兩個MSTN-shRNA慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制的製作方法
2023-05-19 16:32:46 1
專利名稱：兩個MSTN-shRNA慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因的研究，依據兩個對肌肉生長抑制素基因(MSTN)具有顯著抑制作用的shRNA幹擾分子的設計、慢病毒載體的構建及慢病毒的製備、濃縮、測定的過程。
背景技術：
RNA幹擾(RNA interference, RNAi)技術，是指將特異性雙鏈RNA (dsRNA)導入到細胞內，使目的基因不表達或表達抑制的一種技術。目前實驗室常用的siRNA主要有單鏈 siRNA寡核苷酸、shRNA質粒表達載體和慢病毒表達載體。利用RNAi技術，構建shRNA質粒表達載體，人為導入siRNA，對目的基因進行沉默，關鍵在於獲得與目標基因匹配的靶序列。 獲得有效抑制目標基因表達的shRNA分子，成為了 RNAi技術應用的重要環節。肌肉生長抑制素基因(myostatin，簡稱MSTN)是一種抑制肌肉細胞增殖生長的負調控基因，屬於TGF- β家族成員，故又稱為GDF8基因。研究表明，該基因表達的抑制或突變失活，能阻斷MSTN對肌細胞增殖生長的抑制作用，引起廣泛的肌肉增殖並顯著降低體表脂肪的沉積，產生以肌纖維數量顯著增加、體重顯著增大為特徵的肌肥大現象，即所謂的「雙肌性狀」。目前，關於MSTN基因shRNA分子的研究，只在小鼠及山羊品種上見到報導。如2006 年Thomas R，2008年劉超武，2009年Hemlata Jain的報導。Thomas R最初從5條siRNA分子中篩選到1條具有幹擾作用的分子，該分子的靶序列位於MSTN cDNA序列4 位點。該序列與小鼠、大鼠、人、牛MSTN基因序列100%同源，但與綿羊、山羊、豬等物種沒有同源性。 針對其它大型家畜品種MSTN-RNAi的研究，如綿羊、山羊、豬等，均未見報導，同時也未發現有關MSTN基因pLL3. 7慢病毒幹擾載體的相關報導。本發明根據綿羊MSTN基因cDNA序列，自行設計合成了 shRNA分子，通過功能驗證，從設計的shRNA分子庫中，篩選並首次獲得了顯著抑制綿羊MSTN基因的shRNA分子，兩條shRNA分子具有序列的專一性及品種的獨特性，對深入探討家畜肌肉生長發育的分子調控機制和研製促進家畜肌肉生長的生物製劑具有重要意義和廣闊的應用前景。
發明內容
本發明的目的在於根據綿羊MSTN基因cDNA序列，自行設計合成了 shRNA分子， 通過功能驗證，兩條shRNA分子具有序列的專一性及品種的獨特性，對深入探討家畜肌肉生長發育有著前瞻性的研究價值。本發明的目的是這樣實現的兩個MSTN-shRNA慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制，1)根據GeneBank中綿羊MSTN基因從啟始密碼(ATG)至終止密碼(TGA)共lU8bp 編碼區序列；2)人工設計合成並篩選到兩條對綿羊MSTN基因有顯著抑制作用的shRNA分子，該分子是由核苷酸組成的特定序列，且一條shRNA分子由上下遊兩條DNA互補單鏈組成，其中一的上遊序列為 5 『 -ATCTCTTGAATGTCTTATAGCATCTTTGCA-3，；下遊序列為 5 『 -TCGA GAAAAAAGCAAAGATGCTATAAGACATCTCTTGAATGTCTTATAGCATCTTTGC A-3 『，其中二的上遊序列5，-TGTACAAGGTATACTGGAATTTCAAGAGAATTCCAGTATACCTTGTACTTTTTTC-3，；下遊序列 5』 -AAA AAAGTACAAGGTATACTGGAATTCTCTTGAAATTCCAGTATACCTTGTAC A-3，；3)將合成的兩條互補單鏈經退火形成雙鏈的shRNA分子後，分別連接到pLL3. 7慢病毒幹擾載體上，構建了 2個慢病毒RNA幹擾質粒(MSTN-shRNA) ；4)通過定量螢光PCR及^festern blot從mRNA及蛋白水平分析了 MSTN的表達，在mRNA水平上抑制效率可達58%以上，而對MSTN蛋白的抑制可達 80%以上；5)完成對MSTN-shRNA慢病毒的製備、濃縮及測定。所述慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制，shRNA慢病毒載體的構建是各取 10 μ 1 10 μ m的兩條互補單鏈核苷酸，加入10 μ 1 IOXannealing buffer和70 μ 1滅菌超純水，煮沸10分鐘後自然冷卻至室溫，同時將pLL3. 7質粒載體經BioI和HpaI雙酶切後回收線性化質粒，與退火產物4°C過夜連接，連接產物轉化0冊3感受態細胞，用LB平板氨苄青黴素100μ g/μ 1的篩選，將上遊載體檢測引物及下遊shRNA寡核苷酸引物篩選陽性克隆並送上海生工測序鑑定序列正確後，提取純化重組質粒用於轉染。所述慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制，shRNA病毒載體與MSTN表達質粒共轉染細胞，轉染按每孔4 X IO5個/mL的細胞密度將細胞接種於六孔板，用2ml 含有10%胎牛血清的DMEM培養液培養細胞，24h後細胞達到70% 80%匯合度時，將Iyg 的shRNA幹擾載體與MSTN表達質粒混合液及6 μ 1的Lipo-fectamine2000分別加入250 μ 1無血清的OPTI- MEM I培養基中，混勻後室溫下放置20分鐘；將質粒DNA和脂質體複合物加入含1. 5毫升無血清DMEM培養液的細胞中，輕輕混勻，37°C、5% C02培養箱培養6小時後，更換為含有10%胎牛血清的DMEM完全培養液，培養48小時後收穫細胞，用 Trizol法提取總RNA及細胞蛋白裂解液提取蛋白。所述慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制，MSTN-shRNA慢病毒的製備、濃縮及測定；製備鋪板每IOcm面積中接種3X IO6個四31~細胞，保證培養液中匯合度達到 80% -90%左右；在1. 5ml預熱的Opti-MEM培養基中加入由轉染載體MSTN-shRNA 12 μ g、 包裝質粒REV6 μ g、pMDL6 μ g、包膜質粒VSVG6 μ g混合所得的Lipictamine2000脂質體；而後，在另一個管中加入1. 5ml預熱的Opti-MEM培養基，再加入90 μ lLipictamine2000,輕輕混勻後室溫放置；5分鐘後，將上述稀釋好的DNA與脂質體混合，混合物於室溫孵育20分鐘；在此期間可以用Opti-MEM培養基清洗待轉染的細胞一次，然後將脂質體和DNA複合物加入細胞，上下傾斜細胞板使液體均勻覆蓋在細胞表面後，將細胞放回37°C培養箱，培養4 小時後，換15ml新鮮的DMEM完全培養基，繼續培養48小時後收集病毒；濃縮將細胞上清液裝於15ml離心管中，2500rpm離心15min，用IOml注射器吸取上清液，通過0. 45 μ m過濾器過濾，收集濾過液；取5ml將其分裝至1. 5ml離心管裡，此時的病毒能直接用來轉染，或置於_70°C備用；另取IOml病毒濾過液將其裝於50ml離心管中， 35000rpm離心2小時(Beckman，SW^轉頭)；離心後，可在管底見透明狀沉澱物，棄掉上清液，用吸頭吸掉殘餘的液體，室溫靜置5分鐘，待液體揮發乾淨後，按1 1000倍濃縮，加入 10 μ 1滅菌PBS，4°C靜置過夜；第二天，分裝至1. 5ml離心管中，置於_70°C或液氮中備用；測定消化待感染的細胞，懸浮、計數，將細胞按4Χ IO5個接種6孔板，M小時後，進行感染，將濃縮的重組Ientinvirus按照1,0. 1,0. 01,0. 001,0. 0001,0. 00001倍共 6個梯度用培養液進行稀釋，分別加入6孔細胞中，同時加入聚凝胺，終濃度為10 μ g/ml，搖勻，然後把細胞置於37°C培養箱裡孵育14-1他1·，換新鮮的DMEM完全培養基，37°C培養箱培養48小時後，用200 μ 1 0. 05%的胰酶消化細胞，消化完全後，加入Iml完全培養基終止消化，置於1. 5ml離心管中，3000rpm離心IOmin後，棄去上清，用Iml PBS懸浮細胞，將細胞吸入透明塑料管中，使用流式細胞儀測定EGFP螢光細胞陽性率。所述慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制，篩選的第一條shRNA序列其特異性結合序列在MSTN cDNA序列218位點處，故命名為MSTN_shRNA_218 ；第二條shRNA序列在 548 處故命名為 MSTN-shRNA-548。所述慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制，實驗選用的藥劑均為市售產品。本發明所設計的核苷酸引物序列如下
權利要求
1.兩個MSTN-shRNA慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制，其特徵在於1)根據 GeneBank中綿羊MSTN基因從啟始密碼(ATG)至終止密碼(TGA)共lU8bp編碼區序列；2) 人工設計合成並篩選到兩條對綿羊MSTN基因有顯著抑制作用的shRNA分子，該分子是由核苷酸組成的特定序列，且一條shRNA分子由上下遊兩條DNA互補單鏈組成，其中一的上遊序列為 5 『-ATCTCTTGAATGTCTTATAGCATCTTTGCA-3，；下遊序列為 5 『-TCGAGAAAAAAGCAAAGATGC TATAAGACATCTCTTGAATGTCTTATAGCATCTTTGC A-3 『，其中二的上遊序列 5，-TGTACAAGGTATA CTGGAATTTCAAGAGAATTCCAGTATACCTTGTACTTTTTTC-3』 ；下遊序列 5』 -AAAAAAGTACMGGTATAC TGGAATTCTCTTGAAATTCCAGTATACCTTGTAC A-3，；3)將合成的兩條互補單鏈經退火形成雙鏈的shRNA分子後，分別連接到pLL 3. 7慢病毒幹擾載體上，構建了 2個慢病毒幹擾RNA質粒 (MSTN-shRNA) ；4)通過定量螢光PCR及Western blot從mRNA及蛋白水平分析了 MSTN的表達，在mRNA水平上抑制效率可達58 %以上，而對MSTN蛋白的抑制可達80 %以上；5)完成對MSTN-shRNA慢病毒的製備、濃縮及測定。
2.根據權利要求1所述慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制，其特徵在於 shRNA慢病毒載體的構建是各取10μ 1 ΙΟμπι的兩條互補單鏈核苷酸，加入10 μ 1 IOXannealing buffer和70 μ 1滅菌超純水，煮沸10分鐘後自然冷卻至室溫，同時將 PLL3. 7質粒載體經BioI和HpaI雙酶切後回收線性化質粒，與退火產物4°C過夜連接，連接產物轉化Dffia感受態細胞，用LB平板氨苄青黴素100 μ g/ μ 1的篩選，將上遊載體檢測引物及下遊shRNA寡核苷酸引物篩選陽性克隆並送上海生工測序鑑定序列正確後，提取純化重組質粒用於轉染。
3.根據權利要求1所述慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制，其特徵在於shRNA 病毒載體與MSTN表達質粒共轉染細胞，轉染按每孔4 X IO5個/mL的細胞密度將細胞接種於六孔板，用2ml含有10%胎牛血清的DMEM培養液培養細胞，24h後細胞達到 70% 80%匯合度時，將IygW shRNA幹擾載體與IygW MSTN表達質粒混合液及6 μ 1 的Lipo-fectamine2000分別加入250 μ 1無血清的OPTI-MEM I培養基中，混勻後室溫下放置20分鐘；將質粒DNA和脂質體複合物加入含1. 5毫升無血清DMEM培養液的細胞中，輕輕混勻，37°C、5% C02培養箱培養6小時後，更換為含有10%胎牛血清的DMEM完全培養液， 培養48小時後收穫細胞，用Trizol法提取總RNA及細胞蛋白裂解液提取蛋白。
4.根據權利要求1所述慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制，其特徵在於 MSTN-shRNA慢病毒的製備、濃縮及測定；製備鋪板每IOcm面積中接種3X106f^3T細胞，保證培養液中匯合度達到 80% -90%左右；在1. 5ml預熱的Opti-MEM培養基中加入由轉染載體MSTN-shRNA 12 μ g、 包裝質粒REV6 μ g、pMDL6 μ g、包膜質粒VSVG6 μ g混合所得的Lipictamine2000脂質體；而後，在另一個管中加入1.5ml預熱的Opti-MEM培養基，再加入90 μ 1 Lipictamine2000，輕輕混勻後室溫放置；5分鐘後，將上述稀釋好的DNA與脂質體混合，混合物於室溫孵育20分鐘；在此期間可以用Opti-MEM培養基清洗待轉染的細胞一次，然後將脂質體和DNA複合物加入細胞，上下傾斜細胞板使液體均勻覆蓋在細胞表面後，將細胞放回37°C培養箱，培養4 小時後，換15ml新鮮的DMEM完全培養基，繼續培養48小時後收集病毒；濃縮將細胞上清液裝於15ml離心管中，2500rpm離心15min，用IOml注射器吸取上清液，通過0. 45 μ m過濾器過濾，收集濾過液；取5ml將其分裝至1. 5ml離心管裡，此時的病毒能直接用來轉染，或置於_70°C備用；另取IOml病毒濾過液將其裝於50ml離心管中， 35000rpm離心2小時(Beckman，SW^轉頭)；離心後，可在管底見透明狀沉澱物，棄掉上清液，用吸頭吸掉殘餘的液體，室溫靜置5分鐘，待液體揮發乾淨後，按1 1000倍濃縮，加入 10 μ 1滅菌PBS，4°C靜置過夜；第二天，分裝至1. 5ml離心管中，置於_70°C或液氮中備用；測定消化待感染的細胞，懸浮、計數，將細胞按4Χ IO5個接種6孔板，24小時後， 進行感染，將濃縮的重組Ientinvirus按照1,0. 1,0. 01,0. 001,0. 0001,0. 00001倍共6個梯度用培養液進行稀釋，分別加入6孔細胞中，同時加入聚凝胺，終濃度為10μ g/ml，搖勻， 然後把細胞置於37°C培養箱裡孵育14-1他1·，換新鮮的DMEM完全培養基，37°C培養箱培養 48小時後，用200 μ 1 0. 05%的胰酶消化細胞，消化完全後，加入Iml完全培養基終止消化， 置於1. 5ml離心管中，3000rpm離心IOmin後，棄去上清，用ImlPBS懸浮細胞，將細胞吸入透明塑料管中，使用流式細胞儀測定EGFP螢光細胞陽性率。
5.根據權利要求1所述慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制，其特徵在於 篩選的第一條shRNA序列其特異性結合序列在MSTN編碼區218位點處，故命名為 MSTN-shRNA-218 ；第二條 shRNA 序列在 548 處故命名為 MSTN_shRNA_548。
6.根據權利要求1所述慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制，其特徵在於實驗選用的藥劑均為市售產品。
全文摘要
本發明公開的兩個MSTN-shRNA慢病毒載體的構建和對MSTN基因的抑制，其中1)根據GeneBank中綿羊MSTN基因從啟始密碼(ATG)至終止密碼(TGA)共1128bp編碼區序列；2)人工設計合成並篩選到兩條對綿羊MSTN基因有顯著抑制作用的shRNA分子，且一條shRNA分子由上下遊兩條DNA互補單鏈組成；3)將合成的兩條互補單鏈經退火形成雙鏈的shRNA分子後，分別連接到pLL3.7慢病毒幹擾載體上，構建了2個慢病毒RNA幹擾質粒(MSTN-shRNA)；4)通過螢光定量PCR及Western b1ot從mRNA及蛋白水平分析了MSTN的表達，在mRNA水平上抑制效率可達58％以上，而對MSTN蛋白的抑制可達80％以上；5)完成對MSTN-shRNA慢病毒的製備、濃縮及測定。
文檔編號C12N15/867GK102181481SQ20101058005
公開日2011年9月14日 申請日期2010年12月9日 優先權日2010年12月9日
發明者劉明軍, 劉晨曦, 唐森, 張雪梅, 李文蓉 申請人:新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心