一種抗體製劑的冷凍乾燥方法及其製品與流程
2023-04-24 01:08:04 2
1.本發明涉及生物製藥領域，具體涉及一種抗體製劑的冷凍乾燥方法及其製品。
背景技術：
2.免疫球蛋白e(immunoglobulin e)ige是導致哮喘過敏症狀的主要原因，抗ige人源 化單抗是第一個用於治療哮喘的人源化的治療性抗體(奧馬珠單抗xolair)，也是第一個被認 可的針對ige抗體設計的治療方法。新型生物製劑如抗ig e單克隆抗體對ig e介導的變態 反應性疾病的治療是安全有效的。局部性超敏反應性疾病較急性全身性超敏反應更為常見， 其發生的部位與變應原進入機體的途徑有關，如呼吸道超敏反應、消化道超敏反應和皮膚超 敏反應等均屬於這類反應性疾病。抗ige單克隆抗體可以抑制ige與肥大細胞和嗜鹼性粒細 胞表面高親和力ige受體(fcεri)結合，從而限制了介導過敏反應的物質的釋放。這類抗體還 可使嗜鹼性粒細胞表面的fcεri減少，從而達到治療i型過敏性反應的目的。
3.以液體製劑的形式儲存的蛋白，更容易發生理化反應，比如發生脫醯胺反應、被其他物 質氧化或水解，其次當蛋白在水溶液中濃度過高時容易聚集，注入人體後易產生免疫反應。 更重要的是，液體製劑在長途運輸中，劇烈震蕩會使蛋白質容易變性。而冷凍乾燥(凍幹)是 指把藥品溶液冷凍成固體，然後在真空條件下升華乾燥，除去冰晶，待升華結束後再進行解 析乾燥，除去部分結合水的乾燥方法。由於凍幹藥品呈多孔狀、能長時間穩定貯存、並且重 新復溶於水而恢復活性，因此冷凍乾燥技術廣泛應用於製備固體蛋白質藥物、口服速溶藥物 及藥物包埋劑脂質體等藥品。凍幹製劑相比液體製劑能顯著的提高蛋白藥物的穩定性。
4.目前新上市的單克隆抗體藥物也逐漸開始採用凍幹製劑，如xolair，kadcyla等。
5.在生物凍幹製劑的凍幹工藝過程中要考慮到藥品的理化特性、藥液的分裝厚度、瓶頸的大小、 凍幹機組的控溫和抽真空能力等一系列參數，並對溶液中溶質中濃度、選擇的保護劑加以優 化，以及預凍、抽空、升華於燥、解析乾燥、壓塞、貯存等步驟中對溫度、壓力、時間等參 數的控制，做出合適的凍幹曲線，制訂出更為合理的凍幹工藝，對凍幹藥品質量、縮短生產 周期和降低成本都起著不可忽視的重要作用。
6.製劑凍幹過程包括預凍，循環冷凍2步。預凍時間不少於1.5小時，更優選3-8小時。 抽真空和循環冷凍是同時進行，程序化步驟，循環冷凍不少於15小時。凍幹後藥品含水量 不高於3％。
7.其中，預凍過程中改變冷凍速率可以改變藥液中晶體結構，影響凍幹速度及復溶等表現。 已有標準的單抗類凍幹工藝採用速凍的方式進行預凍，將速凍作為單抗凍乾產品標準化的預 凍步驟；基因泰克公司針對於其抗ige抗體製劑處方專利，曾採用較為快速的預凍方式以制 備凍幹品。常規抗體凍幹製劑的預凍操作，通常是直接降溫至-40℃至-50。℃採用1.33℃/min 的降溫速率進行預凍的傳統凍幹工藝所獲的產品，經加水稀釋後復溶速度緩慢，較難溶解， 容易形成粘稠的膠狀物，復溶時間非常長，平均復溶時間為100min。
技術實現要素：
8.為了克服上述現有技術的不足，本發明一方面提供了一種抗體的冷凍乾燥方法，其包括 以下步驟：
9.1)製備抗體原液並定容；
10.2)在速凍前預冷步驟1)製備的抗體原液；
11.3)將步驟2)預冷後的抗體原液快速降溫至-45℃並乾燥。
12.在本發明一些實施例中，將所述步驟2)中的抗體原液預冷至4℃。
13.在本發明一些實施例中，所述步驟3)的降溫速率為1.5-1.7℃/分鐘；
14.在一些優選的實施例中，所述步驟3)的降溫速率為1.7℃/分鐘。
15.在本發明一些實施例中，所述抗體是抗ige人源化單克隆抗體。
16.另一方面，本發明還提供了一種抗體凍幹製劑，其特徵在於，
17.所述抗體凍幹製劑根據上述冷凍乾燥方法製備。
18.在本發明一些實施例中，本發明提供的抗體凍幹製劑，由如下步驟的方法製備：
19.1)製備抗體原液並定容；
20.2)將定容後的抗體原液分裝後預冷至4℃；
21.3)將預冷後的抗體原液置於降溫速率設為1.7℃/分鐘的冷凍乾燥機；
22.4)將冷凍乾燥機的擱板溫度降至-45～-55℃；
23.5)當樣品溫度降至-45℃時，保持0.5小時後開始抽真空；
24.6)當真空度達到20
±
2pa時，開始升溫；
25.7)將擱板溫度升至-25至-30℃，樣品溫度達到-26℃後，結束第一次乾燥；
26.8)將擱板溫度升至30℃，真空度設為0.1pa，保溫3小時完成乾燥。
27.本發明的有益效果
28.本發明提供的抗體製劑的冷凍乾燥方法製備的抗體凍幹製劑外觀疏鬆、飽滿、完整， 相對常規凍幹工藝所得的抗體製劑，穩定性顯著提高，易於生產和貯存，且復溶性好，經復 溶後抗體理化性質及活性沒有顯著變化。
29.本發明採用1.5-1.7℃/min的降溫速率將液體製劑速凍，整體呈疏鬆狀結構，底部基本 沒有緻密結構產生平均復溶時間為20min，所獲得產品的預凍、乾燥效率更好。因此，預凍 速度的優化能夠顯著提高抗ige單克隆抗體製劑的性質。本發明公開的凍幹製劑溶解後粘滯 度較低，注射使用方便。
30.該凍幹製劑的主要優點：(1)該凍幹製劑極大的減少了抗ige單克隆抗體在儲存過程中 的降解和聚集，顯著提高其穩定性，甚至在高溫光照等不利條件下也能在一定時期內保持穩 定，更有利於長期儲存或運輸。(2)該凍幹製劑復溶迅速，復溶前後蛋白理化性質及活性沒 有顯著變化，適於注射給藥。
具體實施方式
31.下面結合具體的實施例詳細說明本發明的內容，但這些實施例並不構成對本發明的限制。
32.本實施例中所用試劑耗材來自如下廠商。
33.無水醋酸鈉(scharlau)，磷酸二氫鈉(scharlau)，酸氫二鈉(jtbake)，聚山梨酯20
(merck)， 聚山梨酯80(fluka)，泊洛沙姆188(sigma)，nacl(scharlau)，甘露醇(jtbaker)，山梨醇(sigma)， 甘氨酸(sigma)，海藻糖二水合物(sigma)，精氨酸鹽酸鹽(arg-hcl，scharlau)，組氨酸(上 海協和胺基酸有限公司)，鹽酸組氨酸一水合物(上海協和胺基酸有限公司)，蔗糖(pf)， 氯化鈉(江蘇勤奮)，ps80(南京威爾)，鹽酸精氨酸(無錫晶海)，ps20(南京威爾)。
34.抗體為諾華的奧馬珠單抗。
35.實施例1
36.步驟一：抗體原液製備
37.將濃度為40mg/ml的奧馬珠單抗加入含有蔗糖濃度8mg/ml、組氨酸濃度0.356mg/ml 和組氨酸鹽酸鹽一水合物濃度0.553mg/ml的緩衝液中，再加入濃度為200.099mg/ml的吐溫、 濃度為1.28mg/m1的氯化鈉，混勻後定容。
38.步驟二：抗體的冷凍乾燥
39.使用步驟一定容的原液按5ml/支的裝量灌裝至6ml國標規格的西林瓶中(共灌裝20支， 其中10支灌裝後靜置2h，另外10支灌裝後直接推入凍幹機中進行凍幹)，其餘西林瓶灌裝 5ml裝量的空白對照，按照表1的工藝參數設定進行凍幹。
40.表1.
[0041][0042]
步驟三：凍幹樣品復溶測試
[0043]
凍幹後樣品的復溶試驗數據請參考表2。
[0044]
表2
[0045][0046][0047]
結果：
[0048]
由表2可知，按表2中的參數設置，復溶的凍幹品外觀有脫壁現象，切割西林瓶取出粉 餅觀察底部，發現有明顯白色沉澱。同樣對粉餅進行上、下等重切割後稱量，結果表顯示上、 下濃度和滲透壓有差異，復溶時間有明顯改變。分析凍幹曲線，發現預凍速率整體比大的凍 幹設備快，另外凍幹樣品數量較小時，預凍、乾燥效率會更好。下一步考慮在預凍速度上進 行改善優化。
[0049]
實施例2
[0050]
步驟一：抗體原液製備
[0051]
將濃度為40mg/ml的奧馬珠單抗加入含有蔗糖濃度8mg/ml、組氨酸濃度0.356mg/ml 和組氨酸鹽酸鹽一水合物濃度0.553mg/ml的緩衝液中，再加入濃度為200.099mg/ml的吐溫、 濃度為1.28mg/m1的氯化鈉，混勻後定容。
[0052]
步驟二：抗體的冷凍乾燥
[0053]
預凍溫度為-45℃：配置濃度38～40g/l的抗體原液，並採用速凍工藝凍幹製成成品：使 用抗體原液按5ml/支的裝量灌裝至6ml國標規格的西林瓶中(共灌裝20支，其中10支灌 裝後靜置2h，另外10支灌裝後直接推入凍幹機中進行凍幹)，其餘西林瓶灌裝5ml裝量的 空白對照，按照表3的工藝參數設定點進行凍幹。
[0054]
表3.
[0055][0056][0057]
步驟三：凍幹樣品復溶測試
[0058]
凍幹後樣品的復溶試驗數據請參考表4.
[0059]
表4.
[0060][0061]
結果：
[0062]
由表4可知，凍幹品有脫壁現象，切割凍幹品觀察底部，發現白色沉澱現象消失；從表 4復溶結果可知，復溶時間明顯優於對照品，說明採用在預凍參數加快預凍速率，可以在一 定程度上改善凍幹品底部白色沉澱現象，並縮短復溶時間。
[0063]
實施例3
[0064]
步驟一：抗體原液製備
[0065]
將濃度為40mg/ml的奧馬珠單抗加入含有蔗糖濃度8mg/ml、組氨酸濃度0.356mg/ml 和組氨酸鹽酸鹽一水合物濃度0.553mg/ml的緩衝液中，再加入濃度為200.099mg/ml的吐溫、 濃度為1.28mg/m1的氯化鈉，混勻後定容。
[0066]
步驟二：抗體的冷凍乾燥
[0067]
在滿載狀態下實施第二次速凍實驗以進一步驗證速凍的凍幹效果。為進一步加快冷凍速 率同時有利於生產過程的工藝參數可控性，在速凍工藝基礎上加入樣品4℃預冷，
並控制預 凍降溫速率。預凍參數和修改後的凍幹工藝參數如表5和表6所示。
[0068]
表5.
[0069][0070]
表6
[0071][0072][0073]
步驟三：凍幹樣品復溶測試
[0074]
凍幹後樣品的復溶試驗數據請參考表7.
[0075]
表7.
[0076][0077]
結果：
[0078]
此次凍幹品外觀也有脫壁現象，粉餅底無白色沉澱產生；從表7可知，此次凍幹品復溶 時間與實施例2基本一致，但凍幹品進行上、下切割後，濃度和滲透壓上、下差異較小，粉 餅上下顏色、濃度、滲透壓變異不明顯，說明在預凍速率是保證抗體凍幹品品質的關鍵。由 本次實驗可知，板層降溫速率設置為1.7℃/min能夠滿足本發明抗體製劑的速凍需求，速凍 前置於4℃預冷對之後的速凍工藝有幫助，能夠在維持抗體製劑穩定性的條件下有效縮短復 溶時間。