菠蘿中性轉化酶基因Ac-NI1、其編碼蛋白質以及其基因克隆方法

2023-05-19 16:30:11 1

專利名稱：菠蘿中性轉化酶基因Ac-NI1、其編碼蛋白質以及其基因克隆方法
技術領域：
本發明涉及一種基因技術，屬於生物技術領域，具體涉及一種菠蘿中性轉化酶基 因Ac-Nil、其編碼蛋白質以及其基因克隆方法。
背景技術：
轉化酶的分子量大小在50kD至SOkD之間，為單體或二聚體，可分為酸性轉化酶 (Al)和中性或鹼性轉化酶(Ni)，催化如下反應Suc+H20 —— Fru+Glu。NI大多被認為是 一種胞質酶，其最適PH值在7. 0左右，也可分為可溶性的和不溶性的兩種，前者分布於細胞 質中，後者存在於細胞壁上(Lowell和Tomlinson，1989 ;Klann等，1996 ;Xu等，1995)。在 Lesculentum番茄果實液泡中有高活性的Ivr，所以液泡中積累了大量的果糖和葡萄糖， 蔗糖的含量很少。在L. perur和L. chmielewskii番茄果實中液泡Ivr活性極低，所以在液 泡中大量積累蔗糖，而果糖和葡萄糖的含量很少(D』 Aoust等，1999)。近年來研究表明，在 蘋果(趙智中等，2001)、溫州蜜柑(Beurter，1985)果實的發育早期蔗糖積累受Ivr影響較 大，幼果內蔗糖的積累與Ivr的活性呈顯著負相關。『紐荷爾』臍橙幼果中轉化酶對糖的積 累影響較大(王利芬等，2004)。寧夏枸杞果實發育過程中，蔗糖的含量與3種代謝酶均無 顯著相關性，己糖的積累與轉化酶活性呈現極顯著的正相關，SS和SPS與這幾種糖均不存 在顯著的相關性(鄭國琦等，2008)。楊梅果實發育期間中，轉化酶的變化與蔗糖積累呈負 相關(謝鳴等，2005)。可見，Ivr是蔗糖在這些果實內代謝的一個關鍵酶。目前已從葡萄、桃、櫻桃、蘋果、草莓、甘蔗、柑橘、甜瓜等作物中克隆到相應的轉 化酶基因。在模式植物擬南芥中已分離出9個編碼NI的基因(The Arabidopsis Genome Initiative2000)；在水稻中已分離出8個基因編碼NI的基因(International Rice Genome Sequencing Project2005) 0從胡蘿蔔中克隆的NI的N_端無信號肽，富含半胱氨 酸，且與AI的同源性很低(Lee和Sturm，1996)。從桃中分離出的編碼NI基因的cDNA，命 名為PpNIl，長為1578bp，與胡蘿蔔中的NI基因的同源性高達84%的，含有NI基因典型 的高保守盒，屬於NI基因家族的α亞族(Nonis等，2007)。在甘蔗中分離出的編碼NI的 SNI基因片段，含有1. 7kb的開放閱讀框，編碼572個胺基酸，分子量約為64. 3kDa，等電點 為8. 57 (Bosch等，2004)。從甜菜中分離NI的編碼基因BVInv-N，含有特有的開放閱讀框， 編碼617個胺基酸，分子量為69. 5KDa，等電點為6. 84，在這個基因兩端有兩個特殊區域， 5'具有長為197bp的非編碼區，而在3'除含有439bp的非編碼區還有一個poly-A尾巴 (Maria-Cruz 等，2007)。轉化酶基因的表達也呈現時空特異性。目前在桃、葡萄、日本梨、胡蘿蔔、甘蔗的等 作物中已有許多轉化酶基因的相關報導，但在菠蘿上未發現相關研究報導。為此，對菠蘿中 性轉化酶基因的克隆以及在不同發育時期的表達進行研究，將有助於弄清菠蘿果實糖積累 的分子機理，同時獲得可應用於菠蘿果實品質改良的基因資源。

發明內容
本發明的目的在於提供一種菠蘿果實中性轉化酶基因Ac-NIl的核苷酸序列，其 核苷酸序列如SEQ ID NO :1，含1034bp。本發明的另一個目的在於提供一種菠蘿果實中性轉化酶基因Ac-NIl編碼的蛋白 序列，含345個胺基酸殘基，含有植物中性轉化酶結構域，其胺基酸序列如SEQ ID NO :2。同時，本發明還提供該中性轉化酶基因Ac-NIl的克隆方法。本發明所提供的中性轉化酶基因，來自菠蘿(Ananas comosus)，命名為Ac-NIl基 因，核苷酸序列如SEQ ID NO =I0上述菠蘿果實中性轉化酶基因Ac-NIl編碼的蛋白質，來自菠蘿(Ananas comosus)，命名為Ac-NIl蛋白質，其胺基酸序列如SEQ ID NO :2。上述菠蘿果實中性轉化酶基因Ac-NIl的克隆方法，包括如下步驟(1)選用菠蘿果實作為實驗材料，採用改良SDS法提取菠蘿果實中的總RNA，RNA含 量及質量採用瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)以獲得的總RNA為模板，採用Takara公司生產的mRNA Selective PCR Kit進 行反轉錄獲得cDNA ；(3)根據NCBI資料庫中的EST信息設計菠蘿Ac-NIl基因編碼區引物正向引物5，-CAG(T/C)T(T/G/A)CAGAG(C/T)TGGGAGA-3，如SEQ ID NO 3反向引物5，-GTGTC(A/G)TA(A/C)TA(T/C)TCAGGCCA-3『如SEQ ID NO 4用第一鏈反轉錄產物10 μ 1作為PCR的模板，反應體系為10XPCR Buffer II 2. 5 μ l,25mM MgCl2 1. 5μ IUOmM dNTP/analog Mixture 1 μ 1、ExTaq 0· 2 μ 1、上遊引物 (20 μ Μ) 1 μ 1、下遊引物(20 μ Μ) 1 μ 1、再補足Rnase Free H2O至總體積25 μ 1 ；擴增程序為 85°C變性 lmin，54°C復性 lmin，72°C延伸 2min，30 個循環後，72°C總延伸 IOmin0(4)PCR產物回收後與pGEM-T easy Vector連接，連接產物轉化Ε· coli DH 5 α 感受態細胞，採用藍白斑法篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經PCR進一步驗證後測序，獲得 Ac-NIl 基因。本發明的有益效果是本發明涉及一種菠蘿果實中性轉化酶基因Ac-NIl及其編碼的蛋白質和該基因的 克隆方法。該基因來自菠蘿(Ananas comosus)，因此該基因的大量表達，有利於果糖和葡萄 糖的積累，改變了果實中糖分的組成和比例，從而改變了果實的品質。
具體實施例方式下面結合具體實例對本發明做進一步詳細的描述，這些實施例只用來說明本發 明，並不限制本發明的範圍。菠蘿果實中性轉化酶基因Ac-NIl的分子克隆選用峇里菠蘿果實作為實驗材料，提取果肉中的總RNA。以獲得的總RNA為模 板，反轉錄合成cDNA。根據NCBI資料庫中的EST信息設計菠蘿Ac-NIl基因編碼區引 物正向引物5，-CAG (T/C) T (T/G/A) CAGAG (C/T) TGGGAGA-3，，反向引物5，-GTGTC (A/G) TA (A/C) TA (T/C) TCAGGCCA-3，。採用 Takara 的 Ex-Taq 酶進行 PCR 擴增，PCR 產物回收後與 pGEM-Teasy (Promega)載體連接，連接產物轉化Ε. coli DH 5 α感受態細胞，採用藍白斑篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經PCR進一步驗證後測序，獲得Ac-NIl基因。
以上所述，僅為本發明的較佳實例而已，並不用於限定本發明的保護範圍。
權利要求
一種菠蘿中性轉化酶基因Ac NI1，其特徵在於其核苷酸序列如SEQ ID NO1。
2.—種權利要求1所述菠蘿中性轉化酶基因Ac-NIl編碼的蛋白質，其特徵在於其氨 基酸序列如SEQ ID NO :2ο
3.—種權利要求1所述菠蘿中性轉化酶基因Ac-NIl的克隆方法，其特徵在於包括如 下步驟(1)選用菠蘿果實作為實驗材料，採用改良SDS法提取菠蘿果實中的總RNA，RNA含量 及質量採用瓊脂糖凝膠電泳檢測；(2)以獲得的總RNA為模板，採用Takara公司生產的mRNASelective PCR Kit進行反 轉錄獲得cDNA ；(3)根據NCBI資料庫中的EST信息設計菠蘿Ac-NIl基因編碼區引物正向引物5，-CAG(T/C)T(T/G/A)CAGAG(C/T)TGGGAGA-3『反向引物5，-GTGTC(A/G)TA(A/C)TA(T/C)TCAGGCCA-3『用第一鏈反轉錄產物IOy 1作為PCR的模板，反應體系為10XPCR Buffer II 2. 5 μ l,25mM MgCl2 1. 5μ IUOmM dNTP/analog Mixture 1 μ 1、ExTaq 0· 2 μ 1、上遊引物 (20 μ Μ) 1 μ 1、下遊引物(20 μ Μ) 1 μ 1、再補足Rnase Free H2O至總體積25 μ 1 ；擴增程序為 85°C變性 lmin，54°C復性 lmin，72°C延伸 2min，30 個循環後，72°C總延伸 IOmin ；(4)PCR產物回收後與pGEM-Teasy Vector連接，連接產物轉化Ε. coli DH 5α感受態 細胞，採用藍白斑法篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經PCR進一步驗證後測序，獲得Ac-NIl 基因。
全文摘要
本發明涉及菠蘿中性轉化酶基因Ac-NI1，其核苷酸序列如SEQ ID NO1，一種菠蘿中性轉化酶基因Ac-NI1編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQ ID NO2，同時，本發明還涉及菠蘿中性轉化酶基因克隆方法採用改良SDS法提取菠蘿果實中的總RNA，RNA含量及質量採用瓊脂糖凝膠電泳檢測；以獲得的總RNA為模板，進行反轉錄獲得cDNA；用第一鏈反轉錄產物10μl作為PCR的模板，擴增PCR，轉化，篩選陽性克隆，經PCR進一步驗證後測序，獲得Ac-NI1基因；篩選的陽性克隆經PCR進一步驗證後測序，獲得Ac-NI1基因；菠蘿果實中性轉化酶基因的大量表達，有利於果糖和葡萄糖的積累，改變了果實中糖分的組成和比例，從而改變了果實的品質。
文檔編號C12N15/10GK101899451SQ20101019667
公開日2010年12月1日 申請日期2010年6月8日 優先權日2010年6月8日
發明者姚豔麗, 孫光明, 張秀梅, 杜麗清, 謝江輝 申請人:中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所