快速聚合番茄黃化曲葉病毒病多個抗性基因的引物及方法

2023-04-24 01:08:31 2

專利名稱：快速聚合番茄黃化曲葉病毒病多個抗性基因的引物及方法
技術領域：

本發明屬於農業育種領域，特別涉及利用分子標記聚合多個番茄黃化曲葉病毒病抗性基因，選育抗病自交系的番爺育種方法。
背景技術：
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番茄是茄科(Solanceae)番茄屬(Solanum)的一年生或多年生植物，原產於南美洲的秘魯、厄瓜多等地。番茄是世界上重要且具有高經濟價值的農作物之一，也是中國栽培最廣、產量最高的蔬菜作物之一。但栽培番茄中記載的病害有將近200種，儘管生產者可以使用包括栽培技術和殺蟲劑等綜合策略，但是利用傳統的育種方法將抗病基因導入到現代品種中依然是番茄抵抗疾病的重要方法。在上百種番茄病原體中，由番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)引起的疾病一直是生產者重中之重的難題。近10年來，煙粉蝨傳播的雙生病毒已經發展成為中國乃至世界番茄生產的限制因子。通過煙粉蝨，TYLCV可以迅速進入番茄中，一旦進入植物體內就會大量複製並傳遍整個植物體。該病具有爆發突然、擴展迅速、危害性強、無法治療的特點，是一種毀滅性的番茄病害，植株一旦發病，尤其是在開花前發病，果實產量及商品價值均大幅度下降，嚴重時造成的損失可達100%。TYLCV屬於雙生病毒屬，其分布範圍受媒介昆蟲——煙粉蝨的限制。化學方法控制煙粉蝨是一種有效地方法，但是商業上殺蟲劑的濫用使得煙粉蝨產生抗性，並且誘變出20種不同的番茄侵染性病毒。就像化學殺線蟲一樣，由於TYLCV對殺蟲劑產生抗性以及對過量使用殺蟲劑對公眾健康的考慮，化學方法控制TYLCV也逐漸減少。利用遺傳工程創造轉基因抗性植株同樣的成為一種有效地措施。這種技術解決了化學方法的弊端，並且也使番茄對線蟲、TYLCV及其他病原菌產生了抗性。直到今天，抗性基因的自然滲入依然是控制番茄病原體的重要方法。關於抗番茄黃化曲葉病(TYLCV)的報導已有近40年，Cohen於1964年首次報導了一些抗性基因型，隨後在野生材料智利番爺(51多毛番爺(51 habrochaites)>秘魯番爺(51.醋慄番爺(5: pimpinellifoliuni)都分離出了抗性基因，但這些基因對番茄黃化曲葉病毒病並不是完全免疫的。在1990’s，Pilowsky和Cohen (2000)報導了 5: 的抗性，其具有5個相關的隱性基因。以色列農業研究中心利用5:peruvianum (PI 126926, PI 126930, PI 390681 和 LA441)培育了一系列高抗 TYLCV 的育種系。Michelson發現了 5: 對TYLCV的抗性。抗性受控於I個主效基因(命名為Ty-1，為部分顯性遺傳)和至少2個以上的修飾基因。這個抗性位點指Ty位點,5: chiIense中的抗性位點命名為Ty-1。Zamir將該Ty位點定位在第6號染色體的著絲粒部位。Ty-1等位基因為顯性基因，因此，Ty-1/ Ty-1和Ty-1/+都具有TYLCV抗性。由於整合單個顯性基因相對容易，因此該主效抗性 基因Ty-1得以廣泛應用，帶有該抗性基因的雜交種也在市場上大面積推廣種植。野生番茄5: habrochai tes中LA386、LA1777等對TYLCV也表現較高水平的抗性，研究發現該抗性是由I個主效基因和幾個修飾基因所控制。另外該野生種5: habrochai tes 『B6013』中，有2個上位基因控制其對TYLCV的抗性，育種家由此育成了H24，之後相關研究證明H24攜帶Ty-2基因。Hanson等(2000)將其定位在11號染色體長臂上；Garcia等(2007)進一步將其定位在長臂終端，與SCAR (Sequence characterizedamplified region)標記T0302緊密連鎖，遺傳距離在5.0 cM以內。引物T0302F/T0302R和T0302F/TY2R1能夠有效地檢測基因型ty2/ty2和TY2/TY2。亞疏中心(AVRDC)在番茄育種進程中將Ty-2基因作為基本抗源，利用H24培育了一系列抗病自交系。Ty-3是最新報導的TYLCV抗性基因。Ji等(2007)利用感病材料5: Iycopersicum (7781)和抗TYCV的高代自交系(021108)，5: Chilense中LA2779的漸滲系雜交得到的F2群體，將Ty-3基因定位於第6染色體長臂上cLEG-31-P 16 (20 cM)和C2_At5g41480 (27 cM)之間。其為一個主效位點，可以解釋60%的植株TYLCV抗性強度。LA4440是S.Chilense中LA2779的漸滲系，令人感興趣的是，該品系兼抗TYLCV和ToMoV，抗性區域不僅包括Ty-3還包含Ty-1(Agrama and Scott, 2006),兩者間的遺傳距離僅15 cM。在一個基因型中同時存在Ty-1和Ty-3基因可能提供更高的抗性。Ty-4也來自於來源於野生智利番茄，位於3號染色體，為輔助增效基因，可以解釋16%抗性程度變化。Ty-4單獨存在時，抗性水平表現一般，與其他抗性標記同時存在時，能顯著提高品系的抗性水平(Ji et al.2009)。Ty_5來自於4個秘魯番爺，位於4號染色體,為專性抗病基因(Anbinder et al., 2009)。目前市場上推廣應用的品種只是具有上述一個抗性基因，耐病品種只有Ty-1抗性基因，普遍抗性弱，僅有一定的耐病性。而具有Ty-2的抗性品種只有專性抗性，具有地區選擇性。Ty-3抗性基因也是屬於不完全顯性抗性，在純合的Ty-3基因型抗性強。目前尚沒有一個抗性基因對TYLCV所有生理小種均有抗性。所以市場上推廣的品種，普遍存在抗性效應差，抗性有選擇性，抗 性退化等問題，如果能將上述2個或2個以上的抗性基因聚合到同一個品系中，就會產生更加穩定持久的抗性。但是由於番茄黃化曲葉病毒病的抗性遺傳比較複雜，抗源材料不同，其抗性遺傳規律也不同，有的抗源材料的抗性是屬於不完全顯性的單基因控制，有的是數量性狀，還有的是顯性單基因。所以通過雜交進行不同效應基因的聚合育種，並進行抗性評價，才能培育抗性更穩定的育種品系。綜上所述，鑑於黃化曲葉病毒病發生的普遍性以及危害的嚴重性，必須兼具多個TYLCV抗性基因綜合抗性，才有較高的並且穩定持久的抗病性，市場推廣應用才有可能。但是採用常規技術很難把它們聚合在同一個基因型中。

發明內容
針對市場上缺乏具有TYLCV持久穩定抗性的優質番爺品種,而利用傳 統技術難以對抗病基因Ty-2，Ty-3和Ty_4進行聚合，同時去除不利農藝 性狀的連鎖累贅的問題。本發明旨在提供一種快速聚合番茄黃化曲葉病毒 病多個抗性基因的引物及方法。快速聚合番茄黃化曲葉病毒病多個抗性基因的引物，包括三對引物，S卩引物對Ty2-caps, Ty3- caps 和 Ty4_scar,其中:
Ty2_caps 正向引物 Seq ID N0.1 Ty2_caps_F: 5』- AGC TGA TGA aca cct cgt gacatC -3，;
Ty2_caps反向引物Seq ID N0.2 Ty2_caps-R: 5』 CTC GCG CCA AGT CAA TTG CTT GG-
3，；Ty3-caps正向引物Seq ID N0.3 Ty3-caps_F: 5，- AGT CTG GTG GTG MT AGG CAT CA
_3，；
Ty3_caps 反向引物Seq ID N0.4 Ty3_caps-R: 5』 TTA GTA CCC CAA GGG MC MG AGT-
3，；
Ty4-scar 正向引物 Seq ID N0.5 Ty4-scar_F:5，- GCG GAC TTG GAT GAT GAC ACG GCCTG -3，;
Ty4-scar 反向引物Seq ID N0.6 Ty4-scar-R: 5，GCT CAC TTT GCA MT CAC ATC CCCATC - 3，。一種利用所述的引物快速聚合番茄黃化曲葉病毒病多個抗性基因的方法，其步驟包括:
(1)將分別攜有黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2、Ty-3或Ty_4抗性基因的番茄植株進行雜交，獲得Fl代雜交種，並進行多代自交，獲得不同世代的自交系；
(2)利用所述的三對 引物對各自雜交系進行篩選，獲得純合Ty2/Ty2、Ty-3/Ty_3與Ty-4/ Ty-4基因，並具有穩定抗黃化曲葉病毒病的番茄自交系。所獲得的番茄自交系至少包括Ty-2、Ty-3與Ty_4黃化曲葉病抗性等位基因。利用引物對 Seq ID N0.1 Ty2-caps_F 與 Seq ID N0.2 Ty2_caps-R 對自交系是否含有純合Ty2/Ty2基因進行鑑定，鑑定方法為:
(1)提取各單株幼苗總DNA，利用引物對SeqID N0.1 Ty2-caps_F與Seq ID N0.2Ty2-capS-R 進行 PCR 擴增；
(2)對PCR產物進行TfeaI限制性內切酶進行酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳，若只有一條425 bp DNA片段，則該單株幼苗中含有純合Ty2/Ty2基因。利用引物對 Seq ID N0.3 Ty3-caps_F 與 Seq ID N0.4 Ty3_caps-R 對自交系是否含有純合Ty3/Ty3基因進行鑑定，鑑定方法為:
(1)提取番茄單株幼苗總DNA，利用引物對SeqID N0.3 Ty3-caps_F與Seq ID N0.4Ty3-capS-R 進行 PCR 擴增；
(2)對PCR產物進行Taql酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳，若有兩條條帶，則該單株中含有純合的黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3/Ty_3。利用引物對 Seq ID N0.5 Ty4-scar-F 與 Seq ID N0.6 Ty4_scar-R 對自交系是否含有純合Ty4/Ty4基因進行鑑定，鑑定方法為:
(1)提取番茄單株幼苗總DNA，利用引物對SeqID N0.5 Ty4-scar_F與Seq ID N0.6Ty4-scar-R 進行 PCR 擴增；
(2)利用瓊脂糖凝膠電泳，若有一條600bp的條帶，則該單株中含有純合的黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-4/Ty_4。本發明所涉及的可供商業化品種滿足市場多方面的需求，包括較好的農藝性狀，較高的作物產量，較強的TYLCV抗性以及良好的商品性等更多。特別是，本發明涉及產生高抗TYLCV的番茄品種。商業雜種的選育需要首先形成純合的穩定親本。在育種項目中，從2個或更多個種質或基因池中存在的多個目標性狀聚合到優勢育種品種中。需要的自交系或親本系通過連續的自交與選擇最好的育種系，並利用分子標記加快選育過程。根據目前發明所指，一個是穩定的親本材料，另一個包括配製的Fl代雜交種。穩定親本材料是指能夠開放授粉的自交系，目標性狀通過多輪自交與種植以後還是穩定的。本發明的有益效果:
1.等位基因特異性PCR技術具有特異性高、重複性好以及費用低廉等優點。將其應用到植物的分子育種中可以加速育種世代，節約時間和人力。由於這樣的分子標記實際上就是功能基因本身局部片斷的擴增結果，所以能非常可靠地直接鑑別該功能基因，具有極好的實際應用效果。2.以分子標記為依據，可以準確地確定雜交後代單株中是否含有Ty-2，Ty-3和Ty-4基因的結合狀態，從而篩選出同時含有Ty-2，Ty-3和Ty-4的單株，在短時間內實現這3個基因的聚合和純化，進而選育出具有穩定抗性的番茄新品種。


圖1 番茄單株利用 Seq ID N0.1 Ty2-caps_F /Seq ID N0.2 Ty2_caps-R 引物PCR擴增產物T&al酶切後電泳結果。M，100 bp DNA ladder; I為感病單株，有一條540 bp條帶；2為抗病單株，有一條425 bp的條帶。3為ddH20對照。圖2 番茄單株利用 Seq ID N0.3 Ty3-caps_F/Seq ID N0.4 Ty3_caps-R 引物 PCR擴增產物T1ai7I酶切後電泳結果。M，100 bp DNA ladder; 1，2為感病單株，只有一條1235bp的條帶；3，4為抗病單株，有2條分別為860 bp與375bp的條帶；3為ddH20對照。圖3番茄單株利用Seq ID N0.5 Ty4-scar_F/ Ty3_scar-R引物PCR擴增產物電泳結果。M, 100 bp DNA ladder; I為ddH20對照,2, 3為抗病單株,有一條600 bp的條帶；4，5為抗病單株，無條帶。
具體實施例方式以下結合附圖和具體實施方式
對本發明做進一步的說明。利用分子標記技術可以有效地鑑別目標基因，實現目標基因的累加和聚合。為此我們快速聚合多個TYLCV不同效應的抗性基因，培育具有多個抗性位點的番茄新種質提供了可能性。本發明是以篩選TYLCV抗性基因特異性分子標記為核心，以分子標記輔助選擇為基礎，把Ty-2，Ty-3以及Ty_4多個抗性基因聚合到番茄同一自交系中，培育出對黃化曲葉病毒病具有穩定持久抗性的番茄新品種，具有非常廣闊的市場前景和推廣應用價值。本發明包括以下步驟:
(I)利用TYLCV抗性試驗篩選抗病資源。TYLCV抗性試驗篩選指的是:在自然狀態下種植番茄植株，在這種環境下黃化曲葉病毒自然進行侵染，使用0-4的侵染指數來對植株的感病情況進行一次或多次評定。O級:無症狀；1級:葉片輕微發黃；2級:葉片明顯發黃，並且出現卷葉，植株部分組織有症狀；3級:植株發育遲緩，葉片嚴重發黃且捲曲，整個植株出現嚴重症狀；4級:植株發育嚴重遲緩，具有發黃的、捲縮的小葉。當一個番茄品種或株系平均病情指數在0-1級的，即可鑑定為其對TYLCV具有抗性；中度抗性平均發病指數大約為2 ; 而敏感型的病情指數均在3以上。(2)抗黃化曲葉病毒病基因Ty-2連鎖分子標記的篩選
本發明利用分子標記分析方法篩選了一個同Ty-2緊密連鎖的Caps分子標記，可用於早期鑑定具有Ty-2抗性的番茄種質以及分離單株。這對Ty2caps擴增引物包括正向引物:Seq ID N0.1 Ty2_caps_F: 5，- AGC TGA TGA aca cct cgt gac atC _3，;與反向引物Seq ID N0.2 Ty2_caps-R: 5』 CTC GCG CCA AGT CAA TTG CTT GG- 3』。PCR反應擴增產物直接利用fcal限制性內切酶進行酶切反應，再根據電泳條帶大小就可以區分抗病類型與感病類型，並從中鑑定出Ty-2/Ty-2類型的番茄單株。(3)抗黃化曲葉病毒病基因Ty-3連鎖分子標記的篩選
本發明利用序列分析方法篩選了一個同Ty-3緊密連鎖的Ty3-caps分子標記，可用於早期鑑定具有Ty3抗性的番茄種質以及單株。用於篩選的CAPs引物對為:正向引物Seq IDN0.3 Ty3-caps-F: 5』- AGT CTG GTG GTG AAT AGG CAT CA -3』 與反向引物 Seq ID N0.4Ty3-caps-R: 5』 TTA GTA CCC CAA GGG AAC AAG AGT- 3』。PCR 反應體系總體積 25 μ I,包括 2.5 μ I 2.5 mM dNTPs, 5 μ I 5X buffer, 2.5 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.1 μ I (0.5units) Taq DNA polymerase, 2.5 μ I 10 μ M 正向引物，2.5 μ I 10 μ M 反向引物，5μ I ddH20以及5 μ I DNA抽提物。PCR反應程序:94 °C變性3 min, 33次循環包括94° C變性30 S，55 °C退火I min, 72 °C延伸I min.最後72 °C保持7 min。PCR擴增產物通過Taql酶切後能較好地區分感病類型(ty-3)與抗病類型(Ty_3)，並從中篩選出純合的Ty3/Ty3抗病植株類型。(4)抗黃化曲葉病毒病基因Ty-4連鎖分子標記的篩選
本發明設計並驗證了一對SCAR擴增引物，其中正向引物:Seq ID N0.5 Ty4-scar_F:5，- GCG GAC TTG GAT GAT GAC ACG GCC TG -3，;與反向引物 Seq ID N0.6 Ty4-scar-R:5』 GCT CAC TTT GCA AAT CAC ATC CCC ATC - 3』 。PCR反應體系為:2.5μ1 2.5 mM dNTPs, 2.5 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.2 μ I (1.0units) Taq polymerase, 2.5 μ I 10 μ M正向引物，2.5 μ I 10 μ M反向引物以及5 μ IDNA抽提物，5 μ I 5Χ buffer,加入約5 μ I dd H2O,使總反應體積為25 μ I。PCR反應程序:94 °C變性3 min,然後94 ° C變性30 s, 53 °C退火I min, 72 °C延伸I min,共循環35次。在72 0C溫浴10 min後，在4 °C保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增片段，根據PCR條帶可以成功地區分番茄植株是否攜帶有Ty-4基因。(6)穩定抗病自交系的培育
利用含有純合Ty-2基因的番茄自交係為母本，含有Ty-3以及Ty-4抗性基因的野生番茄自交係為父本雜交，獲得同時含有Ty-2，Ty-3與Ty_4等三個抗性基因雜合體F1代，通過上述雜交獲得的F1群體通過自交獲得不同的F2群體。收穫的F2代種子播于田間，利用實驗室接種鑑定結合田間接種鑑定技術，對分離群體的每個單株進行抗黃化曲葉病毒病評價。同時取F2代單株苗期嫩葉，提取基因組DNA後利用上述篩選的3對分子標記引物組合進行檢測，分析其抗病基因類型，選擇同時出現這三個基因分子標記的個體，即含有純合抗TYLCV病毒基因Ty2Ty2/Ty3Ty3/Ty4Ty4。上述含有Ty2\T y3\Ty4純合基因型的番茄單株種植在溫室，進一步在田間觀察其抗病性。選擇抗病性強的單株進行自交，並留下F3代種子。入選的F3株系在苗期利用室內接種法評價各株系的病情指數，並利用上述3對PCR引物組合鑑定抗TYLCV基因類型，選擇包含有3個抗病基因的單株，種植于田間，待田間評價其抗病特性後，選擇抗性株系中的優良單株自交留種，獲得F4代種子。
F4代種子播於人工氣候室內，評價其抗病性，並利用上述3對PCR引物組合鑑定抗TYLCV基因類型，選擇包含有3個抗病基因的單株自交留種。F4代自交後篩選即可獲得的性狀穩定的目標自交系。
實施例(I)黃化曲葉病毒病(TYLCV)抗性鑑定方法
在天然的高發地塊大田種植接種本地病毒鑑定植株抗性是一個優先選擇的方法。番茄幼苗生長在田間通過接種人工飼養帶毒(TYLCV)煙粉風(汝 isia tabaci )進行天然接種。在田間觀察接種後植株的發病症狀，每個單株發病嚴重程度都需統計3次，第3次統計分析數據才用於評價最準確的抗性水平，減少逃逸可能性。TYLCV病毒病的病症通常分為0-4級。O級:無症狀；1級:葉片輕微發黃；2級:葉片明顯發黃，並且出現卷葉，植株部分組織有症狀；3級:植株發育遲緩，葉片嚴重發黃且捲曲，整個植株出現嚴重症狀；4級:植株發育嚴重遲緩，具有發黃的、捲縮的小葉。當一個番茄品種或株系平均病情指數在0-1級的，即可鑑定為其對TYLCV具有抗性；中度抗性植株平均發病指數大約為2 ;而敏感型植株的病情指數均在3以上。(3)抗黃化曲葉病毒病基因Ty-2連鎖分子標記的篩選。Ty-2來源於多毛番爺(5:是目前番爺抗TYLCV品種選育中主要抗性來源。Hanson等(2000)將其定位在第11染色體長臂上RFLP分子標記TG36與TG393相距19 cM片段區間，而Ji等(2009)進一步將其定位在C2_Atlg07960 (82.5 cM)與C2_At4g32930 (88 cM)之間共5.5 cM的片段上，其中SGN上公布的BAC_119J05位於這一區間內。根據業已公布的番爺全基因組序列(http://www.sgn.Cornell, edu),通過比較抗性品種與感病品種在這一端的DNA序列差異，利用Primerf.0設計了一對CAPs擴增引物，其中正向引物:Seq ID N0.1 Ty2_caps_F: 5』- AGC TGA TGA aca cct cgt gac atC-3，;與反向引物 Seq ID N0.2 Ty2_caps-R: 5』 CTC GCG CCA AGT CAA TTG CTT GG- 3』。反應體系:2.5 μ I 2.5 mM dNTPs, 2.0 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.1 μ I (0.5 units) Taqpolymerase, 2.5 μ I 10 μΜ正向引物，2.5 μ I 10 μΜ反向引物以及5 μ I DNA抽提物20 ng DNA)，5 μ I 5X buffer,加入約 5 μ I dd H2O,至 25 μ I 反應總體積。在PCR擴增儀上按以下反應程序進行:先94 °C變性3 min,然後34次循環包括94 °(:變性30 S，56 °C退火45 S，72 °C延伸I min，最後在72 °C保持7min。PCR擴增產物利用
1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色後，在紫外燈下拍照。結果顯示利用該對引物在不同基因型中均可擴增540-bp左右的一條清晰條帶。將上述PCR產物直接進行酶切反應。取上述10 μ I PCR混合產物，加入 0.25 μ I BSA, 0.5 μ I Rsal 限制性內切酶(NEB Inc.)，2.5μ I IOXbuffer (NEB Inc.)，加上約 12 μ I ddH20,至 25 μ I 的反應總體積。在 37 °C水浴鍋溫浴2 h.再利用1.8%瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示酶切後感病植株有一條540 bp條帶，而Ty-2類型植株酶切後變小，只有425 bp,酶切片段約70 bp左右不能顯示(圖1)。這樣可以成功地區分番茄單株是否攜帶了 Ty-2基因。(4)抗黃化曲葉病毒病基因Ty-3連鎖分子標記的篩選
Ty-3是最新報導的TYLCV 抗性基因。LA4440是L.Chilense中LA2779的漸滲系，該品系兼抗TYLCV和ToMoV，抗性區域不僅包括Ty-3還包含Ty-1，兩者間的遺傳距離小於15CM。在一個基因型中同時存在7>-7和基因可能提供更高的抗性。其中位於第六染色體上的Ty3區間可以解釋65%的TYLCV抗性變異。通過該25 cM區間序列分析可以發現，Ty3同抗雙生病毒的抗性株系連鎖，而ty-3同感病植株連鎖。進一步分析發現，在Ty3與ty-3植株類型中在BAC clone AY678298從171300-173050的位置存在著多個SNP差異標記。野生型(ty-3)在該區域無/^<7 I酶切位點，而抗性突變體Ty3類型有I個TaqI酶切位點。根據以上序列特性，成功設計了一對Caps引物，可以清楚地擴增單一條帶，通過酶切後能較好地區分抗病與感病不同類型，篩選出純合的Ty3/Ty3植株類型。利用Primer3.0設計擴增引物Ty3_caps,其中正向引物:Seq ID N0.3Ty3-caps-F: 5』- AGT CTG GTG GTG AAT AGG CAT CA -3』；反向引物 Seq ID N0.4Ty3-caps-R: 5』- TTA GTA CCC CAA GGG AAC AAG AGT- 3』。PCR 反應體系:總體積 25μ I,包括2.5 μ I 2.5 mM dNTPs, 5 μ I 5X buffer, 2.5 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.1 μ I(0.5 units) Taq DNA polymerase, 2.5 μ I 10 μ M 正向引物，2.5 μ I 10 μ M 反向引物，5 μ I ddH20以及5 μ I DNA抽提物。PCR反應程序:94 °C變性3 min, 33次循環包括 94 0C 變性 30 S，55 °C 退火 I min, 72 °C 延伸 1.5 min.最後 72 °C 保持 10 min。PCR擴增產物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳顯示利用該對引物在不同基因型中均可擴增1235-bp左右的一條清晰條帶。酶切反應體系:10 μ I PCR反應混合物，0.25 μ I BSA, I μ I T^I限制性內切酶，3 μ 10 X buffer,再加上11 μ I ddH20,至25 μ I的反應總體積。在65 °C水浴鍋溫浴3 h.再利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示酶切後野生型植株還是僅有一條1235bp條帶，而Ty3植株類型有兩條條帶，分別為860 bp與375 bp (圖1)
(4)抗黃化曲葉病毒病基因Ty-4連鎖SCAR分子標記的篩選
Ty-4同Ty-3 —樣來源於智利番爺(5:其位於第3染色體的長臂端分子標
記 C2_Atlg02140 (71 cM)與 TG599 (85 cM)之間(Ji et al.2009)。根據其公布的序列結合測序結果，發現在抗性品種基因組的DNA序列中存在少數Indel片段(Maxwell，2009)，根據這些片段設計引物，最終利用Primerf.0設計了並驗證了一對SCAR擴增引物(Ji etal.2009)，其中正向引物:Seq ID N0.5 Ty4-scar-F: 5』- P3-81-F:5』 -GCG GAC TTGGAT GAT GAC ACG GCC TG -3』 ;與反向引物 Seq ID N0.6 Ty4-scar-R: 5』 -GCT CAC TTTGCA AAT CAC ATC CCC ATC - 3』 。PCR 反應體系為:2.5 μ I 2.5 mM dNTPs, 2.5 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.2 μ I (1.0units) Taq polymerase, 2.5 μ I 10 μ M 正向引物，2.5 μ I 10 μ M 反向引物以及 5μ I DNA 抽提物( 20 ng DNA), 5 μ I 5X buffer,加入約 5 μ I dd H2O,使總反應體積為25 μ I。PCR反應程序:94 °C變性3 min,然後94 °C變性30 s, 53 °C退火Imin, 72 °C延伸I min,共循環35次。在72 ° C溫浴10 min後，在4 °C保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增片段，EB染色後，在紫外燈下拍照。結果顯示利用該對引物在抗性品種中可以擴增一條600-bp左右的一條清晰條帶，而對照與感病基因型中並沒有相應條帶。由此可以成功地區分番茄植株是否攜帶有Ty-4基因。(5)聚合Ty-2，Ty_3和Ty_4基 因到同一個基因型中
利用含有純合Ty-2基因的栽培番茄自交系H24 (美國番茄種質資源庫)為母本，以含有Ty-3以及Ty-4抗性基因的野生番茄5: Chilense LA2779/LA1932的漸滲系024525為父本雜交，獲得同時含有Ty-2，Ty-3與Ty_4等3個抗性基因雜合體F1代，通過上述雜交獲得的F1群體通過自交獲得不同的F2群體。收穫的F2代種子播于田間，利用實驗室接種鑑定結合田間接種鑑定技術，對分離群體的每個單株進行抗黃化曲葉病毒病評價，在不同生育期評價3次。同時取F2代單株苗期嫩葉，提取基因組DNA後利用上述篩選的3對分子標記引物組合進行檢測，分析其抗病基因類型。在匕分離群體中，會出現不同的基因型，其中有少量植株同時含有Ty-2，Ty-3與Ty-4純合基因型，從自交後代中剔除雜合基因型，選擇同時出現這3個基因分子標記的個體，即含有純合抗TYLCV病毒基因Ty2Ty2/Ty3Ty3/Ty4Ty4。(6)高抗黃化曲葉病毒病番茄優良自交系的選擇
上述含有Ty2\Ty3\Ty4純合基因型的番茄單株種植在溫室，進一步在田間觀察其抗病性。選擇抗病性強的單株進行自交，並留下F3代種子。入選的F3按株系播種後，在苗期利用室內接種法評價各株系的病情指數以及抗病植株所佔比例。利用上述3對PCR弓丨物組合鑑定抗TYLCV基因類型，選擇包含有3個抗病基因的單株，種植于田間，待田間評價其抗病特性後，選擇抗性株系中的優良單株自交留種，獲得F4代種子。F4代種子播於人工氣候室內，在苗期利用室內接種法評價各株系的病情指數以及抗病植株所佔比例。利用上述3對PCR引物組合鑑定抗TYLCV基因類型，選擇包含有3個抗病基因的單株，種植于田間，待田間評價其抗病特性後，選擇抗性株系中的優良單株自交留種。F4代自交後篩選即可獲 得的性狀穩定的目標自交系。
權利要求
1.一種快速聚合番茄黃化曲葉病毒病多個抗性基因的引物，其特徵在於，包括三對引物，即引物對 Ty2_caps, Ty3- caps 和 Ty4_scar,其中:Ty2_caps 正向引物 Seq ID N0.1 Ty2_caps_F: 5』- AGC TGA TGA aca cct cgt gacatC -3，;Ty2_caps反向引物Seq ID N0.2 Ty2_caps-R: 5』 CTC GCG CCA AGT CAA TTG CTT GG-3，；Ty3_caps 正向引物Seq ID N0.3 Ty3-caps_F: 5』- AGT CTG GTG GTG MT AGG CAT CA_3，；Ty3_caps 反向引物Seq ID N0.4 Seq ID N0.4 Ty3_caps-R: 5』 TTA GTA CCC CAA GGGAAC AAG AGT- 3，；Ty4-scar 正向引物Seq ID N0.5 Ty4-scar_F:5，- GCG GAC TTG GAT GAT GAC ACG GCCTG -3，;Ty4-scar 反向引物 Seq ID N0.6 Ty4-scar-R: 5』 GCT CAC TTT GCA AAT CAC ATC CCCATC - 3，。
2.一種利用如權利要求1所述的引物快速聚合番茄黃化曲葉病毒病多個抗性基因的方法，其特徵在於，其步驟包括: (1)將分別攜有黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2、Ty-3或Ty_4抗性基因的番茄植株進行雜交，獲得Fl代雜交種，並進`行多代自交，獲得不同世代的自交系； (2)利用所述的三對引物對各自雜交系進行篩選，獲得純合Ty2/Ty2、Ty-3/Ty_3與Ty-4/ Ty-4基因，並具有穩定抗黃化曲葉病毒病的番茄自交系。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所獲得的番茄自交系至少包括Ty-2、Ty-3與Ty-4黃化曲葉病抗性等位基因。
4.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，利用引物對SeqID N0.1 Ty2-caps_F與SeqID N0.2 Ty2-caps-R對自交系是否含有純合基因進行鑑定，鑑定方法為: (1)提取各單株幼苗總DNA，利用引物對SeqID N0.1 Ty2-caps_F與Seq ID N0.2Ty2-capS-R 進行 PCR 擴增； (2)對PCR產物進行TfeaI限制性內切酶進行酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳，若只有一條425 bp DNA片段，則該單株幼苗中含有純合Ty2/Ty2基因。
5.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，利用引物對SeqID N0.3 Ty3-caps_F與Seq ID N0.4 Ty3-caps-R對自交系是否含有純合Ty3/Ty3基因進行鑑定，鑑定方法為: (1)提取番茄單株幼苗總DNA，利用引物對SeqID N0.3 Ty3-caps_F與Seq ID N0.4Ty3-capS-R 進行 PCR 擴增； (2)對PCR產物進行Taql酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳，若有兩條條帶，則該單株中含有純合的黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3/Ty_3。
6.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，利用引物對SeqID N0.5 Ty4-scar_F與Seq ID N0.6 Ty4-scar-R對自交系是否含有純合Ty4/Ty4基因進行鑑定，鑑定方法為: (1)提取番茄單株幼苗總DNA，利用引物對SeqID N0.5 Ty4-scar_F與Seq ID N0.6Ty4-scar-R 進行 PCR 擴增；(2)利用瓊脂糖凝膠電泳，若有一條600bp的條帶，則該單株中含有純合的黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-4/Ty-4。`
全文摘要
本發明公開了一種快速聚合番茄黃化曲葉病毒病多個抗性基因的引物及方法。根據番茄基因組DNA序列特徵篩選兩對分別與抗黃化病毒病Ty-2與Ty-3緊密連鎖的CAPs分子標記，篩選了一對與抗黃化曲葉病毒病基因Ty-4緊密連鎖的SCAR分子標記；將分別含有黃化病毒病抗性基因Ty-2，Ty-3，Ty-4的番茄親本雜交，並通過多代自交，利用篩選的分子標記為依據鑑定單株，獲得含有Ty-2，Ty-3與Ty-4純合基因，並具有穩定黃化曲葉病毒病抗性的優良自交系。本發明具有特異性高、重複性好以及費用低廉等優點，可以加速育種世代，節約時間和人力。短時間內實現這3個基因的聚合和純化，進而選育出具有穩定抗性的番茄新品種。
文檔編號C12Q1/68GK103103185SQ20131003344
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月29日 優先權日2013年1月29日
發明者盧鋼, 鄭積榮, 陳景麗, 王潔, 朱翔飛, 陳麗妃 申請人:浙江大學