵在於其產生相對富含甘露糖殘基的EPS，例如測 得Glu-N 甘露糖比為40或更高，例如超過50甚至60或更高。如表II所表明的，甘露糖 殘基的絕對量也顯著高於其它研究的細菌。而且，分析DSM 21062產生的EPS顯示其還出 乎意料地富含葡萄糖殘基。所述菌株產生相對富含葡萄糖殘基的EPS，例如，測得Glu-N 葡萄糖比為50以上，例如超過100，或者甚至180以上。葡萄糖殘基的絕對量也出乎意料地 尚ο這顯示所述長雙歧桿菌菌株(DSM2106》產生具有獨特的化學組成的EPS。預 期這些獨特的EPS至少部分負責所述菌株的有益效果，因此從所述長雙歧桿菌菌株(DSM 21062)或其突變分離的多糖可用於配製包含所述多糖的益生元或藥物組合物，其可用於預 防、減輕或治療各種炎性疾病或病症。正如所述，所述菌株EPS的甘露糖殘基的高量和葡萄 糖殘基的量被認為是顯著的。我們相信，特別是分離自菌株DSM 21062(或其突變體)並相 對富含甘露糖和葡萄糖殘基的多糖製備物將證明特別地有效。然而，任何這裡提及的包含 任一所述多糖的益生元或藥物組合物為本發明的一種實施方案。如實施例4表明，所述長雙歧桿菌菌株(DSM 2106 進一步能夠抑制致病菌株的 生長。該實施例表明該菌株能夠抑制選自以下的菌株單核細胞增多性利斯特菌、沙門氏菌 SSP、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。值得注意的是，長雙歧桿菌菌株(DSM2106》能夠抑制致病菌株的生長，因為產生 除了有機酸之外的抗微生物物質對於雙歧桿菌屬菌株而言是罕有的。只分離了少數能夠產 生過氧化氫和熱穩定蛋白質抗菌化合物的菌株(30)。EP1688481 (Univ. College of Cork) 描述了一種具有抗微生物活性的嬰兒長雙歧桿菌。該菌株的抗微生物活性可能是由於產生 了乙酸和乳酸，因為進行的測定不涉及PH調節。我們已經開發了評價來自益生菌株長雙歧 桿菌 DSM 21062、CHCC9555、CHCC9553、CHCC8773 和 CHCC8818 的 pH 調節條件培養基的抗微 生物活性的測定。在該測定中，長雙歧桿菌DSM 21062在抑制病原體生長上明顯優異，該效 應與EP 168848中描述的嬰兒長雙歧桿菌菌株相反，不是由於產生乙酸或乳酸，該測定表 明長雙歧桿菌DSM 21062通過獨特的機制發揮其抗微生物效應。TNBS誘導的結腸炎導致小鼠重量顯著損失，這可以通過DSM 21062抵消至一定程 度，但不能通過其它細菌處理實現。因此，在一實施方案中，本發明的菌株特徵在於，接受所述菌株的動物經歷的由於 TNBS誘導的結腸炎引起的重量損失顯著小於(在ρ = 0. 1水平)接受對照菌株的動物的重
量損失。由上清楚的是DSM 21062可以用於製備藥物。實施例1表明，DSM 21062可用於 製備治療哺乳動物胃腸道炎性病症的藥物。人體胃腸道炎症的實例包括過敏性腸症候群(IBS)、炎症性腸病(IBD)、脂瀉病(乳糖不耐受)、克羅恩病、間質性膀胱炎、酸性腸症候群、 胃炎、潰瘍性結腸炎、痢疾、斑疹傷寒症和與食物過敏相關的腸炎。在本發明的一實施方案 中，DSM 21062用於製備預防、減輕或治療任何這些病症的藥物。在另一方面，本發明涉及包含DSM 21062或其突變株的人類或寵物食物組合物。 優選，所述細菌可以作為添加劑施用至正常的飲食或者作為營養完全人類或寵物食物的組 分。劑型可以是液體或固體。在後一情況下，所述產品可以粉末化並形成片劑、顆粒或膠囊， 或者簡單與其它食物組分混合，形成功能性食品。本發明的食品組合物可以是使用DSM 21062或其突變株產生的任何可攝取的材 料，選自乳、凝乳、乳基發酵產品、酸化乳、酸奶、冷凍酸奶、奶粉、乳基粉末、乳濃縮物、乳酪、 塗抹乾酪、調味品、飲料、冰淇淋、發酵的基於穀物的產品、嬰兒配方、片劑、液體細菌懸液、 幹口服添加劑、溼口服添加劑、幹管道飼餵或溼管道飼喂。在進一步的實施方案中，所述組合物進一步包含藥學可接受載體。本文中所用的 術語「藥學可接受載體」是指適於施用於人類或動物並且與所述益生活性有機體相容的一 種或多種固體或液體填充稀釋劑或囊化物質。術語「相容的」涉及能夠與DSM 21062或其 突變株混合的藥物組合物組分，混合的方式使得在正常使用條件下沒有會實質上降低選擇 用於本發明的有機體的益生效能的相互作用。藥學可接受載體必須具有足夠高的純度，並 且足夠低的毒性，使得其適於施用於被處理的人類和動物。本文中所述的固體組合物優選為片劑、膠囊或顆粒(包括許多顆粒)。優選所述 固體組合物為口服劑型。常規配製技術的綜述可以在例如「!"he Theory and Practice of Industrial Wiarmacy」中找到(31)或(32)。因此，所述片劑可以通過本領域已知的方法 製備，並且可以是壓縮的、腸包衣的、糖包衣的、膜包衣的、或多次壓縮的，含有適宜的粘合 劑、潤滑劑、稀釋劑、崩解劑、著色劑、粉末化劑、流動-產生劑和熔化劑。具有液體或固體內 含物的膠囊(軟膠囊和硬膠囊)可以根據製藥工業公知的常規技術進行製備。作為一個實 例，可以使用適宜的填充機將益生活性有機體填充至明膠膠囊中。本文中所述的固體組合 物也可以是丸。所述人類或寵物食物組合物或劑型應當如上所述至少包含DSM 21062或其突變 株，從而每一個體可獲得的兩種菌株之一的量為約IO3-IO14CFU/天，諸如IO6-IO13CFU/天， 包括IO8-IO12CFU/天，或甚至IO9-IOiiCFU/天。該量取決於個體重量，優選對於人類為約 IO9-IO12CFU/天，對於寵物為IO7-IOiciCFU/天。然而，會理解，對於任何特定患者的具體劑量 水平將取決於多種因素，包括所用的具體化合物的活性、年齡、體重、健康概況、性別、飲食、 施用時間、施用途徑、排洩速度、藥物聯合以及進行治療的特定疾病的嚴重程度。在進一步的實施方案中，所述人類或寵物食物組合物或營養增補劑劑型進一步包 含一種或多種益生物質。適宜的益生物質的實例為低聚果糖(F0Q和菊糖。然而，也考慮 從DSM 21062的細菌細胞獲得的其它益生物質，諸如低聚半乳糖(GOS)、低聚甘露糖(MOS)、 甚至多糖組合物。微生物參與包括大部分乳品的食品和飼料產品的製備。細菌培養物，尤其是通常 分類為乳酸菌的細菌培養物在製備所有發酵乳品、乳酪和黃油中必不可少。這些微生物的 培養物經常被經常稱為起子培養物，並通過行使多種功能賦予各種乳製品特定特徵。為了 使所述起子培養物發揮其功能，必不可少的是它包含足量的活細胞。因此，本發明的一個實施方案是包含活長雙歧桿菌DSM21062或其突變株的起子培養物，並且優選其中所述起子 培養物組合物具有一定濃度的活細胞，該濃度在每克所述組合物IO4至IO12CFU的範圍內。起子培養物通常用於通過根據食品或飼料產品起始材料添加起子培養物組合物 並將由此接種的起始材料保持在所述乳酸菌代謝活躍的條件下來製備食品或飼料產品。在 優選的實施方案中，所述食品為乳基產品，諸如乳酪、酸奶、黃油，或者液體發酵乳產品，諸 如例如酪乳或飲用酸奶。特別優選本發明用於製備牛乳產品的用途。儘管益生效應與活細胞相關，很多報導已經顯示死的或失活的細菌也可以具有 獨特的有益健康性能。因此，在本發明的一個實施方案中，死的或滅活的長雙歧桿菌DSM 21062或其突變株或所述細胞的部分用於治療炎性疾病。尤其是，此類細胞或者此類細胞的 部分被考慮用於製備治療哺乳動物胃腸道炎症的藥物，諸如過敏性腸症候群(IBS)、炎症性 腸病(IBD)、脂瀉病(乳糖不耐受)、與食物過敏相關的腸炎、克羅恩病、間質性膀胱炎、酸性 腸症候群、胃炎、潰瘍性結腸炎、痢疾或斑疹傷寒症。以權利要求的形式呈現本發明本發明的優選方面和實施方案可以所謂的權利要求的形式呈現。這些如下給出。1、長雙歧桿菌細菌細胞的菌株，其可用作益生菌劑，耐受膽汁鹽，產生大量胞外多 糖(EPS)，加強體外緊密聯結，並在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的結腸炎模型中具有抗 炎效應。2、權利要求1的菌株，其中計算為(IOOx(平均Wallace分數「TNBS-陽性對照 組-平均Wallace分數「處理」組)/平均Wallace分數「TNBS-陽性對照組」)的「 ％相對 防護」為35 %或更高，諸如40 %，或者甚至43 %或更高。3、前述權利要求任一項的菌株，其中當EPS根據實施例2的方法分離時，所述菌株 產生至少3mg/ml，諸如超過5mg/ml，或者甚至7mg/ml或更高。4、根據前述權利要求任一項的菌株，其中所述菌株產生相對富含甘露糖殘基的 EPS，測得Glu-N 甘露糖比為40或更高，例如超過50，或者甚至60或更高。5、根據前述權利要求任一項的菌株，其中所述菌株產生相對富含葡萄糖殘基的 EPS，測得Glu-N 葡萄糖比為50或更高，例如超過100，或者甚至180或更高。6、根據前述權利要求任一項的菌株，其中共培養Caco-2細胞(ATCC HTB-37)的體 外培養層與所述細菌菌株引起Caco-2細胞層的緊密聯結統計上顯著的加強，所述緊密聯 結測量為所述Caco-2細胞層在暴露於緊密聯結破壞劑癸酸鈉後所述Caco-2細胞層的跨上 皮電阻。7、根據前述權利要求任一項的菌株，其中所述菌株還能夠抑制致病菌株的生長。8、根據權利要求7的菌株，其中所述致病菌株選自單核細胞增多性利斯特菌、沙 門氏菌ssp、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。9、根據前述權利要求任一項的菌株，其中接受所述菌株的動物由於TNBS-誘導的 結腸炎經歷重量損失，該重量損失小於接受對照菌株的動物的重量損失。10、根據前述權利要求任一項的菌株，其為登記號DSM 21062的長雙歧桿菌菌株 或其突變株，其中所述突變株通過使用該保藏菌株作為起始材料獲得，並且其中所述突變 株具有保留的或進一步改善的表徵DSM 21062的抗炎效應、膽汁耐受性和/或EPS表達。11、包含根據前述權利要求任一項的細菌細胞的菌株或所述細胞的部分的組合物
10用於製備藥物的用途。12、包含根據權利要求1至10任一項的細菌細胞的菌株或所述細胞的部分的組合 物用於製備治療哺乳動物胃腸道炎症的藥物的用途。13、權利要求12的用途，其中所述炎症選自以下病症組成的組過敏性腸症候群 (IBS)、炎症性腸病(IBD)、脂瀉病(乳糖不耐受)、克羅恩病、間質性膀胱炎、酸性腸症候群、 胃炎、潰瘍性結腸炎、痢疾、斑疹傷寒症和與食物過敏相關的腸炎。14、人類或寵物食物組合物，其包含至少一種權利要求1-10任一項的細菌細胞的 菌株。15、一種起子培養物組合物，其包含權利要求1至10任一項的細菌細胞，優選其中 所述起子培養物組合物具有一定濃度的活細胞，該濃度在每克所述組合物IO4至IO12CFU的 範圍內。16、一種製備食品或飼料產品的方法，該方法包括將根據權利要求15的起子培養 物添加到食品或飼料產品起始材料中並將由此接種的起始材料保持在所述乳酸菌代謝活 躍的條件下。17、權利要求16的方法，其中所述食品是乳，優選牛乳。18、從權利要求1至10任一項的長雙歧桿菌菌株分離的多糖。19、權利要求18的多糖，其相對富含甘露糖殘基，測得Glu-N 甘露糖比為40或 更高，例如超過50，或者甚至60或更高。20、權利要求18的多糖，其相對富含葡萄糖殘基，測得Glu-N 葡萄糖比為50或 更高，例如超過100，或者甚至180或更高。21、權利要求18的多糖，其根據權利要求17和18相對富含甘露糖和葡萄糖殘基兩者。22、藥物組合物，其包含權利要求18至21任一項的多糖。23、權利要求1-10任一項的細菌細胞或所述細胞的部分用於治療炎性疾病的用途。24、前述權利要求23的用途，其中所述疾病為過敏性腸症候群(IBS)、炎症性腸病 (IBD)、脂瀉病(乳糖不耐受)、與食物過敏相關的腸炎、克羅恩病、間質性膀胱炎、酸性腸綜 合徵、胃炎、潰瘍性結腸炎、痢疾或斑疹傷寒症。25、治療炎性疾病的方法，其特徵在於向需要治療的人施用有效量的前述權利要 求任一項的包含多糖的組合物。在以下非限制性實施例和附圖中進一步闡明本發明，其中圖1 =(A)TNBS誘導的結腸炎的宏觀炎症評價，表示為Wallace分數。以細菌處理 的小鼠與單獨接受TNBS或假治療的小鼠相比較。(B)TNBS誘導的結腸炎的宏觀炎症評價， 表示為％防護，與單獨接受TNBS或假治療的小鼠相比較。*表明防護顯著不同於假治療， P ^ 0.05廣ρ ^0.01的統計顯著性水平( 0. 002的統計顯著性水平；O不顯著(t檢 驗)。誤差棒指示Ix平均標準誤差。圖2 沒有細菌處理可以減輕重量損失，除了菌株DSM 21062，其中注意到減少體 重損失的正趨勢(12. 4% +/-1. 6,p = 0. 09)。防護的陽性對照(潑尼松龍)在減輕重量損失 方面非常顯著。(4. 75% +/-1. 25,ρ ^ 0. 001)。_表明防護顯著不同於假治療，ρ彡0. 001。
圖3 =MPO測定證實在發炎組織中，特別是對於TNBS對照組，嗜中性白細胞的大量 滲入(12. 56+/-3. 75)，與「健康小鼠」不同，其中僅測到非常微弱的活性(1.75+/-0. 07)。通 過類皮質激素調節進行防護顯著降低了該參數G.21+/-0.96)。發現所有細菌處理組的平 均值均遠在陽性對照值之下，然而沒有觀察到顯著降低。表現出最佳的降低的菌株為菌株 DSM 21062 (p = 0. 07)。誤差棒指示Ix平均標準誤差。圖4 通過當等量的細菌生物質沉澱時形成的球團粒度所表明的長雙歧桿菌DSM 21062、瘤胃乳桿菌菌株CHCC8818和乾酪乳桿菌菌株CHCC8773的蓬鬆性。圖5 測量穿過Caco-2細胞匯合層的跨上皮電阻。「無處理」為既未用ClO亦未用 益生菌劑處理的Caco-2細胞層，「C10」為僅用ClO處理的細胞層。益生菌劑處理(恥_12， CRL-431，La-5和DSM 21062)細胞層，然後以ClO挑戰，示於四個右側的柱)。誤差棒指示 Ix平均標準誤差。"表示P <0.01的統計顯著性水平，_ < 0.001的統計顯著性水平(t 檢驗)。
實施例實施例1 體內分析長雙歧桿菌DSM 21062的抗炎潛能培養條件和所用菌株在本研究中使用以下菌株長雙歧桿菌菌株DSM 21062 (CHCC8879)。菌株瘤胃乳 桿菌菌株CHCC8818、乾酪乳桿菌菌株CHCC8773、兩歧雙歧桿菌菌株CHCC9555和兩歧雙歧杆 菌菌株CHCC9553用作對照菌株。菌株CHCC8818、CHCC8773、CHCC9555和CHCC9553為在產 生本發明的篩選過程中鑑定和研究的Chr. Hansen培養物收集的4個推定的益生菌株。乳桿菌屬於37°C培養於 MRS 肉湯(Difco，BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) 使 用 Anaerocult A 培養袋(Merck，Darmstadt，Germany)於 37°C MRS 肉湯+0.05%半胱氨酸 氫氯化物中培養雙歧桿菌。對於每一菌株，在生長曲線以及瓊脂培養基上細菌計數的基礎上建立了 0D600nm/ CFU (集落形成單位)對應關係。關於動物實驗，每日將500μ 1各菌株從不同的儲瓶接種到50ml相應的生長培養 基中，以確保最後的細菌計數> 101(ICFU。離心培養物，在PBS中洗滌，並在將所述細菌施用於動物前再懸浮於足夠體積的 緩衝液中。TNBS誘導的結腸炎和炎症記分描述用於炎性標記的模型和測定的方案對應於標準方法，先前描述於(33)。簡言 之，通過胃內途徑每日給予10隻小鼠的組別或者碳酸鹽緩衝液(「TNBS陽性對照」)或者 新鮮培養的IxlO9活細菌(「處理」)，連續進行5日。此外，以10mg/kg的潑尼松的商業制 備物(Cortancyl，Sanofi Aventis,France)處理10隻小鼠的組，在施用TNBS前口服5日， 並在TNBS處理後口服連續2日(「陽性防護對照」)。通過直腸內施用50%乙醇中50μ 1 TNBS溶液(Sigma-Aldrich Chemical)誘發 急性結腸炎。施用100mg/kg TNBS在所用的BALB/c小鼠中引起中度嚴重的腸炎。10隻小 鼠的組也被給予碳酸鹽緩衝液，但是僅接受50 μ 1的50%乙醇溶液(無TNBS ；「陰性」(健 康)對照")。接下來每日監測動物的體重減輕。誘導結腸炎2日後，處死小鼠。研究設計
12示於表I。在小鼠解剖後，兩位獨立的觀察者在不知情的情況下以Wallace尺度對結腸的宏 觀炎症進行計分(34)。如前所述，％相對防護計算為100x(平均Wallace分數「TNBS-陽 性對照」組-平均Wallace分數「處理」組)/平均Wallace分數「TNBS陽性對照組」。公布時缺失表I 體內TNBS誘導的結腸炎的研究設計(i.r.=直腸內施用，i.g.=胃內施用)
權利要求
1.一種長雙歧桿菌細菌細胞的菌株，其用作益生菌劑，耐受膽汁鹽，產生高量的胞外 多糖(EPS)，並在小鼠三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的結腸炎模型中具有抗炎效應，其特徵在 於所述菌株為登記號DSM 21062的長雙歧桿菌菌株或其突變株，其中所述突變株通過使用 該保藏菌株作為起始材料獲得，並且其中所述突變株具有保留的或進一步改善的表徵DSM 21062的抗炎效應、膽汁耐受性和/或EPS表達。
2.權利要求1的菌株，其中共培養Caco-2細胞(ATCCHTB-37)的體外培養層與所 述菌株引起所述Caco-2細胞層的緊密聯結統計上顯著的加強，所述緊密聯結測量為所述 Caco-2細胞層在暴露於緊密聯結破壞劑癸酸鈉後所述Caco-2細胞層的跨上皮電阻。
3.根據前述權利要求任一項的菌株，其中所述菌株還能夠抑制致病菌株的生長。
4.根據權利要求1至3任一項的菌株，其中所述菌株產生相對富含甘露糖殘基的EPS， 測得Glu-N 甘露糖比為40或更高。
5.根據權利要求1至4任一項的菌株，其中所述菌株產生相對富含葡萄糖殘基的EPS， 測得Glu-N 葡糖糖比為50或更高。
6.包含根據前述權利要求任一項的細菌細胞的菌株或所述細胞的部分的組合物用於 製備藥物的用途。
7.包含根據權利要求1至5任一項的細菌細胞的菌株或所述細胞的部分的組合物用於 製備治療哺乳動物胃腸道炎症的藥物的用途。
8.人類或寵物食物組合物，其包含至少一種權利要求1至5任一項的細菌細胞的菌株。
9.一種起子培養物組合物，其包含權利要求1至5任一項的細菌細胞，優選其中所述 起子培養物組合物具有一定濃度的活細胞，該濃度在每克所述組合物IO4至IO12CFU的範圍 內。
10.一種製備食品或飼料產品的方法，該方法包括將根據權利要求9的起子培養物添 加到食品或飼料產品起始材料中並將由此接種的起始材料保持在所述乳酸菌代謝活躍的 條件下。
11.從權利要求1至5任一項的長雙歧桿菌菌株分離的多糖。
全文摘要
本發明涉及新的長雙歧桿菌益生抗炎菌株，其用於預防、減輕或治療疾病以及用於製備人類或寵物食品的用途，或藥物組合物。所述菌株產生大量具有高含量的甘露糖和葡萄糖殘基的胞外多糖。因此，本發明還涉及由所述菌株獲得的細菌多糖組合物，其用於治療疾病的用途，以及包含此類多糖的藥物組合物。
文檔編號C12R1/01GK102089422SQ200980127197
公開日2011年6月8日 申請日期2009年7月6日 優先權日2008年7月11日
發明者延斯·基爾德斯加德, 託馬斯·岡納森, 託馬斯·簡森, 託馬斯·達爾曼·萊澤, 梅特·魏澤, 班奈迪特·佛林巴爾德, 瑪麗·福克恩伯格 迪特 申請人:科.漢森有限公司