具免疫調節活性並促進細胞素生成的製劑的生產方法

2023-05-20 02:19:41 2

專利名稱：具免疫調節活性並促進細胞素生成的製劑的生產方法
技術領域：
本發明涉及由植物和植物殘渣獲得無毒製劑的方法;所述製劑給人和動物使用時，具有免疫調節活性，並能促進細胞素(幹擾素、腫瘤壞死因子等)的形成。
已公開了許多有關具免疫促進(immunotropic)活性或抗腫瘤活性的各種提取物、特別是泥炭(peat)的生產HyoshitaTakuya等人(Chem.Abstr.1974，00，47021j)報導了一個方法，其中，將泥炭用8%氫氧化鈉溶液提取若干次;將得到的提取物酸化，離心分離固體顆粒，然後滲析並用柱層析純化。這部分主要(95%)由多糖組成，並具有抗腫瘤活性。
St.Tolpa等人(在波蘭專利第124110號中)描述了相同的泥炭提取液，但所不同的是，他們對該提取液進一步的處理不同酸化步驟後，進行鹼化，然後再酸化，蒸發濃縮，中和，再濃縮，用醇-水混合物提取，然後再部分濃縮，並用醚或其它與水不互溶的有機溶劑提取，最後分出水層，並用凝膠過濾色譜柱純化。但它未指出哪些部分可以被認為能成為較佳的最終產品。
與上述兩文獻所報導的鹼性提取介質相反，波蘭專利申請279.475(Tarchomi skie Zaklady，Farmaceutyczne POLFA，公開在BUP 24/90中)報導了用酸化的水性提取介質提取泥炭的方法。將該酸性提取液中和，用超濾法或反滲透法濃縮，所述反滲透法使用保留限(截止)為500-10000道爾頓的膜。然後將該產物用凝膠過濾柱色譜法或陰離子交換樹脂柱分離。也可以獲得鹽濃度不同及多糖與糖蛋白的比率不同的部分。但它未指出所獲得的所有混合物均無毒且顯示出免疫促進活性。
上述方法有一些共同的特徵。人們早就知道，在從天然原料中分離活性物質的同時，要保護該活性物質，因而可以避免可能是使該活性物質分解或失活的原因的次級反應。令人遺憾的是，先有技術均未報導為用各方法製備的產品(是各種物質的混合物)其生物活性之主要原因的化合物的確切結構或化學特性。很少有關於多糖和使用將低分子量部分除去的分離方法(滲析和超濾)的報導。這表明在所獲得的產品中，生物活性可能是高分子量部分所導致的。
在對泥炭提取物目前的研究中發現，即使在保護條件下獲得的提取物，或者具有較低的免疫促進活性，或者含有幾乎不可分離的石碴(ballast)物質(主要是無機鹽類)，這就限制了該產品在所需的藥用製劑中的應用;在進一步的加工過程中，它們地增加了勞動和能耗，對於一些治療應用，甚至拒絕使用該產品。
本發明的主要目的是提供提取植物和植物殘渣及加工該提取物的新方法，用該方法可以較高產率獲得具能促進細胞素生成的免疫促進特性的製劑;該方法克服了已知方法的缺陷。
我們出乎意料地發現當提取條件按以下特徵之一或一個以上進行改變時，每批產品的免疫促進活性均保持在較佳的範圍內且終產品中的有機物質的收率顯著增加-所提取的化合物間的某些次級反應可按控制的方向並在可控的程度上有意進行，以便生成新化合物，這些新化合物在已知的如泥炭提取物中或者不存在，或者含量相當低;
-對如此得到的提取物的加工進行改良，以便在分離石碴物質(由天然泥炭中提取時和/或由提取介質帶入的)時不會除去該提取物中有用和有益的成分。
與得自泥炭的製劑的生物活性和治療活性相關的有機物質包括TTP(TOEPA TORF PREPARATION，波蘭TORF CORPORATION的註冊商標)，它們是Amadori重排化合物和在該醛糖和胺基酸反應產物的重排過程中得到的產物，即通式R1-CO-CH2-NH-R2化合物，式中R1是1-脫氧-2-酮-單糖、寡糖或多糖的殘基，其中這樣的1-脫氧-2-酮基團是碳原子鏈的端基;以及R2是胺基酸殘基或肽殘基，其中端基是與該肽鍵無關的游離NH2-基團。這些化合物的製備方法以及它們的藥用用途公開在PCT/EP 93/00327中。
現已發現，可以獲得這樣的植物和植物殘渣的提取物它們富含合成這些活性化合物所需的兩類底物，一類是單糖、寡糖和多糖，另一類是胺基酸和肽，而且最終還包括作為上述反應的催化劑的具至少一個活性亞甲基基團的有機酸和/或化合物。
本方法可以生產出無毒製劑，如得自泥炭的製劑，所述製劑具免疫調節活性並促進細胞素(幹擾素、腫瘤壞死因子等)在活生物體中生成，它們適用於人和動物的治療和預防。對原料泥炭進行提取;將腐殖質在酸性環境下用沉澱法從得到的提取液中分出;用鹽酸酸化至pH1.5-3.0;分離沉澱並將該提取液用減壓蒸發濃縮和/或用超微過濾(nano-filtration)濃縮，同時去除無機鹽類;將濃縮液的pH調至6.0-7.1;將得到的混合物濃縮至稠糖漿狀並加熱至70-90℃。最好加熱至80℃直至胺基酸和/或肽產物的Amadori重排完全;所述胺基酸和/或肽產物的末端游離NH2-基團(與任何肽鍵無關)為合適的1-脫氧-2-酮糖-C1-基團所取代，這是由於由泥炭中提取的單糖、寡糖和多糖與胺基酸和/或肽的反應所致;然後通過將反應混合物冷卻而終止該反應;將疏水物質(降低產品的免疫促進活性)用選擇性吸附法從獲得的反應後混合物中去除，所述選擇性吸附用特異性的吸附樹脂如AMBERLITE XAD型，最好是XAD-2或XAD-4，或任何其它具相似性質的樹脂。
泥炭提取物最好首先是通過提取天然泥炭(可以首先用酸性溶液洗滌)所獲得的鹼提取物和水提取物的混合物，所述提取為先用鹼水溶液然後再用水提取。較佳的原泥炭為低腐殖化度(humificationdegree)H6-H10。
Amadori重排反應最好在濃縮水溶液或濃縮水-醇溶液中進行。
由終產物中吸附待去除的物質最好在中性或微酸性溶液中進行;用蒸餾水和稀鹼水溶液洗脫該柱。用噴霧乾燥法從終溶液中分離出具生物活性和治療活性的固體物質。
Amadori重排反應可以用檢驗反應即鐵氰化鉀與重排產物在鹼性溶液中的還原反應來監控。在室溫下，鐵氰化鉀在第1分鐘內被還原劑如抗壞血酸還原，在頭5分鐘內被所需的重排產物還原，在頭15-30分鐘內被還原糖還原。還原產物亞鐵氰化鉀與硫酸亞鐵生成普魯士藍。該反應可用於該重排反應的光度定量監控。按預定的時間間隔取反應混合物樣，並對其進行該檢驗反應。當還原的樣品中的普魯士藍強度不再增強時即中止該重排反應。
我們出乎意料地發現由加工底物如泥炭提取物的混合物生成所需的Amadori重排產物比在實驗室中相同的糖和胺基酸的預混合組合物容易進行。
還測定出與類似的合成產物相比，泥炭提取物中所含的一些物質能增強本發明方法所獲得的終製劑的生物有效性，而另一些物質則能降低該有效性。
用在本發明方法中的起始泥炭提取物富含糖和胺基酸，該提取物按文獻所述方法獲得。優選的原料是呈高度腐殖化(例如標度為H6-H10，見Moor-undTorf-Kunde編輯，Karl-HansGottlich，Stuttgart，1990年第3版)且碳與氮之比為15-35的低泥炭。
水提取物可由上述任何方法即使用酸性、中性和/或鹼性水性提取介質的方法獲得，最好是將這些方法配合起來。最好是將原泥炭先用酸性水溶液提取介質短時(1-2小時)提取，以除去無機物質如碳酸鹽、金屬氧化物等;然後用鹼性水溶液提取介質(如0.2-0.6%NaOH溶液)於20-50℃長時(幾小時至多於二十時)提取，以溶解腐殖酸和fulvoacid;最後用水、最好是蒸餾水於30-60℃再提取12或12小時以上;然後棄去酸提取液;將鹼性和中性提取液合併，並按照本發明進行進一步處理。
人們知道，提取後的泥炭非常難於與提取液分離，需要昂貴的設備如離心分離器才能高收率地獲得澄清的提取液。當使用特殊的提取器時，這些困難可以得到克服;在所述的提取器中，硬質泥炭是在固定床中，而提取介質在整個床中循環。提取方法的細節將在本說明書中的另一部分中描述。
按照本發明，將鹼水提取液酸化至pH1.5-3.0，最好是2.3-2.5，以沉澱腐殖酸。6N鹽酸是合適的酸化介質。在幾小時至20多小時內沉澱物沉積下來，而且可以潷析出澄清的提取液。可以用離心或過濾法來收集該提取液的其餘部分。
然後將該澄清溶液用旋轉蒸發器濃縮至原體積的1/10。或者，可以在調節該溶液的pH值時用超微過濾法濃縮並除去無機鹽。「超微過濾」一詞用來定義改良的反滲透法，其中使用僅對於小分子如簡單無機鹽可滲透的膜。該膜的特點不在於保留時間，而更常常的是在於對NaCl的滲透性。已經發現，當用具40-60%的NaCl滲透性的HC50PP型膜時，或者用具66-74%的NaCl滲透性(丹麥Dow的產品)的CA865PP型膜時，可以得到滿意的結果。用這樣的膜或相似類型的膜所實施的本方法可將該溶液濃縮並同時除去電解質，幾乎沒有低分子量有機物質的任何損失，這些低分子量的有機物質被認為是本發明方法中最重要的(儘管在已知方法中，提取物中較高分子量的成分頗被認為是有用的成分)，並且是得到的所需最終產品的最終活性的原因之一。
剛才敘述的兩個濃縮方法也可以依次用於相同的過程中。最好是，先將溶劑在旋轉真空蒸發器中蒸發;然後將溶液中和並進行超微過濾直至達到每100ml溶液中有8-12g幹固體的濃度時止。若由於某些特殊應用需要高度脫鹽，即低含量的無機鹽，可將該溶液在用蒸餾水超微過濾(透析濾過)的過程中以定期或連續的方式稀釋。尺寸較大的陽離子如Ca、Fe、Al離子遷移通過該膜要慢得多，可以在超微過濾操作開始前通過使該待濃縮溶液通過裝有鈉型的弱離子交換劑(例如AMBERLITEEIRC50)的柱而用鈉陽離子來取代。
在超微過濾結束時，控制剩餘溶液的pH，若有必要，將其調至pH6.0-7.2，最好是pH6.5-6.8。然後將該溶液置旋轉真空蒸發器中，於35-40℃濃縮至約為其原體積的一半(直至獲得糖漿狀粘稠的溶液時止)。然後在常壓及不斷攪拌下，將溶液的溫度升至70-90℃，最好是升至80℃，並繼續加熱。在開始時每隔30分鐘取一次樣，1.5小時後每隔15分鐘取一次樣。通過測定上述檢驗反應的顏色強度來監視反應的進展。若所取樣品的檢驗反應的顏色強度與前面樣品的相同或較之減弱，則通過將加熱浴迅速冷卻來終止該反應。
或者，該反應可以按下述方式進行將反應混合物按前述相同的濃縮方法濃縮，然後將其用足以溶解該產物的50%乙醇水溶液稀釋;然後將稀釋溶液加熱回流，並按上述方法監視和控制反應的進展，只是在對各樣品進行檢驗反應前將其中的溶劑蒸發。當反應完全時，減壓蒸出醇。
在測定出反應後混合物中幹固體的含量後，將其用蒸餾水稀釋，以獲得10-12%溶液;然後使其緩慢通過裝有非離子吸附樹脂的柱子，所述樹脂為XAD型(RoehmHaas的產品)，最好是XAD-2或XAD-4型。在與這樣的吸附劑接觸時，疏水物質被吸附的力量最強，而對親水物質如糖則吸附力最弱。收集流過該柱的液體。然後用蒸餾水洗脫該柱，並將洗脫液按流份分別收集。將各流份進行層析分析和/或用生物檢定法測定其活性。然後將開始通過該柱的液體與對其所需活性進行選擇後挑出來的洗脫液流份合併，以獲得能達到用不同試驗和生物測定測得的預定的活性比值的產品。生物測定詳見下述。然後用稀鹼溶液洗脫被最強吸附的物質，直至洗脫液仍呈中性時止。將含有對終製劑的生物活性有強抑制作用的物質的其它流份棄去。
將在上一步所獲得的溶液用膜過濾消毒並在無菌條件下在噴霧乾燥器中乾燥，在噴霧乾燥時，進氣溫度為180-185℃，出口氣溫為約80℃。
得到的粉末為米色。當將其於室溫、不透氣的容器中並在暗處貯存時，其生物活性可保持一年以上。
上述終產品的活性已通過進行以下顯示該製劑對免疫系統的個體反應的作用的試驗進行了評估1.按照Bach和Dardenn提出的方法(Cell.Immunol.3，1-16，1972)測定形成E-玫瑰花結(rosettes)的脾細胞的百分數2.按照Jerne提出的方法，根據Mishell和Dutton(J.Exp.Med.126，423-442，1967)的改良，測定產生IgM型的溶血抗體的脾細胞的數目3.按照Adler提出的方法(J.Immunol.95，26-38，39-47，1965)測定在活性血細胞凝集試驗中的血凝集19S+7S和7S抗體。
4.小鼠胸腺細胞在用氫化可的松的20小時的培養中的存活試驗(細胞毒試驗)5.幹擾素和TNF誘導試驗(PCT/EP93/00327)
在所有以上所列的試驗中，與盲對照組(blindcontrols)相比，已證實按照本發明所獲得的產品在濃度為0.05-1mg/kg(試驗1-3)、0.05-10μg/ml(試驗4)和10-100μg/ml(試驗5)時就已經具有促進作用了。
就按照本發明所獲得的產品的其它性質來說，需要強調屬于波蘭衛生部在TTP(ToEpaTorf製劑)的批准證書中所定的在對該製劑的分析標準中所規定之列的有關性質。
用於獲得來自泥炭的生物活性產品的本方法的產率比按照波蘭專利第124110號的傳統方法的高10倍。這就意味著作為原料的有價值的泥炭的用量減少了。而且，鹼提取後，提取後的泥炭如今用水洗滌，因此最終是中性的(不被鹼或酸所汙染)而且對環境安全;它在生態學方面是無害的，可直接用於農業。
此外，在本發明方法中未使用任何易燃的有機溶劑如乙醚。由於活性物質的較高濃度，加之其低分子量，因此當口服時，該製劑比按傳統方法獲得的TTP更易被吸收。
在以下實施例中詳細描述本發明。
實施例1將45kg含水量為64-65%的泥炭粉碎，過14mm孔徑的篩，然後裝入專為提取泥炭設計的半工業規模的提取器中。使提取介質0.4%氫氧化鈉由180l供應槽中以非常慢的流速流過泥炭床，以使提取器中的液體高度按約1cm/分鐘增加。當整個泥炭床被提取介質覆蓋時，將流速增至500l/分鐘。使提取液於40±2℃再循環27小時後關閉進料泵;將進料閥與120l蒸餾水的另一槽接通並使該洗液於相同溫度再連續循環16小時。
將鹼提取物和水提取物合併，潷析出提取液，得到總體積為240l的液體，pH＝12.1。將該總量分成兩部分再進一步處理。
實施例2將在實施例1所述操作中所獲得的120l提取液用1.616N鹽酸酸化至pH2.1。使酸化的混合物沉降24小時。然後潷出75升澄清溶液，並經過過濾又回收25升。將澄清溶液合併並在旋轉玻璃蒸發器(SIMAX)中減壓濃縮至體積為19升。通過加入氫氧化鈉調節該濃縮溶液的pH值至6.8。得到的溶液接近中性，將其用蒸餾水稀釋至總體積為50l並在Lab Unit M20(Dow分離系統產品，丹麥)中進行超微過濾，該實驗裝置配有HC50PP型的平膜。在20個大氣壓和21℃的溫度下，該膜的總過濾面積是0.36m2。濾液的最終體積是7升。濃縮的提取液的pH值為6.6，因此無需作任何調節。
將上面獲得的濃縮提取液裝入真空旋轉蒸發器(BUCHI，瑞士)中並進一步減壓濃縮至體積為1.3l。然後在常壓下將該溶液加熱至80℃，將其通過旋轉不斷攪拌繼續加熱。所需反應的進展通過測定所取樣品在鐵氰化鉀的還原試驗後的顏色強度來監視。135分鐘後顏色強度穩定或者甚至略有減弱。通過將反應混合物冷卻至20℃來終止反應。將反應後混合物置於較小的(實驗室規模)蒸發器中再減壓濃縮至體積為800ml，其幹固體的含量為13.25g/100ml。將濃縮的溶液過濾並使其以0.8ml/分鐘的速度通過直徑為26mm、內裝270ml吸附劑XAD-2的柱子。收集液體。並將該柱用蒸餾水洗脫。收集3個連續流份(1-3)，每份的體積分別為160ml、240ml和400ml。然後用0.1%氫氧化鈉溶液作洗脫劑並收集液體直至洗脫液的pH值大於7.0時止。第4流份(220ml)的pH值為7.0。這些流份的組成用層析法(HPLC)來測定。將流份1、2、300ml流份3和150ml流份4合併，濃縮至100ml，然後與引至該柱的液體的流出部分合併。將該最終溶液通過在無菌條件下用具0.22μm微孔的膜過濾消毒，然後在無菌條件下在噴霧乾燥器中乾燥;在噴霧乾燥時，進氣溫度為185℃，出口氣溫度為81℃。所得粉末的總量為96g。
實施例3將另一部分的120l提取液酸化(同上述實施例2)至pH2.3;將腐殖土沉澱按以上實施例2中所述分離，獲得98l酸化的澄清溶液。將該溶液用4NNaOH中和至pH6.7並放置12小時，然後過濾並在與實施例2中所述的同樣的條件下進行超微過濾，最終濾液的體積為10l。然後加入20l蒸餾水並將得到的溶液濃縮至10l。然後再加入20l蒸餾水，將得到的溶液最終濃縮至7l。按實施例2中的同樣方法進行進一步處理，只是Amadori重排化合物和產物的形成持續110分鐘。最終粉末的產量為84g。
權利要求
1.具免疫調節活性並能促進細胞素在活體中生成且適宜於人和動物的治療和預防用的製劑的生產方法，其中，提取原植物和植物殘渣並用在酸性環境中沉澱的方法將得到的提取液與腐殖質分離，其特徵在於-用鹽酸酸化至pH1.5-3.0並分離沉澱物而將腐殖質從泥炭提取液中除去，然後將提取液通過減壓蒸發和/或同時除去無機鹽的超微過濾來濃縮，將濃縮溶液的pH調至6.0-7.1；-將得到的混合物濃縮至稠糖漿狀並加熱至70-90℃，最好加熱至80℃直至胺基酸和/或肽產物的Amadori重排完全，所述胺基酸和/或肽產物的末端游離NH2-基團(與任何肽鍵無關)為合適的1-脫氧-2-酮糖-C1-基團所取代，這是由於由泥炭中提取的單糖、寡糖和多糖與胺基酸和/或肽的反應所致；-通過將反應混合物冷卻而終止該反應，將疏水物質(會降低產品的免疫促進活性)用選擇性吸附法除去，所述選擇性吸附法用特異性的AMBERLITE型吸附樹脂，最好是XAD-2或XAD-4型或具相似性質的其它樹脂。
2.按照權利要求1的方法，其特徵在於，起始提取液是用下述方法獲得的鹼提取液和水提取液的混合物將天然的原泥炭、最好是腐殖化度為H6-H10的低泥炭用鹼水溶液提取，然後用水提取，所述原泥炭在用鹼水溶液提取前可先用酸性溶液洗滌。
3.按照權利要求1或2的方法，其特徵在於Amadori重排反應在濃縮的水溶液或濃縮的水-醇溶液中進行。
4.按照上述權項中任一權項的方法，其特徵在於使待從最終產品中去除的物質從其酸性或中性溶液吸附至柱中，然後用蒸餾水和稀鹼溶液洗脫該柱。
5.按照上述權項中任一權項的方法，其特徵在於該最終溶液可以在滅菌後噴霧乾燥。
全文摘要
具免疫調節活性並能促進細胞素(幹擾素、腫瘤壞死因子等)生成的無毒製劑，適用於人和動物的治療和預防；它可通過提取植物和植物殘渣來製備。
文檔編號A61K35/10GK1105569SQ9410032
公開日1995年7月26日 申請日期1994年1月22日 優先權日1994年1月22日
發明者J·Z·米奧杜祖斯基, K·韋特基維茲, M·科瓦斯卡, J·戈拉爾, M·克林梅卡 申請人:託夫企業公司