一種定量t4多聚核苷酸激酶活性測定方法
2023-05-20 00:05:01 2
一種定量t4多聚核苷酸激酶活性測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種定量T4多聚核苷酸激酶活性測定方法，所述方法包括如下步驟：在用於磷酸化的反應體系中，以寡核苷酸為底物，加入ATP，利用T4多聚核苷酸激酶使該寡核苷酸的5』端磷酸化，生成磷酸化寡核苷酸；隨後向該反應體系中加入螢光素酶報告基因系統，該螢光素酶報告基因系統中的螢光素酶利用該反應體系中的剩餘ATP使螢光素氧化生成氧合螢光素，同時產生化學發光；檢測發光數值，由檢測結果推導出T4多聚核苷酸激酶活性程度，其中該T4多聚核苷酸激酶活性程度與發光量負相關。與現有技術相比，本發明方法無放射性汙染，操作簡單方便，並且可以對T4多核苷酸激酶活性進行定量的檢測分析。
【專利說明】一種定量T4多聚核苷酸激酶活性測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生化【技術領域】，具體來說涉及一種定量Τ4多聚核苷酸激酶活性測定 方法。
【背景技術】
[0002] Τ4多聚核苷酸激酶（Τ4 Polynucleotide Kinase)，簡稱Τ4 ΡΝΚ，是由Τ4噬菌體的 pseT基因編碼的一種蛋白質，最初是從T4噬菌體感染的大腸桿菌細胞中分離出來的，因此 又叫做T4多核苷酸激酶。該酶可以催化ATP的γ -磷酸向單鏈或雙鏈DNA、RNA、寡核苷酸 或帶有3'磷酸基團的單核苷酸的5'羥基轉移。該酶還具有3'磷酸酶活性，將3' -磷酸基 團從寡核苷酸的3'磷酸末端、脫氧3' -單磷酸核苷和脫氧3' -二磷酸核苷上水解下來。
[0003] 作為一類重要的工具酶，T4多核苷酸激酶在基因工程技術以及分子生物學研究領 域中的應用非常廣泛，它可以對寡核苷酸、DNA或RNA的5'末端進行標記，用作Southern、 NortherruEMSA等的探針，凝膠電泳的標記物，DNA測序引物，PCR引物等；使寡核苷酸、DNA 或RNA的5'端磷酸化，確保後續連接反應順利進行；催化3'磷酸化的單核苷酸的5'磷酸 化，使該單核苷酸可以和DNA或RNA的3'末端連接；去除3'端磷酸基團。
[0004] 標準的T4多核苷酸激酶測活方法採用放射性同位素法。將T4多核苷酸激酶進 行2倍連續梯度稀釋，加入到含10 μ M Oligo dT的單鏈DNA，IX PNK反應緩衝液和66 μ M U-32P] ATP (6.6 μ Ci/mL)的 50 μ L 反應體系中，酶的終濃度 0.0006?0.075 μ g/μ Ι^37? 條件下孵育10分鐘，冰浴後進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，然後按照Sambrook和Russell的方 法進行分析（Molecular Cloning, v3, 2001，PP. A8.25-A8. 26)。這種方法靈敏度雖高， 但受標記物質量所限，且操作過程繁瑣，易產生放射性汙染。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在於建立一種簡便、快速、非放射性且定量的T4多核苷酸激酶測活 方法，其原理如圖1所示。
[0006] 具體來說，本發明採用如下技術方案： 一種定量T4多聚核苷酸激酶活性測定方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟：在 用於磷酸化的反應體系中，以寡核苷酸為底物，加入ATP，利用T4多聚核苷酸激酶使該寡核 苷酸的5'端磷酸化，生成磷酸化寡核苷酸；隨後向該反應體系中加入螢光素酶報告基因系 統，該螢光素酶報告基因系統中的螢光素酶利用該反應體系中的剩餘ATP使螢光素氧化生 成氧合螢光素，同時產生化學發光；檢測發光數值，由檢測結果推導出T4多聚核苷酸激酶 活性程度，其中該T4多聚核苷酸激酶活性程度與發光量負相關。
[0007] 優選地，磷酸化反應體系中所用的寡核苷酸是程度為18至27個鹼基的合成引物， 更優選，所用引物的長度為20個鹼基，以便於建立標準反應體系。
[0008] 本發明的優點： 1.無放射性汙染； 2. 操作步驟簡單，重複性好，穩定性強，反應迅速； 3. 可以對T4多核苷酸激酶活性進行定量的檢測分析，便於操作。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009] 圖1是本發明測定方法的原理圖。
[0010] 圖2是螢光素在螢光素酶的作用下生成氧合螢光素並且發光的反應式示意圖。
[0011] 圖3是採用本發明測定方法獲得的酶活-螢光強度曲線圖。
[0012] 圖4是不同來源的T4 PNK的酶活-螢光強度曲線圖。
【具體實施方式】
[0013] 本發明建立了一種簡便、快速、非放射性且定量的T4多核苷酸激酶測活方法，其 原理如圖1所示。
[0014] 如圖1所示，本發明巧妙地利用了螢光素酶報告基因系統來對T4多核苷酸激酶 進行活性的測定。以一段20bp的寡核苷酸作為本測活方法中的底物，在ATP存在的條件 下，T4 PNK可以使底物的5'端發生磷酸化。該反應過程中，T4 PNK不斷地消耗ATP。若 往該反應體系中加入螢光素酶（Luciferase)報告基因系統,螢光素酶也可以在ATP存在的 條件下，催化突光素（Iuciferin)氧化成氧合突光素（oxyluciferin)，同時產生化學發光 (Luminescent);若ATP的量降低，則突光素酶催化突光素氧化成氧合突光素的量也降低， 化學發光也隨之降低。
[0015] 由此可見，T4多核苷酸激酶的活性在一定範圍內同ATP的量成反比，而在螢光素 酶報告基因系統的量一定的情況下，ATP的量同化學發光強度成正比。因此，本發明將T4多 核苷酸激酶的磷酸化反應與螢光素酶報告基因系統反應偶聯起來。
[0016] 本發明人進一步證明了上述假設，從而建立了非放射性、簡便、快速且可以定量 的，T4多核苷酸激酶測活方法。
[0017] 下面將結合具體實施例來進一步說明本發明。
[0018] 實施例1.化學發光法測定T4多核苷酸激酶活性方法的建立 磷酸化反應： T4多核苷酸激酶為NEB M0201 ; 寡核苷酸底物：5' -acggattcatatttcatcct_3'
【權利要求】
1. 一種定量T4多聚核苷酸激酶活性測定方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟： 在用於磷酸化的反應體系中，以寡核苷酸為底物，加入ΑΤΡ，利用Τ4多聚核苷酸激酶使該寡 核苷酸的5'端磷酸化，生成磷酸化寡核苷酸；隨後向該反應體系中加入螢光素酶報告基因 系統，該螢光素酶報告基因系統中的螢光素酶利用該反應體系中的剩餘ΑΤΡ使螢光素氧化 生成氧合螢光素，同時產生化學發光；檢測發光數值，由檢測結果推導出Τ4多聚核苷酸激 酶活性程度，其中該Τ4多聚核苷酸激酶活性程度與發光量負相關。
2. 如權利要求1所述的定量Τ4多聚核苷酸激酶活性測定方法，其特徵在於，磷酸化反 應體系中所用的寡核苷酸是程度為18至27個鹼基的合成引物。
3. 如權利要求2所述的定量Τ4多聚核苷酸激酶活性測定方法，其特徵在於，所用引物 的長度為20個鹼基。
【文檔編號】C12Q1/66GK104293929SQ201410502153
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月28日 優先權日:2014年9月28日
【發明者】徐曉昱, 劉來花, 王靜 申請人:南京諾唯贊生物科技有限公司