一種促進轉基因番茄生長和蝦青素積累的栽培方法
2023-04-24 01:05:31
一種促進轉基因番茄生長和蝦青素積累的栽培方法
【專利摘要】促進轉基因番茄生長和蝦青素積累的栽培方法，以蝦青素轉基因番茄為材料，播種轉基因番茄種子，出苗兩個月後的幼苗移栽於栽培溫室中，將轉基因番茄幼苗分別用尼龍網遮陰處理，用量子照度計測定光強分別為遮光75％，50％，30％及全光照四個光照梯度進行處理，分別於花期和果期進行光合作用測定，並於果實成熟時分三次採收，測定果中蝦青素含量；種植期間，日常規律澆水，保證水分狀態良好，並使用風機及溼簾進行降溫處理，定期除蟲防病。本發明以蝦青素轉基因番茄為細胞工廠高效生產蝦青素的材料，在光照強度為日照30％條件下，轉基因番茄光合能力及果實蝦青素含量最佳，為進一步建立富含蝦青素的轉基因番茄人工高效種植技術體系奠定了基礎。
【專利說明】一種促進轉基因番茄生長和蝦青素積累的栽培方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，具體地，涉及一種促進轉基因番茄生長和蝦青素積累 的栽培方法。
【背景技術】
[0002] 光合生物參與光合作用的類胡蘿蔔素（如β -胡蘿蔔素、葉黃素和玉米黃素）為 非酮式類胡蘿蔔素，是人體合成維生素 Α的唯一來源。一些單細胞綠藻在逆境下還能合成 和積累酮式類胡蘿蔔素（ketocarotenoid),如奸青素（astaxanthin)。奸青素獨特的分 子結構和極強的抗氧化活性賦予它高效的抗輻射，抗衰老，抗腫瘤和預防心血管等疾病的 功能。這使蝦青素成為保健和美容等行業的新寵。然而天然蝦青素的來源非常有限，人類 一般通過食用海鮮（如蝦、蟹和三文魚）獲得蝦青素。微藻來源的蝦青素生產成本高且難 以突破其產量瓶頸而致其價格非常昂貴，發掘新的天然蝦青素資源具有重大的意義。中國 科學院昆明植物研究所黃俊潮研究組與香港大學/北京大學的陳峰教授合作，經過十餘年 的努力，首次實現了以番茄為細胞工廠高效生產蝦青素的目標（1，2, 3)，使利用經濟作物 產業化生產高價值天然蝦青素成為可能。番茄是我國設施栽培的主要蔬菜之一，為茄科 (Solanaceae)番茄屬一年生草本植物，其產量多與栽培條件密切相關，只有保持適當的栽 培條件，才能獲得優質高產。光合作用是番茄生育和產量形成的基礎，而番茄光合作用除受 植株本身內在因素的制約外，還與各種環境因素密切相關。因此，在設施栽培條件下，有必 要根據番爺光合特性與環境之間的關係，來確定提高番爺光合作用能力的栽培和環境管理 措施。其中，如何選擇適宜的光照強度成為限制番茄生長及生產的關鍵問題（4, 5, 6, 7)。目 前，如何通過調節設施栽培環境條件從而促進蝦青素轉基因番茄植株的生長及果實蝦青素 含量積累的方法仍屬空白。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在於以蝦青素轉基因番茄為材料，研究不同光照強度下對轉基因番 茄生長發育、生理特性及果實蝦青素含量的影響，旨在為蝦青素轉基因番茄高效栽培和果 實蝦青素含量積累提供技術，為栽培過程中的光照管理提供方法。最終實現提供通過調節 設施栽培環境條件從而促進蝦青素轉基因番茄植株的生長及果實蝦青素含量積累的方法。
[0004] 為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：
[0005] 促進轉基因番茄生長和蝦青素積累的栽培方法，以蝦青素轉基因番茄為材料，播 種轉基因番茄種子，出苗兩個月後的幼苗移栽於栽培溫室中，將轉基因番茄幼苗分別用尼 龍網遮陰，用量子照度計測定光強分別為遮光75 %，50 %，30 %及全光照四個光照梯度進行 處理，分別於花期和果期進行光合作用測定，並於果實成熟時分三次採收，測定其中蝦青素 含量；種植期間，日常規律澆水，保證水分狀態良好，並使用風機及溼簾進行降溫處理，定期 除蟲防病。
[0006] 根據所述的栽培方法，其中所述蝦青素轉基因番茄是保藏號為CGMCC No 9223號 的轉基因番茄。
[0007] 根據所述的栽培方法，其中光強採用遮光30%的光照。
[0008] 根據所述的栽培方法，其中栽培溫室位於Alt. 1942m;北緯25° 8 z 14"，東經 102° 44 13"。
[0009] 根據所述的栽培方法，其中光強採用全光照和30%遮陰條件時，轉基因番茄植株 的光合速率高，光合能力強，植株生理活性強，生長和結實好。
[0010] 蝦青素是具有極高價值的酮式類胡蘿蔔素，然而來源非常有限。本發明以蝦青素 轉基因番茄為細胞工廠高效生產蝦青素為材料，利用不同的光照強度梯度栽培蝦青素轉基 因番茄，實驗結果表明在光照強度為日照30%條件下，轉基因番茄光合能力及果實蝦青素 含量最佳，是蝦青素轉基因番茄生長的適宜光強，為進一步研究富含蝦青素的轉基因番茄 人工高效種植技術體系的建立奠定了技術基礎。
【具體實施方式】
[0011] 下面用本發明實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但並不以此來限定本發 明。
[0012] 實施例1 :
[0013] 1.材料和方法：
[0014] 1.1研究材料：
[0015] 2013年6月播種蝦青素轉基因番茄（黃俊潮等（Huang JC等，2013)通過基因工程 方法將綠藻中篩選和分離到能催化植物細胞中β-胡蘿蔔素和玉米黃素成蝦青素的酮化 酶和羥化酶基因轉入野生型番茄植株（cv. UC82B)中，得到的轉基因番茄（已於2014年5月 14日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為：CGMCC No 9223 號，分類命名：蝦紅1號轉基因番茄。）種子苗120株，出苗後兩個月移栽於昆明植物研究 所栽培溫室中（Alt. 1942m ;北緯 25° 8 z 14"，東經 102° 44 z 33")。
[0016] 1.2研究方法：
[0017] 1.2. 1實驗設計：將轉基因番茄幼苗分別用尼龍網遮陰處理，用量子照度計測定 光強分別為遮光75 %，50 %，30 %及全光照四個光照梯度進行處理，每個處理30株，分別於 花期和果期進行光合作用測定。並於果實成熟時分三次採收，測定其中蝦青素含量。種植 期間，日常規律澆水，保證水分狀態良好，並使用風機及溼簾進行降溫處理，定期除蟲防病。
[0018] 1. 2. 2光響應曲線測定：利用可攜式氣體交換系統（LI-6400, LiCor Inc. Nebraska. USA)測定不同光強度下的光合作用速率獲得光響應曲線。光響應曲線在0? 180(^111〇11^28 -1的範圍內設置12個光梯度（1800，1600，1200、1000、800、600、400、300、200、 100、50、20和0 μ molnT2s_1)。測定時，葉室內葉溫分別維持在25°C，C02濃度為400 μ mol πιοΓ1，相對溼度60%左右，平衡2-3min左右記錄讀數，每個處理重複三次。利用光合助手 軟體（Photosyn Assistant，VI. 1，Dundee Scientific，UK)擬合光合響應曲線。
[0019] 1. 2. 3二氧化碳響應曲線測定：利用可攜式氣體交換系統（LI-6400, LiCor Inc. Nebraska. USA)測定不同二氧化碳強度下的光合作用速率獲得二氧化碳響應曲線。維持光 強在1200 mol m2s \ (1)2濃度由0 mol mol 1逐漸升至1800 mol mol、實驗結束後， 使用光合助手軟體（Photosyn Assistant，VI. 1，Dundee Scientific，UK)擬合光響應曲線 及二氧化碳響應曲線。
[0020] 1. 2. 4果實蝦青素含量的測定：分三次隨機採收成熟果實，用噴霧乾燥機進 行乾燥處理採收品，幹樣送至昆明植物研究所分析測試中心委託測定。測定方法：將 冷凍乾燥好的樣品粉碎、裝袋、密封，進行蝦青素含量測定，測定採用高效液相色譜法 分離，其液相條件：色譜柱為WatersSpherisorb 0SD2 (5 μ m, 4. 6, 250mm)，液相型號為 Waters (Milford, MA，USA)，進樣量為 20 μ 1 ;流動相 A 相為乙腈 / 甲醇/Tris -HCL (pH 8.0)， 體積比為84:2:14,B相為甲醇/乙酸乙酯，體積比為68:32 ;以1. 2mL/min的流速線性梯度 洗脫色素，從100% A相到100%的B相，每個梯度用時15分鐘，隨後用B相洗脫10分鐘， 通過比對各顏色組分和標準品的光譜吸收和相對保留時間來鑑定各組分，通過將峰面積的 積分值與標準品對比將其轉化為濃度值從而對各組分進行定量，標準品購買自sigma公司 和Wako公司。
[0021] 1.2. 5數據分析：所有數據都是使用統計軟體SPSS 16. 0 for Windows(SPSS Inc.，Chicag〇，USA)進行分析，不同處理間（內）的差異比較採用單因素方差分析（AVOVA) 和LSD檢驗。
[0022] 2.結果與討論
[0023] 2. 1不同光照梯度下轉基因番茄的光合特性比較：
[0024] 番茄是喜強光的蔬菜作物，不同的光照強度對番茄光合作用有顯著影響。光系統 Π 的最大光化學效率（FV/FM)通常用來表徵植物光系統運轉及受損情況，在不同光照條件 下，轉基因番茄的光系統II的最大光化學效率沒有顯著差異，並維持在0. 74以上水平，表 明其在四個光照梯度下光系統沒有顯著性受損情況，均能夠進行正常的光合作用（表1)。 不同光照處理下轉基因工程番茄的光合能力有顯著性差異，轉基因番茄的飽和光合速率在 全光照條件下顯著高於30%遮陰，30%遮陰條件下的飽和光合速率顯著高於50%和75% 遮陰條件（表1)。轉基因番茄的光飽和點表現出全光照和30%遮陰條件下顯著高於50% 和75%遮陰條件，表明生長光強越強，轉基因番茄利用光照的能力越強，同時表明轉基因番 茄對生長的光照強度有較好的可塑性。因此，光照強度越強（遮陰度越低），轉基因番茄的 飽和光合速率越高，光合能力越強。對轉基因工程番茄的生長和生產來說，遮陰會顯著影響 植株的光合能力從而影響植株的生長和結實。
[0025] 表1四個不同光照處理下蝦青素轉基因番茄光合參數比較
[0026]
【權利要求】
1. 促進轉基因番茄生長和蝦青素積累的栽培方法，以蝦青素轉基因番茄為材料，播種 轉基因番茄種子，出苗兩個月後的幼苗移栽於栽培溫室中，將轉基因番茄幼苗分別用尼龍 網遮陰，用量子照度計測定光強分別為遮光75 %，50 %，30 %及全光照四個光照梯度進行處 理，分別於花期和果期進行光合作用測定，並於果實成熟時分三次採收，測定其中蝦青素含 量；種植期間，日常規律澆水，保證水分狀態良好，並使用風機及溼簾進行降溫處理，定期除 蟲防病。
2. 根據權利要求1所述的栽培方法，其特徵在於所述蝦青素轉基因番茄是保藏號為 CGMCC No 9223號的轉基因番茄。
3. 根據權利要求1所述的栽培方法，其特徵在於光強採用遮光30%的光照。
4. 根據權利要求1所述的栽培方法，其特徵在於栽培溫室位於Alt. 1942m;北緯 25。8 z 14"，東經 102。44 z 33"。
5. 根據權利要求1所述的栽培方法，其特徵在於光強採用全光照和30%遮陰，轉基因 番爺植株光合速率高，光合能力強，植株生理活性強，生長和結實好。
【文檔編號】A01G1/00GK104145678SQ201410403560
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月15日 優先權日:2014年8月15日
【發明者】常瑋, 王 華, 胡虹, 嚴寧, 黃俊潮 申請人:中國科學院昆明植物研究所