一種檢測水果中5種萘衍生物的方法與流程
2023-05-19 20:25:01 1
本發明涉及一種檢測水果中5種萘衍生物的方法,屬於化學檢測領域。
背景技術：
植物激素是指植物體內天然存在的對植物生長、發育有顯著作用的微量有機物質，也被稱為植物天然激素或植物內源激素。由於植物體內的植物激素含量甚微，如果通過從植物體內提取植物激素再應用於農業生產非常困難，成本也很高。於是，人們就用化學的方法，仿照植物激素的作用合成具有類似植物激素功能的有機化合物，這便是植物生長調節劑。植物生長調節劑又稱為植物外源激素,屬於農藥管理範疇，每種植物生長調節劑都有特定的用途，而且應用技術要求相當嚴格。歐盟、美國、澳大利亞、日本等發達國家對蔬菜水果中植物激素均制定了嚴格的安全限量控制標準，而且對植物外源激素進行常規檢測。
萘衍生物1-萘乙醯胺(nad)、1-萘乙酸(naa)、2-萘氧乙酸(2-noa)、萘丙酸(npa)和萘乙酸甲酯(name)，屬生長素類植物生長調節劑，在果樹上使用能加強植株的新陳代謝和光合作用，促進細胞分裂與擴大，刺激生長，提高嫁接成活率，促進坐果和增大果粒。我國規定蘋果、葡萄和荔枝中naa最大殘留限量(mrl)分別為0.1，0.1，0.05mg/kg。日本規定naa在水果、蔬菜等產品中的最大殘留限量，範圍為0.03-5.0mg/kg，並且規定了nad在蘋果和梨中的限量為0.1mg/kg。歐盟規定nad、naa和2-noa在漿果類水果中的最大殘留限量分別為0.05，0.05和0.01mg/kg。
目前關於naa測定的報導已較多，方法主要有螢光光譜法、氣相色譜法(gc)、液相色譜-紫外檢測法(hplc-uv)、液相色譜-螢光檢測法(hplc-fld)、液相色譜－串聯質譜法(hplc-ms/ms)。而國內外對nad、2-noa、npa和name檢測方面的報導都比較少，尤其是npa和name鮮有人報導，還未見有同時測定1-萘乙醯胺(nad)、1-萘乙酸(naa)、2-萘氧乙酸(2-noa)、萘丙酸(npa)和萘乙酸甲酯(name)5種萘衍生物的方法報導。
技術實現要素：
本發明為了解決上述技術問題，提供一種檢測水果中5種萘衍生物的方法,通過本檢測方法使1-萘乙醯胺(nad)、1-萘乙酸(naa)、2-萘氧乙酸(2-noa)、萘丙酸(npa)和萘乙酸甲酯(name)5種萘衍生物達到很好的分離，建立同時檢測水果中5種萘衍生物的前處理方法和檢測方法。
本發明解決上述技術問題的技術方案如下：一種檢測水果中5種萘衍生物的方法,包括：
1)標準溶液的配製
1.0mg/ml標準溶液：分別稱取nad、naa、2-noa、npa和name標準品各10.0mg，用甲醇溶解並轉移至10ml容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，混勻後貯存於密閉的棕色玻璃瓶中，分別配製成1.0mg/ml的nad、naa、2-noa、npa和name標準溶液；
10mg/l混合標準溶液：分別移取1.0mg/ml的nad、naa、2-noa、npa和name標準溶液各0.1ml混合於10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻後貯存於密閉的棕色玻璃瓶中，配製成10mg/l混合標準溶液；
混合標準工作溶液：將10mg/l混合標準溶液用含0.1％(v/v)甲酸的乙腈-水溶液(3:7，v/v)逐級稀釋成0.005、0.01、0.02、0.1和1.0mg/l的混合標準工作溶液，供超高效液相色譜測定；
2)樣品提取
稱取10g粉碎好的水果樣品於100ml具塞離心管中，加入20.0ml乙腈，渦旋2min，加入5g氯化鈉，蓋上蓋子，劇烈振搖1min，4000r/min離心5min，使乙腈和水相分層；
3)樣品淨化
移取10.0ml上層乙腈溶液於100ml梨形瓶中，40℃水浴中旋轉濃縮至幹，加入2-5ml含1％-2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10-95:5，v/v)淋洗液溶解殘渣，移入用淋洗液活化好的nh2固相萃取小柱中，收集流出液於50ml雞心瓶中，再用淋洗液洗滌梨形瓶2次，每次用2-5ml淋洗液，再移入上述nh2固相萃取小柱中，合併流出液，在30℃水浴中旋轉濃縮至幹，用1.0ml含0.1％(v/v)甲酸的乙腈-水溶液(3:7，v/v)溶解殘渣，經0.22μm微孔濾膜過濾後，得樣品溶液，供超高效液相色譜測定；
4)超高效液相色譜測定
用超高效液相色譜測定1)所得的混合標準工作溶液和3)所得的樣品溶液，得到兩者的色譜圖，通過樣品色譜圖的保留時間與相應標準樣品的保留時間對照定性。當樣品色譜圖中色譜峰保留時間與標準樣品色譜圖中的nad、naa、2-noa、npa和name這5種化合物的色譜峰保留時間的相對偏差不大於5％，則定性為檢出。
在上述技術方案的基礎上，本發明還可以做如下改進。
進一步，在步驟1)中，所述甲醇的純度為色譜純。
進一步，在步驟3)中，所述nh2固相萃取小柱用淋洗液活化的步驟為:向nh2固相萃取小柱中加入5-6ml含1％-2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10-95:5，v/v)淋洗液，不收集。
進一步，在步驟4)中，所述超高效液相色譜測定的條件為：
色譜柱：acquityuplcbehc18(1.7μm，2.1×100mm)；螢光檢測波長：ex(激發波長)＝280nm，em(發射波長)＝330nm；柱溫：40℃；進樣量：4μl；流速0.2-0.5ml/min；流動相a為0.1％(v/v)甲酸水溶液，流動相b為0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1，
表1流動相梯度程序
本發明建立了超高效液相色譜-螢光檢測法同時測定水果中1-萘乙醯胺(nad)、1-萘乙酸(naa)、2-萘氧乙酸(2-noa)、1-萘丙酸(npa)和1-萘乙酸甲酯(name)這5種萘衍生物的方法。以乙腈為樣品提取液；nh2固相萃取小柱淨化，含1％-2％甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10-95:5，v/v)為淋洗液；用1.7μm，2.1×100mmc18色譜柱分離，0.1％(v/v)甲酸水溶液-0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液為流動相；於超高效液相色譜螢光檢測器激發波長280nm，發射波長330nm下測定。5種化合物在質量濃度0.005-1.0mg/l範圍內，線性關係良好，相關係數(r2)≥0.99996。當樣品中添加水平為0.004、0.02和0.2mg/kg時，回收率為77.6％-95.0％，相對標準偏差(rsd)為4.3％-11.2％，方法檢出限為0.001-0.002mg/kg。本方法簡便、靈敏、準確，適用於水果中nad、naa、2-noa、npa和name這5種萘衍生物的同時測定。
附圖說明
圖1為本發明5種萘衍生物在不同洗脫條件下的回收率圖,其中，
a.含1％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(95:5，v/v)；
b.含1％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)；
c.含2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(95:5，v/v)；
d.含2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)。
圖2為本發明標準樣品色譜圖(0.02μg/ml)；
圖3為本發明草莓空白樣品色譜圖；
圖4為本發明草莓加標樣品色譜圖(0.004mg/kg)。
具體實施方式
以下對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。
1實驗部分
1.1儀器與試劑
agilent1290超高效液相色譜儀，配有螢光檢測器(美國agilent公司)；
ld5-2a高速離心機(北京京立離心機有限公司)；
wh-3微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；
dt-1002a電子天平(常熟市金羊砝碼儀器有限公司)；
水果樣品草莓、葡萄和蘋果均購買於成都市農貿市場；
nad、naa、2-noa和name標準品(純度均>99.0wt％，德國dr.ehrenstorfer公司)；
npa(英國fluorochem公司)；
甲酸(色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司)；
甲醇、乙腈、二氯甲烷(色譜純，美國sigma-aldrich公司)；
氯化鈉(分析純，西隴化工有限公司)；
psa填料、c18填料、無水硫酸鎂(美國agilent公司)；
nh2固相萃取小柱(500mg/6ml，美國thermo公司)；
實驗用水均為優普超純水系統製備；
0.22μm微孔濾膜(一次性針頭式濾器)(天津津騰實驗設備有限公司)。1.2標準溶液的配製
1.0mg/ml標準溶液：分別準確稱取nad、naa、2-noa、npa和name標準品各10.0mg，用甲醇溶解並轉移至10ml容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，混勻後貯存於密閉的棕色玻璃瓶中，分別配製成1.0mg/ml的nad、naa、2-noa、npa和name標準溶液；
10mg/l混合標準溶液：分別移取1.0mg/ml的nad、naa、2-noa、npa和name標準溶液各0.1ml混合於10ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，混勻後貯存於密閉的棕色玻璃瓶中，配製成10mg/l混合標準溶液；
混合標準工作溶液：將10mg/l混合標準溶液用含0.1％(v/v)甲酸的乙腈-水溶液(3:7，v/v)逐級稀釋成0.005、0.01、0.02、0.1和1.0mg/l的混合標準工作溶液，供超高效液相色譜測定。
1.3色譜條件
色譜柱：acquityuplcbehc18(1.7μm，2.1×100mm)；螢光檢測波長：ex(激發波長)＝280nm，em(發射波長)＝330nm；柱溫：40℃；進樣量：4μl；流速0.3ml/min；流動相a為0.1％(v/v)甲酸水溶液，流動相b為0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表2。
表2流動相梯度程序
1.4樣品前處理
1.4.1樣品提取
稱取10g粉碎好的水果樣品草莓於100ml具塞離心管中，加入20.0ml乙腈，渦旋2min，加入5g氯化鈉，蓋上蓋子，劇烈振搖1min，4000r/min離心5min，使乙腈和水相分層。
1.4.2樣品淨化
移取10.0ml上層乙腈溶液於100ml梨形瓶中，40℃水浴中旋轉濃縮至幹，加入4ml含2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)淋洗液溶解殘渣，移入用淋洗液活化好的nh2固相萃取小柱中，收集流出液於50ml雞心瓶中，再用淋洗液洗滌梨形瓶2次，每次用3.0ml淋洗液，再移入上述nh2固相萃取小柱中，合併流出液，在30℃水浴中旋轉濃縮至幹，用1.0ml含0.1％(v/v)甲酸的乙腈-水溶液(3:7，v/v)溶解殘渣，經0.22μm微孔濾膜過濾後，得樣品溶液，供超高效液相色譜測定。
nh2固相萃取小柱用淋洗液活化的步驟為:向nh2固相萃取小柱中加入5-6ml含2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)淋洗液，不收集。
2結果與討論
2.1淨化方法的選擇
水果樣品草莓經乙腈提取，鹽析分層後進行淨化操作。5種萘衍生物中，naa、2-noa和npa都有一定的酸性，實驗最終選擇具有陰離子交換作用力的nh2固相萃取小柱淨化樣品，酸性二氯甲烷-乙腈溶液作為洗脫劑。
在前期的篩選實驗中，本發明通過比較洗脫劑在不同甲酸含量和溶劑比例下目標化合物的回收率(如圖1所示)，在4種不同洗脫劑〔a.含1％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(95:5，v/v)；b.含1％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)；c.含2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(95:5，v/v)；d.含2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)〕條件下，nad、naa和npa的回收率均能達到80％以上。2-noa的回收率受洗脫劑中甲酸含量的影響較大，當洗脫劑含1％(v/v)甲酸時，2-noa的回收率不到60％，洗脫劑中甲酸含量增加到2％(v/v)時，2-noa的回收率能達到80％。而name的回收率則與洗脫劑中乙腈的含量成正比，當洗脫劑為二氯甲烷-乙腈(95:5，v/v)時，name的回收率不到70％，當洗脫劑為二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)時，name的回收率能達到80％以上。因此，最終確定以含2％(v/v)甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10，v/v)溶液作為nh2固相萃取小柱的洗脫劑，此條件下5個化合物均能獲得較好的回收率。
2.2儀器條件的優化
用液相色譜螢光檢測器對nad、naa、2-noa、npa和name標準溶液進行發射波長和激發波長掃描，5個化合物的最佳激發波長和發射波長在270-280nm和330-340nm附近。試驗比較了acquitybehc18色譜柱和acquitybehphenyl色譜柱和acquitycortecsc18+色譜柱在水-甲醇，水-乙腈，0.1％甲酸(v/v)-甲醇，0.1％甲酸(v/v)-乙腈不同流動相下對色譜分離的影響，以水-乙腈為流動相，通過改變溶劑極性進行梯度洗脫能夠使5種化合物在一定的時間內獲得比水-甲醇更好的分離效果，水相中加入0.1％甲酸(v/v)可以改善化合物的色譜峰形和獲得更穩定的保留。c18色譜柱、phenyl色譜柱和cortecsc18+色譜柱在0.1％甲酸(v/v)-乙腈為流動相時，對5個化合物的分離效果無明顯差異。因此，試驗確定採用較通用的behc18色譜柱，0.1％(v/v)甲酸-乙腈為流動相梯度洗脫，在激發波長280nm，發射波長330nm下進行nad、naa、2-noa、npa和name的測定(標準樣品色譜圖見圖2)。從草莓空白樣品和草莓加標樣品色譜圖(圖3、圖4)可以看出，該條件下5種萘衍生物在樣品中基本無色譜幹擾。
草莓空白樣品：稱取10g粉碎好的草莓樣品直接進行樣品提取淨化處理得到的空白測試樣品。
草莓加標樣品：稱取10g粉碎好的草莓樣品，添加一定濃度(具體數值參見表3)萘衍生物標準溶液後進行樣品提取淨化處理得到的加標測試樣品。
2.3線性範圍與檢出限
將10mg/l的nad、naa、2-noa、npa和name混合標準溶液逐級稀釋成0.005、0.01、0.02、0.1和1.0mg/l的混合標準工作溶液，經超高效液相色譜儀測定，5種萘衍生物在0.005-1.0mg/l濃度範圍內與色譜峰面積呈現良好的線性關係，相關係數(r2)≥0.99996，回歸方程和相關係數見表3。通過加標回收實驗，根據信噪比(s/n)≥10的峰響應值和樣品前處理的稀釋倍數，確定方法定量限(loq)為0.001-0.002mg/kg。
表3回歸方程、相關係數(r2)、定量限(loq)
2.4方法的準確度與精密度
對水果空白樣品進行添加回收試驗，添加水平為0.004、0.02和0.2mg/kg，考察方法的準確度和精密度，回收率和相對標準偏差(rsd)結果見表4。結果顯示，5種萘衍生物在水果中的添加回收率為77.6％-95.0％，rsd為4.3％-11.2％。
表4添加回收率和相對標準偏差(rsd)(n＝6)
採用與草莓相同的實驗方法，我們又測定了葡萄和蘋果，具體數值見表3。
由於水果品種眾多，上述實驗我們只列舉了草莓、葡萄和蘋果三種具有代表性的水果，但是本檢測方法對所有水果均通用。選取上述三種水果是因為葡萄和蘋果普遍食用，草莓基質相對其它水果更加複雜，更能反映本方法的前處理淨化情況和色譜分離情況。
總之，本發明建立了超高效液相色譜-螢光檢測法同時測定水果中1-萘乙醯胺(nad)、1-萘乙酸(naa)、2-萘氧乙酸(2-noa)、1-萘丙酸(npa)和1-萘乙酸甲酯(name)5種萘衍生物的方法。以乙腈為樣品提取液；nh2固相萃取小柱淨化，含1％-2％甲酸的二氯甲烷-乙腈(90:10-95:5，v/v)為淋洗液；用1.7μm，2.1×100mmc18色譜柱分離，0.1％(v/v)甲酸水溶液-0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液為流動相；於超高效液相色譜螢光檢測器激發波長280nm，發射波長330nm下測定。5種化合物在質量濃度0.005-1.0mg/l範圍內，線性關係良好，相關係數(r2)≥0.99996。當樣品中添加水平為0.004、0.02和0.2mg/kg時，回收率為77.6％-95.0％，相對標準偏差(rsd)為4.3％-11.2％，方法檢出限為0.001-0.002mg/kg。本方法簡便、靈敏、準確，適用於水果中nad、naa、2-noa、npa和name這5種萘衍生物的同時測定。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。