基於毛細管電泳噪聲分析確定電泳檢測最優參數的方法與流程
2023-05-20 02:19:11
本發明涉及一種基於毛細管電泳噪聲分析確定電泳檢測最優參數的方法，屬於電子信息工程領域。
背景技術：
毛細管電泳作為高效的微分離分析方法廣泛應用於臨床醫學、分子生物檢測及蛋白質與核酸的分離分析等領域。毛細管電泳系統的結構如圖2所示，雷射器8的激發光經擴束鏡9、激發光濾色片10、調節反光鏡11、會聚透鏡12照射到毛細管18，毛細管18固定於一維掃描平臺6上。物鏡17收集螢光，經調節鏡13，由螢光濾色片14和共焦小孔15濾除背景噪聲，到達光電倍增管16。現有的毛細管電泳系統的螢光信號檢測系統中通常包括來自於分析儀器的雜散光噪聲、放大電路的噪聲、光電倍增管的噪聲、靜態光學噪聲、雷射器開啟的靜態噪聲和脫氧核糖核酸電泳時引起的動態噪聲等。在毛細管電泳中，有效信號的分離以及鹼基信號峰的識別率都受到這些噪聲的影響，如果能明確噪聲來源，就能有針對性的從源頭上採用物理措施、從檢測分析階段採用信號處理方法來抑制噪聲，提高螢光信號的信噪比。
奚正山、史大明、鄭華、沈鑫等研究者針對毛細管電泳時引起的動態噪聲，採用小波分析方法實現該非平穩電泳螢光信號的去噪。石巖通過軟體模擬得到毛細管內的激發光光斑對毛細管各個角度的光強，用來考察毛細管內徑對噪音分布的影響，通過軟體模擬電泳分離DNA的篩分介質引起瑞利散射噪聲。YU Li提出光譜恢復的方法、GUILLAUME L.EMY採用電泳背景噪聲的估計方法實現信噪比的提升。這些研究方法主要側重研究毛細管電泳螢光信號檢測系統中雷射器開啟時毛細管電泳時引起的動態噪聲，並採用高效的信號處理技術實現信噪比的提升。目前尚無文獻全面分析毛細管檢測系統噪聲的來源、試驗條件和實驗對象改變時噪聲的變化規律。
技術實現要素：
針對現有技術中毛細管電泳系統的螢光信號檢測系統存在的上述問題，本發明提供一種基於毛細管電泳噪聲分析確定電泳檢測最優參數的方法。
本發明的技術方案如下：
基於毛細管電泳噪聲分析確定電泳檢測最優參數的方法，其特徵在於：採用毛細管電泳系統，以100-1000鹼基對DNA為分離對象，研究在直流電場下羥乙基纖維素溶液中毛細管電泳分離DNA時的噪聲特性，根據不同情況下系統的噪聲特性選擇最佳系統電泳檢測參數。
進一步，所述的基於毛細管電泳噪聲分析確定電泳檢測最優參數的方法包括如下步驟：
步驟1：分析儀器的噪聲的物理抑制；
步驟2：觀察放大電路輸出噪聲；
步驟3：觀察光電倍增管輸出噪聲；
步驟4：觀察未加分離電場時的靜態噪聲；
步驟5：觀察加分離電場時DNA毛細管電泳引起的動態噪聲；
步驟6：步驟2至步驟5中的噪聲分析，得到該檢測系統中信噪比最佳的優化參數。
進一步，所述步驟1的具體步驟包括：採用遮光布和遮光板阻擋外部雜散光，構建密閉箱、保持實驗室恆溫通風環境避免內部雜散光，安裝攝影鏡頭遮光罩和擋光環阻擋成像雜散光。
進一步，所述步驟2的具體步驟包括：關閉光電倍增管，觀察放大電路的輸出端的噪聲情況，其中輸出數據通過數據採集卡採集，並經由計算機軟體得到噪聲時域波形，得到時長為10秒的噪聲均值和方差。
進一步，所述步驟3的具體步驟包括：將光電倍增管和放大電路經數據線連接，關閉雷射器，將黑紙擋住光電倍增管光路；打開連接光電倍增管電源，測量輸出噪聲，得到時長為10秒的噪聲均值和方差。
進一步，所述步驟4的觀察變量條件包括毛細管內未加螢光染料和毛細管內填充螢光染料兩種情況；其中：
毛細管內未加螢光染料：毛細管內未添加SYBR Green I螢光染料，只有緩衝溶液；開啟雷射器，不加分離電場，採集噪聲波形，得到時長為10秒的噪聲均值和方差；
毛細管內填充螢光染料：毛細管內填充含有SYBR Green I螢光染料的緩衝溶液，不加分離電場，採集噪聲波形，得到時長為10秒的噪聲均值和方差。
進一步，所述步驟5的觀察條件包括基礎條件和變量條件，其中：
基礎條件為毛細管內填充SYBR Green I螢光染料的緩衝溶液，以100-1000鹼基對DNA為分離對象，兩端施加直流電壓，DNA在毛細管電泳時引起動態噪聲；
變量條件包括：
改變分離電場強度時噪聲特性：改變分離電場強度200V/cm、300V/cm、400V/cm、500V/cm、600V/cm、700V/cm、800V/cm，其他參數固定，觀察DNA在毛細管電泳時引起動態噪聲，得到時長為10秒的噪聲均值和方差；
改變緩衝溶液濃度時噪聲特性：改變緩衝溶液濃度0.4％、0.6％、0.8％、1.0％，其他參數固定，觀察DNA在毛細管電泳時引起動態噪聲，得到時長為10秒的噪聲均值和方差；
改變緩衝溶液分子量時噪聲特性：改變緩衝溶液分子量250K、720K、1300K，其他參數固定，觀察DNA在毛細管電泳時引起動態噪聲，得到時長為10秒的噪聲均值和方差；
改變毛細管類型時噪聲特性：選用圓形截面毛細管的內徑75μm、50μm，毛細管正方形內截面邊長為50μm，，其他參數固定，觀察DNA在毛細管電泳時引起動態噪聲，得到時長為10秒的噪聲均值和方差；
改變毛細管有效長度時噪聲特性：改變毛細管有效長度8cm、10cm、12cm，其他參數固定，觀察DNA在毛細管電泳時引起動態噪聲，得到時長為10秒的噪聲均值和方差。
進一步，所述步驟6包括分析靜態噪聲和分析動態噪聲，其中：
分析靜態噪聲：選擇合適的物理部件，所述合適的物理部件包括噪聲更小、精度更高的放大電路和光電倍增管；
分析動態噪聲：選擇各種條件小噪聲均值和方差均為較小的實驗參數，作為最優毛細管電泳檢測參數。
本發明的有益效果如下：
從毛細管電泳螢光信號檢測系統中噪聲來源的角度研究和分析的噪聲對系統檢測性能的影響，並給出系統最優參數。研究發現影響檢測性能的主要噪聲來源於雷射器開啟時電泳所引起的噪聲。不同分離電場強度、緩衝溶液濃度和分子量、毛細管有效類型等環節的噪聲均不同程度地引起電泳噪聲的波動。在實現電泳過程中，需要根據現有條件合理選擇儀器參數、試驗用品和試驗試劑，以實現最佳檢測性能。
附圖說明
圖1是毛細管電泳系統外部結構圖；
圖2是毛細管電泳系統內部結構圖；
圖3是基於毛細管電泳噪聲分析確定電泳檢測系統最優參數的方法流程圖。
圖中：1、遮光布；2、遮光板；3、密閉箱；4、攝影鏡頭遮光罩；5、擋光環；6、一維掃描平臺；7、數據採集卡；8、雷射器；9、擴束鏡；10、激發光濾色片；11、調節反光鏡；12、會聚透鏡；13、調節鏡；14、螢光濾色片；15、共焦小孔；16、光電倍增管；17、物鏡；18、毛細管。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明作進一步詳細說明。
本發明採用毛細管電泳系統，以100-1000鹼基對DNA為分離對象，研究在直流電場下羥乙基纖維素溶液中毛細管電泳分離DNA時的噪聲特性，根據不同情況下系統的噪聲特性選擇最佳系統電泳檢測參數。
毛細管電泳系統置於如圖1所示的密閉箱中，毛細管電泳系統檢測原理如圖2。雷射器8的激發光經擴束鏡9，激發光濾色片10，調節反光鏡11，會聚透鏡12照射到毛細管18，毛細管固定於一維掃描平臺6。物鏡17收集螢光，經調節鏡13，由螢光濾色片14和共焦小孔15濾除背景噪聲，到達光電倍增管16。
本發明的實現的具體步驟如下：
第1步、分析儀器的噪聲的物理抑制
採用物理方法抑制分析儀器噪聲。具體步驟包括安裝遮光布1和遮光板2阻擋外部雜散光，構建密閉箱3、保持實驗室恆溫通風環境避免內部雜散光，在攝影鏡頭位置安裝遮光罩4和擋光環5可阻擋成像雜散光。
第2步、觀察放大電路輸出噪聲
關閉光電倍增管，觀察在光電倍增管後端的放大電路的輸出端的噪聲情況，其中輸出數據通過數據採集卡7採集，並經由計算機軟體得到噪聲時域波形，得到時長為10秒的噪聲均值。
第3步、觀察光電倍增管輸出噪聲
將光電倍增管和放大電路經數據線連接，關閉雷射器，將黑紙擋住光電倍增管光路。打開連接光電倍增管電源，測量輸出噪聲，得到時長為10秒的噪聲均值。
第4步、觀察未加分離電場時的靜態噪聲
4.1未加螢光染料
毛細管內未添加SYBR Green I螢光染料，只有緩衝溶液。開啟雷射器，不加分離電場，採集噪聲波形，得到時長為10秒的噪聲均值。
4.2加螢光染料
毛細管內填充含有SYBR Green I螢光染料的緩衝溶液，不加分離電場，採集噪聲波形，得到時長為10秒的噪聲均值。
第5步、觀察加分離電場時DNA毛細管電泳引起的動態噪聲
毛細管內填充SYBR Green I螢光染料的緩衝溶液，以100-1000鹼基對DNA為分離對象，兩端施加直流電壓，DNA在毛細管電泳時引起動態噪聲。
5.1改變分離電場強度時噪聲特性
改變分離電場強度200V/cm、300V/cm、400V/cm、500V/cm、600V/cm、700V/cm、800V/cm，其他參數固定，觀察DNA在毛細管電泳時引起動態噪聲，得到時長為10秒的噪聲均值和方差。
5.2改變緩衝溶液濃度時噪聲特性
改變緩衝溶液濃度0.4％、0.6％、0.8％、1.0％，其他參數固定，觀察DNA在毛細管電泳時引起動態噪聲，得到時長為10秒的噪聲均值和方差。
5.3改變緩衝溶液分子量時噪聲特性
改變緩衝溶液分子量250K、720K、1300K，其他參數固定，觀察DNA在毛細管電泳時引起動態噪聲，得到時長為10秒的噪聲均值和方差。
5.4改變毛細管類型時噪聲特性
選用圓形截面毛細管的內徑75μm、50μm，毛細管正方形內截面邊長為50μm，，其他參數固定，觀察DNA在毛細管電泳時引起動態噪聲，得到時長為10秒的噪聲均值和方差。
5.5改變毛細管有效長度時噪聲特性
改變毛細管有效長度8cm、10cm、12cm，其他參數固定，觀察DNA在毛細管電泳時引起動態噪聲，得到時長為10秒的噪聲均值和方差。
第6步、第2步到第5步噪聲分析
6.1分析第2步到第4步靜態噪聲：
第2步放大電路輸出噪聲幅度均值主要集中在0.15mV。第3步光電倍增管輸出端噪聲的電平主要集中在2.5-10mV。第4步未加分離電場時的靜態噪聲時，未加螢光染料噪聲均值為11mV；加螢光染料噪聲的噪聲均值為16mV。
因此，對於靜態噪聲部分，選擇合適的物理部件，如噪聲更小，精度更高的放大電路和光電倍增管。
6.2分析第5步動態噪聲：
第5步加分離電場時DNA毛細管電泳引起的動態噪聲時：
改變分離電場強度時噪聲特性，噪聲均值在0.2-0.45V，方差為0-0.035，電場強度與噪聲均值、方差成正比關係，信噪比最佳的最優化分離電場強度以較低值200V/cm為宜；
改變緩衝溶液濃度時，噪聲均值在0.2-0.45V，方差為0-0.035，HEC濃度與噪聲均值、方差反比關係，信噪比最佳的緩衝溶液濃度以較高值1％為宜；
改變緩衝溶液分子量時，噪聲均值為0.05-0.3V，方差為0-0.1，噪聲均值、方差與HEC分子量成正比，信噪比最佳的緩衝溶液分子量以較低值250k為宜；
改變毛細管類型時，噪聲均值為0.13-0.21V，方差為0-0.018，噪聲均值和方差均與隨著側面積與截面積之比成反比，信噪比最佳時選用50μm圓形內徑的毛細管為宜；
改變毛細管有效長度時，噪聲均值、方差呈現隨機性。毛細管有效長度的選擇不影響信噪比最佳性。
因此，對於動態噪聲部分，選擇各種條件小噪聲均值和方差均為較小的實驗參數，作為最優毛細管電泳檢測參數。
綜上所述，毛細管電泳可應用於脫氧核糖核酸片段分離及測序、聚合酶鏈式反應產物鑑定和核酸定量。本發明以100～1000鹼基對的脫氧核糖核酸作為分離對象，採用毛細管電泳螢光信號檢測系統，利用電泳時噪聲特性確定檢測系統的最佳參數。主要給出直流電場下毛細管電泳螢光信號檢測系統中的噪聲特性。對不同分離電場強度、羥乙基纖維素溶液濃度和分子量、毛細管有效長度、毛細管內徑形狀等環節噪聲特性進行分析，得到該檢測系統中信噪比最佳的優化參數。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明。凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。