快速檢測微小核糖核酸的檢測卡及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-19 17:23:21 4

快速檢測微小核糖核酸的檢測卡及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速檢測微小核糖核酸的檢測卡，包括樣品墊，納米材料墊，硝酸纖維素膜和吸收墊，硝酸纖維素膜即為檢測卡基體，檢測卡基體上分布有進樣區、空白對照區及樣本檢測區，進樣區與樣本檢測區連通，空白對照區及樣本檢測區均修飾有具有與待測miRNA互補的miRNA序列的探針，探針一端與檢測卡基體連接，探針另一端攜帶有螢光基團。本發明還公開檢測卡的製備方法。本發明還公開一種快速檢測微小核糖核酸的試劑盒。本發明還公開檢測卡和檢測試劑盒的應用。本發明對肺癌相關miRNA具有較高的檢測靈敏度，無需PCR可同時檢測多種miRNA，提高了臨床診斷特異性，滿足篩選、診斷肺癌及判斷治療效果與隨訪應用需求。
【專利說明】快速檢測微小核糖核酸的檢測卡及其製備方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種微小核糖核酸（miRNA)的檢測方法，特別涉及快速檢測微小核糖 核酸的檢測卡及其製備方法和應用，屬於檢測【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 肺癌在我國慢性腫瘤中發病和死亡率均處第一位，影像學和形態發現時已進入晚 期，目前無特異性標誌物可用，如何開發出一種快速診斷且適用於臨床發病早期的肺癌檢 測技術，一直都是本領域的技術難點。
[0003] 近年來，隨著人們對人類基因組研究的不斷深入，逐漸揭示了 MicroRNA(miRNA) 在肺癌發生、轉移以及細胞凋亡等之間存在較強的關聯。miRNA是一種高保守，長度大概 21-23個核苷酸，非蛋白編碼RNA，起著調節基因表達的作用。目前已經報告一批miRNA可能 成為診斷肺癌的標誌物，這些miRNA在肺癌的不同階段高度和特異表達，進入循環血中後 穩定持續時間長，是極其早期診斷的潛在標誌物。然而，當前檢測miRNA必須依靠 PCR擴增 放大，耗時長，重複性差，不能滿足臨床需求。因此，開發出一種快速、無需PCR擴增的miRNA 檢測技術具有重要的應用價值。


【發明內容】

[0004] 發明目的：針對現有技術存在的不足，本發明的第一個目的是提供一種快速檢測 微小核糖核酸的檢測卡，可以實現肺癌相關標記物的高靈敏檢測，且操作簡單，成本低廉， 無需PCR擴增技術。
[0005] 本發明的第二個目的是提供了上述檢測卡的製備方法。
[0006] 本發明的第三個目的是提供了一種快速檢測微小核糖核酸的試劑盒。
[0007] 本發明的第四個目的是提供了上述檢測卡和試劑盒的應用。
[0008] 技術方案：為實現上述發明的目的，本發明採用的技術方案是：一種快速檢測微 小核糖核酸的檢測卡，包括依次相連的樣品墊，納米材料墊，硝酸纖維素膜和吸收墊，所述 硝酸纖維素膜即為檢測卡基體，所述檢測卡基體上分布有進樣區、空白對照區及樣本檢測 區，所述進樣區與樣本檢測區連通，所述空白對照區及樣本檢測區均修飾有具有與待測 miRNA互補的miRNA序列的探針，所述探針一端與檢測卡基體連接，所述探針另一端攜帶有 螢光基團。上述的納米材料墊為金納米顆粒結合區域。
[0009] 進一步的，所述待測 miRNA 的序列包括 miR-21、miR-24、miR-25、miR_30a、 miR-100、miR-126、miR-143、miR-145、miR-152、miR-155、miR-183、miR-188、miR-189、 miR-200b、miR-320、miR-331中的任一種或兩種以上的組合。
[0010] 進一步地，所述檢測卡有1組?10組空白對照區和樣本檢測區，以實現對單一種 類miRNA或多種minRNA的檢測，提升檢測卡的檢測通量。
[0011] 進一步地，所述螢光基團為Cy3或Cy5。
[0012] 快速檢測微小核糖核酸的檢測卡的製備方法，包括以下步驟：
[0013] 1)合成含有miRNA的探針，首先在miRNA -端修飾由5至20個碳原子組成的碳 鏈，在另一端修飾螢光基團，然後合成得到探針；
[0014] 2)在硝酸纖維素膜表面即檢測卡基體上限定一組空白對照區以及樣本檢測區，將 含有濃度為l〇ng/L?lmg/L的步驟1)所述探針的溶液噴塗至空白對照區及樣本檢測區， 並於溫度為37°C的條件下保持Ih以上；其中噴塗溶液體積可以依據實際需求而定，例如， 可以為100μ L至2mL。
[0015] 3)將步驟2)修飾完成的硝酸纖維素膜切割成合適尺寸，然後與樣品墊、納米材料 墊和吸收墊組裝成檢測卡。
[0016] 一種快速檢測微小核糖核酸的試劑盒，包含上述的檢測卡和金納米顆粒標記的 miRNA,所述金納米顆粒標記的miRNA具有與待測miRNA相同的序列。
[0017] 進一步地，所述金納米顆粒標記的miRNA中，miRNA共價連接於金納米顆粒表面， 所述金納米顆粒的粒徑為5nm?50nm，其在與前述螢光基團接近時，將產生較高的螢光淬 滅效率。為促進前述miRNA與金納米顆粒的連接，可對所述金納米顆粒的進行表面修飾，例 如，在金納米顆粒表面包裹朽 1橡酸二納等物質，以及，在miRNA末端修飾疏基等，利用疏基 與金的共價結合，將前述miRNA較為穩定的連接於金納米顆粒表面。
[0018] 上述的檢測卡、試劑盒在檢測微小核糖核酸中的應用。
[0019] 上述的應用，將包含有待測miRNA的樣本與金納米顆粒標記miRNA的混合溶液共 同滴加至檢測卡的進樣區，並使所述混合溶液定向流動至樣本檢測區，與固定在樣本檢測 區的探針結合；檢測樣本檢測區及空白對照區的螢光強度，並將樣本檢測區的螢光強度與 空白對照區的螢光強度進行比對，從而獲知樣本中的待測miRNA濃度。
[0020] 將樣本加入檢測卡後，保持15min?60min再進行螢光強度測量，檢測溫度為 20°C?50°C。
[0021] 在測得空白對照區以及樣本檢測區的螢光強度後，將樣本檢測區的螢光強度除以 空白對照區的螢光強度，結合標定曲線而判斷出樣本中待測miRNA的濃度。
[0022] 其中，前述標定曲線的建立方式是業界悉知的，S卩，可依據前述檢測方法，加待測 miRNA的一系列不同濃度的標準樣品分別與金納米顆粒標記miRNA分別混合後加入所述檢 測卡，並記錄各標準樣品相應的螢光強度，繼而建立能反應出標準樣品濃度與檢測螢光強 度之關係的標定曲線。
[0023] 利用本發明的檢測方法，可以在短至十幾分鐘的時間內完成測試，無需複雜設備， 且檢測濃度可低至fmol/L水平。
[0024] 進一步地，本發明中，前述的樣本可直接來源於血清、血液等體液。
[0025] 檢測原理為競爭法：將包含有待測miRNA的樣本與金納米顆粒標記miRNA的混合 溶液共同滴加至檢測卡的進樣區，並使所述混合溶液定向流動至樣本檢測區，與固定在樣 本檢測區的探針miRNA結合，探針miRNA表面攜帶有螢光基團。上述兩種miRNA會競爭性地 與探針miRNA相結合，當金納米顆粒標記的miRNA結合後，會淬滅掉原miRNA探針的突光， 淬滅程度與待測miRNA的濃度相關。檢測樣本檢測區及空白對照區的螢光強度，空白對照 區系作為質控線，其螢光強度用於質控；並將樣本檢測區的螢光強度與標準曲線進行比對， 從而獲知樣本中的待測miRNA濃度。
[0026] 檢測卡中分布有多組空白對照區以及樣本檢測區，通過檢測每組空白對照區以及 樣本檢測區的螢光信號，可以判斷待測樣本中的目標miRNA含量。
[0027] 有益效果：與現有技術相比，本發明的優點包括：
[0028] (1)本發明通過使用miRNA作為肺癌檢測的標誌物，多組miRNA並行檢測，可以涵 蓋足篩選、診斷肺癌及判斷治療效果與隨訪應用需求；
[0029] (2)提供了一種快速檢測微小核糖核酸的檢測卡，利用該檢測卡，可以實現對與肺 癌相關的miRNA分子的快速、高靈敏檢測，無需複雜操作，效率高，成本低廉，並可根據實際 需要檢測特定單種或多種miRNA分子，而通過評價不同miRNA的含量水平，還可輔助篩選和 診斷肺癌，評估療效和預後；
[0030] (3)進一步的，通過引入金納米顆粒進行miRNA的檢測，採用競爭法的策略，可以 通過判斷螢光淬滅的形式實現miRNA的檢測，進一步提升檢測靈敏度，無需複雜耗時的PCR 擴增技術，並可以臨床血清或組織等作為檢測樣本，實現早期肺癌篩選，克服了影像學等當 前主流檢測技術的缺陷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1本發明一典型實施方案中一種快速檢測微小核糖核酸的方法的原理圖；1-檢 測卡基體；2-預先固定於空白對照區以及樣本檢測區、具有與待測miRNA互補miRNA序列 的探針，其一端修飾有碳鏈，另一端修飾有螢光基團；3-螢光基團；4-金納米顆粒；5-與待 測 miRNA 互補的 miRNA ;6_ 待測 miRNA ;
[0032] 圖2為本發明實施例1示意圖，可實現單種miRNA的檢測；
[0033] 圖3為本發明實施例2示意圖，可實現五種miRNA的檢測；7-樣品墊；8-納米材料 墊；9-硝酸纖維膜；10-吸收墊；11-樣本檢測區；12-空白對照區；13-17-五種miRNA對應 的樣本檢測區以及空白對照區。
[0034] 圖4為實施例一中的標定曲線。

【具體實施方式】
[0035] 下面結合附圖和具體實施例，進一步闡明本發明，本實施例在以本發明技術方案 為前提下進行實施，應理解這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。
[0036] 實施例1與肺癌發病相關的miR-21的檢測：
[0037] 首先合成與miR-21互補的miRNA序列，在其一端修飾5個碳原子組成的碳鏈，另 一端標記Cy3突光基團；
[0038] 在硝酸纖維素膜表面限定一組空白對照區以及樣本檢測區。利用點噴技術將中 100 μ L、1 μ mol/L miR-21互補miRNA溶液噴塗於空白對照區以及樣本檢測區表面，置於 37°C下保持1小時。進一步利用試紙條切刀機將修飾完成的硝酸纖維素膜切割成合適尺 寸，然後與樣品墊、納米材料墊和吸收墊組裝成檢測卡。
[0039] 將miR-21溶液與直徑5nm、表面包裹為檸檬酸三鈉的金納米顆粒混合，製備金納 米顆粒標記的miR-21溶液。
[0040] 在肺癌檢測過程中，首先將金納米顆粒標記的miRNA與血清樣本混合，通過進樣 區滴加進檢測試劑盒，反應15分鐘後利用螢光檢測儀進行檢測。使用晶芯LuxScan IOK微 陣列晶片掃描儀分別檢測空白對照區以及樣本檢測區的螢光強度，PMT增益設置為700,採 集得到空白對照區螢光強度達到約4萬計數，則可表明檢測卡可以正常工作；將採集到的 樣本檢測區螢光強度，對比作出標定曲線，如圖4所示，可以判斷出樣本中的目標miRNA濃 度。採用該方法可以檢測miR-21的濃度低至6pmol/L。檢測溫度為35°C。
[0041] 標定曲線原始數據：
[0042]

【權利要求】
1. 一種快速檢測微小核糖核酸的檢測卡，包括依次相連的樣品墊，納米材料墊，硝酸纖 維素膜和吸收墊，其特徵在於，所述硝酸纖維素膜即為檢測卡基體，所述檢測卡基體上分布 有進樣區、空白對照區及樣本檢測區，所述進樣區與樣本檢測區連通，所述空白對照區及樣 本檢測區均修飾有具有與待測miRNA互補的miRNA序列的探針，所述探針一端與檢測卡基 體連接，所述探針另一端攜帶有螢光基團。
2. 根據權利要求1所述的快速檢測微小核糖核酸的檢測卡，其特徵在於，所述待測 miRNA 的序列包括 miR-21、miR-24、miR-25、miR-30a、miR-100、miR-126、miR-143、miR-145、 miR-152、miR-155、miR-183、miR-188、miR-189、miR-200b、miR-320、miR-331 中的任一種或 兩種以上的組合。
3. 根據權利要求1所述的快速檢測微小核糖核酸的檢測卡，其特徵在於，所述檢測卡 有1組?10組空白對照區和樣本檢測區。
4. 根據權利要求1所述的快速檢測微小核糖核酸的檢測卡，其特徵在於，所述螢光基 團為Cy3或Cy5。
5. 權利要求1?4任一項所述的快速檢測微小核糖核酸的檢測卡的製備方法，其特徵 在於，包括以下步驟： 1) 合成含有miRNA的探針，首先在miRNA -端修飾由5至20個碳原子組成的碳鏈，在 另一端修飾螢光基團，然後合成得到探針； 2) 在硝酸纖維素膜表面即檢測卡基體上限定一組空白對照區以及樣本檢測區，將含有 濃度為l〇ng/L?lmg/L的步驟1)所述探針的溶液噴塗至空白對照區及樣本檢測區，並於 溫度為37°C的條件下保持lh以上； 3) 將步驟2)修飾完成的硝酸纖維素膜切割成合適尺寸，然後與樣品墊、納米材料墊和 吸收墊組裝成檢測卡。
6. -種快速檢測微小核糖核酸的試劑盒，其特徵在於，包含權利要求1-4中任一項所 述的檢測卡和金納米顆粒標記的miRNA,所述金納米顆粒標記的miRNA具有與待測miRNA相 同的序列。
7. 根據權利要求6所述的快速檢測微小核糖核酸的試劑盒，其特徵在於，所述金納米 顆粒標記的miRNA中，miRNA共價連接於金納米顆粒表面，所述金納米顆粒的粒徑為5nm? 50nm〇
8. 權利要求1?4中任一項所述的檢測卡、權利要求6?7任一項所述的試劑盒在檢 測微小核糖核酸中的應用。
9. 權利要求8所述的應用，其特徵在於，將包含有待測miRNA的樣本與金納米顆粒標記 miRNA的混合溶液共同滴加至檢測卡的進樣區，並使所述混合溶液定向流動至樣本檢測區， 與固定在樣本檢測區的探針結合；檢測樣本檢測區及空白對照區的螢光強度；空白對照區 作為質控，根據樣本檢測區的螢光強度從而獲知樣本中的待測miRNA濃度。
10. 權利要求9所述的應用，其特徵在於，將樣本加入檢測卡後，保持15min?60min再 進行螢光強度測量，檢測溫度為20°C?50°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK104372089SQ201410633033
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月11日 優先權日:2014年11月11日
【發明者】孔濤, 張寄南, 王煒, 張雷, 程國勝 申請人:南京博納天元生物科技有限公司