一種細胞-凝膠材料複合微球及其製備方法和應用的製作方法

2023-05-19 17:16:01

一種細胞-凝膠材料複合微球及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種細胞-凝膠材料複合微球及其製備方法和應用，屬於生物醫學材料領域。包括凝膠微球和分布在所述凝膠微球內部的細胞。所述製備方法為將凝膠材料-細胞混合液分散於油性溶液，經乳化和凝膠化處理，得到細胞-凝膠材料複合微球。所述複合微球中細胞裝載率可控，細胞存活率高，體積收縮小，不易破碎，且營養物質和代謝產物傳輸能力良好。還可用於製備非勻質水凝膠，得到仿生度更高的材料。且製備方法簡單，便於推廣應用。
【專利說明】一種細胞-凝膠材料複合微球及其製備方法和應用

【技術領域】
[0001]本發明屬於生物醫學材料領域，具體涉及一種細胞-凝膠材料複合微球及其製備方法和應用。
技術背景
[0002]生物醫用凝膠材料(如膠原等)能夠營造與細胞外基質接近的環境，為細胞的黏附、生長和增殖提供空間，具有良好的生物相容性、可生物降解性，同時還表現出一定的生物學活性與功能，因此已經成為生物醫學材料研究與應用中的重要材料，在科學研究與臨床應用領域都表現出較高的價值。
[0003]現有的報導中，絕大多數膠原水凝膠是在毫米至釐米的尺寸範圍內，以塊狀形式進行研究或應用。在這些研究和應用中，膠原基生物材料除了表現出良好的生物學性能以夕卜，也暴露出力學性能差而導致材料破碎、通透性差而導致傳質緩慢等缺陷；而對膠原材料進行化學交聯等處理雖然能改進其力學性能，但是改性過程對裝載細胞是極大的威脅。


【發明內容】

[0004]發明人通過對現有技術的綜合分析發現現有技術中存在以下不足:
[0005]1.塊狀的水凝膠材料力學性能較差且不耐酶作用，在裝載細胞後易發生破碎降解、體積劇烈收縮、內部細胞明顯凋亡等現象，難以體現凝膠材料的作用與優勢；
[0006]2.現有的凝膠微球及其技術，主要目的是裝載藥物或生物活性物質，通過交聯處理實現藥物或生物活性物質的傳送與緩釋，不能實現細胞的裝載，不能體現凝膠微球在營養物質輸送和代謝產物排放等方面的優勢。
[0007]針對上述問題，本發明提供了提供細胞-凝膠材料複合微球，其製備過程簡單且可以通過工藝參數的選擇控制產品的性能，細胞的裝載率和存活率都較高，具有廣闊的應用前景。
[0008]本發明通過以下技術方案來實現:
[0009]一種細胞-凝膠材料複合微球，包括凝膠微球和分布在所述凝膠微球內部的細胞。所述複合微球中細胞裝載率可控，細胞存活率高，體積收縮小，不易破碎，且營養物質傳輸能力強。還可用於製備非勻質水凝膠，得到仿生度更高的材料。
[0010]作為可選方式，在上述細胞-凝膠材料複合微球中，所述凝膠微球為球形或接近球形，尺寸分布為30-1000 μ m。該尺寸的微球具有較大的比表面積，便於與周圍環境接觸響應，也有利於物質傳輸。
[0011]作為可選方式，將包載了不同細胞的複合微球混合在一起共同培養，可以構建多種細胞混合共培養體系。
[0012]本發明還提供了一種包載細胞的非勻質水凝膠，包括凝膠化的連續相和上述的細胞-凝膠材料複合微球，所述細胞-凝膠材料複合微球分布在所述凝膠化的連續相中。所述水凝膠是非勻質的，所述連續相和微球可以採用相同的凝膠材料，獲得材料形態結構分布不均勻的非勻質材料；也可以採用不同的凝膠材料，採用不同的凝膠材料時可以仿生天然組織中不同部位的局部微環境組成與結構，獲得材料組成與結構不均勻的非勻質材料；還可以根據需要在製備時對連續相進行改性處理，或採用經過不同改性處理的凝膠微球來製備所述非勻質水凝膠，可以獲得材料性能(如力學性能、降解性能等)分布不均勻的非勻質材料。另外，採用微球和連續相配合的方式可以在水凝膠內部提供豐富的界面，一方面便於營養物質和代謝產物的傳輸，另一方面可以充分發揮同種細胞間的相互作用和不同細胞間的相互影響，促進細胞的生長、增殖並進一步分泌形成天然細胞外基質。
[0013]作為可選方式，在上述非勻質水凝膠中，在所述凝膠化的連續相外圍還包覆有至少一層凝膠化的連續相或者所述凝膠化的連續相作為凝膠單元又分布在另外一層凝膠化的連續相中。
[0014]作為可選方式，在上述非勻質水凝膠中，構成所述連續相和凝膠微球的材料為具有良好生物相容性的凝膠材料。採用良好生物相容性好的凝膠材料有利於細胞的黏附生長及組織的形成。
[0015]作為可選方式，在上述非勻質水凝膠中，所述凝膠材料的前體材料具有良好水溶性。便於在製備過程中乳化成球。
[0016]作為可選方式，在上述非勻質水凝膠中，構成所述連續相和凝膠微球的材料為環境敏感型凝膠材料。採用環境敏感型凝膠材料便於進行凝膠化處理。
[0017]作為可選方式，在上述非勻質水凝膠中，所述環境敏感性凝膠材料為溫敏材料、光敏材料或者離子敏感材料中的至少一種。進一步的，所述溫敏材料可以是膠原、聚異丙基丙烯醯胺及其衍生物等凝膠溫度低於40°C的材料中的至少一種；所述光敏材料可以是甲基丙烯酸酐或馬來酸酐改性的透明質酸衍生物、硫酸軟骨素衍生物、普魯蘭多糖衍生物等水溶性光敏多糖材料中的至少一種，光引發劑可以是2-羥基-4』 _(羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮(12959)、1-羥基環己基苯基丙酮(1184)、2，2-二甲氧基-苯基苯乙酮(1651)中的一種；所述離子敏感材料可以是海藻酸衍生物。
[0018]作為可選方式，在上述非勻質水凝膠中，包載兩種或兩種以上的細胞，可以形成多種細胞有限接觸三維共培養體系。在該共培養體系中可以在所述連續相中裝載一種細胞，將其餘不同種類的細胞分別裝載在不同的凝膠微球中(一個凝膠微球中裝載同種細胞)；也可以將兩種或兩種以上的細胞分別裝載在不同的凝膠微球中(一個凝膠微球中裝載同種細胞)。在幹細胞的定向誘導研究方面，研究人員已確認材料的三維結構以及力學強度等物理性能會影響幹細胞的分化命運，同時也已經意識到不同種類細胞之間的相互作用是不能被忽略的，多種細胞的三維共培養是研究該問題的有效手段之一。現有的報導中，實現共培養的方式有兩種，一種為直接接觸，即將不同種類的細胞直接混合後再在支架材料上進行共培養，另一種為間接接觸，即在不同支架上分別接種不同細胞後在同一個培養基環境中共培養，如transwell培養體系。同樣的，從仿生角度看，不管是直接接觸還是間接接觸都存在一定的缺陷，不能模擬生理環境中不同細胞有局部接觸但又不混雜的情況。通過本發明所述有限接觸共培養體系，在同一個培養載體中將不同種類的細胞隔開，僅通過有限接觸進行共培養，可以更好的模擬生理環境中不同細胞有局部接觸但又不混雜的情況。該體系可用於研究不同種子細胞在有限接觸的共培養體系中的相互影響以及對組織工程支架材料的作用，特別適用於研究幹細胞誘導分化的條件與機制探討。
[0019]作為可選方式，所述的膠原可以是動物皮、肌腱、尾腱為原料製備的膠原中的一種；所述的細胞可以是骨髓間充質幹細胞、脂肪幹細胞等祖細胞，或軟骨細胞、成纖維細胞、內皮細胞等成體細胞中的一種。
[0020]本發明還提供了一種所述細胞-凝膠材料複合微球的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟:
[0021]I)製備凝膠材料-細胞混合液；2)將所述凝膠材料-細胞混合液(水相)分散於油性溶液，經乳化和凝膠化處理，得到細胞-凝膠材料複合微球。
[0022]作為可選方式，在上述製備方法中，所述步驟I)具體為:將凝膠材料溶液pH調節至6.5-7.5，靜置或離心去泡，得到中性凝膠材料溶液；將經計數的細胞由少量培養基或緩衝液配成細胞懸液，再加入到上述中性凝膠材料溶液中。所述的培養基可以是RPMI1640、MEM、a MEM中的一種，所述的緩衝液可以是生理鹽水、PBS緩衝液、HEPES緩衝液中的一種。
[0023]作為可選方式，在上述製備方法中，所述步驟2)具體為:向油性溶液中加入體積百分濃度為0%?10%的表面活性劑，然後在機械攪拌作用下，加入凝膠材料-細胞混合液，使凝膠材料均勻分散於所述油性溶液中形成油包水的微球，攪拌兩相混合液的同時選擇相應的凝膠條件實現微球的凝膠化。所述凝膠材料溶液中凝膠材料的濃度優選為3_50mg/mLo
[0024]作為可選方式，在上述製備方法中，所述的油性溶液可以是甲基矽油、石蠟油等礦物油或橄欖油、蓖麻油、玉米油、菜籽油等植物油中的一種或其混合，優先選擇粘度為20-200mPa.s的油性溶液。向油性溶液中加入0%-10% (v/v)的表面活性劑，所述的表面活性劑可以是 Tween-20、Tween-40> Tween-60> Tween-80> Span-20> Span-40> Span-60>Span-80、Triton X-100 中的一種。
[0025]作為可選方式，在上述製備方法中，所述步驟2)中水相溶液(凝膠材料-細胞混合液)與油相溶液的比例為0.5% -40%，優選1% -5%，以100-1500rpm的速度持續攪拌l-30min,使水相分散成微球。
[0026]作為可選方式，在上述製備方法中，所述凝膠化處理可以是升溫、光引發交聯、酶催化交聯等成膠方法中的至少一種。例如:溫敏材料從低溫升溫至凝膠溫度以上並保持10-45min ;光敏材料用特定波長的紫外光照射10-360秒；離子敏感材料用滴加二價陽離子溶液，如氯化鈣、氯化鋅、氯化鎂等實現成膠。
[0027]作為可選方式，在上述製備方法中，還包括洗滌分離步驟，通過洗滌分離步驟充分去除油相，保留。所述分離可以選用離心或過濾等常用的分離方式；所述洗滌步驟具體為將步驟2)中製得的細胞-凝膠材料複合微球在培養基或者含O % -0.1% Tween 80的緩衝液中分散、衝洗2-4次。所述的培養基可以是RPMI1640、MEM、a MEM中的一種，所述的緩衝液可以是生理鹽水、PBS緩衝液、HEPES緩衝液中的一種。
[0028]本發明還提供了一種製備上述的非勻質水凝膠的方法，包括以下步驟:
[0029](I)按照本發明所述方法製備細胞-凝膠材料複合微球；(2)將所述細胞-凝膠材料複合微球與凝膠材料構建成非勻質水凝膠。
[0030]作為可選方式，在上述製備方法中，所述步驟(2)具體為將所述凝膠微球分散於連續相溶液介質中或分散於經改性或經部分凝膠化處理的連續相介質中，再對上述混合體系進行凝膠化處理形成非勻質水凝膠。
[0031]作為可選方式，在上述製備方法中，在所述步驟(2)中在進行凝膠化處理前向混合溶液中加入細胞，混勻後再進行凝膠化處理，可以製得包載了細胞的非勻質水凝膠。作為可選，在加入細胞前可將混合溶液的PH值調節至6.5-7.5。加入細胞後的混合溶液中的細胞的密度優選為13-1O9個/mL。
[0032]作為可選方式，在上述製備方法中，向凝膠材料溶液中加入細胞的具體方式可以為:將凝膠材料溶液PH調節至6.5-7.5，靜置或離心去泡，得到中性凝膠材料溶液；將經計數的細胞由少量培養基或緩衝液配成細胞懸液，再加入到上述中性凝膠材料溶液中。所述的培養基可以是RPMI1640、MEM、a MEM中的一種，所述的緩衝液可以是生理鹽水、PBS緩衝液、HEPES緩衝液中的一種。
[0033]作為可選方式，在上述製備方法中，將製得的非勻質水凝膠分散於連續相溶液介質中或分散於經改性或經部分凝膠化處理的連續相介質中，再對上述混合體系進行凝膠化處理形成多層非勻質水凝膠。
[0034]本發明還提供了一種所述細胞-凝膠材料複合微球的應用，其特徵在於，將其用於製作仿生組織修復材料或用於多種細胞共培養。
[0035]本發明還提供了一種所述的非勻質水凝膠的應用，其特徵在於，將其用於製作仿生組織修復材料或用於組織工程或用作種子細胞的載體或用作多種細胞的有限接觸共培養載體。
[0036]本說明書中公開的所有特徵，或公開的所有方法或過程中的步驟，除了互相排斥的特徵和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。
[0037]本發明的有益效果:
[0038]1、本發明所述的細胞-凝膠材料複合微球，製備方法簡單，微球尺寸可控且分布較為集中，細胞裝載率、存活率高；凝膠微球在保持膠原生物學性能的同時，具有良好的傳質通透性，細胞在凝膠微球中不僅能很好的黏附、增殖，還可以保持旺盛的生物學能力，其分泌的細胞外基質可以緩解甚至完全抑制凝膠微球的收縮。
[0039]2、本發明所述的細胞-凝膠材料複合微球及非勻質水凝膠製備方法可以獲得綜合性能優良的水凝膠材料，可用於組織工程中種子細胞的載體，實現組織工程支架中種子細胞的局部高密度、梯度密度，或者多種種子細胞的共培養等目的，實現組織的修復與重建。

【專利附圖】

【附圖說明】
:
[0040]圖1為本發明所述實施例3中裝載軟骨細胞的膠原微球的光鏡照片；
[0041]圖2為本發明所述實施例3中裝載軟骨細胞的膠原微球的尺寸及分布統計；
[0042]圖3為本發明所述實施例3中裝載軟骨細胞的膠原微球體外培養Id的雷射共聚焦圖片；
[0043]圖4為本發明所述實施例5中裝載骨髓間充質幹細胞的膠原微球的尺寸及分布統計；
[0044]圖5為本發明所述實施例5中裝載骨髓間充質幹細胞的膠原微球體外培養3d、7d、14d和21d的雷射共聚焦圖片；
[0045]圖6為本發明所述實施例5中裝載骨髓間充質幹細胞的透明質酸微球的尺寸及分布統計；
[0046]圖7為本發明所述實施例9中的微球膠原水凝膠和塊狀膠原水凝膠中牛血清蛋白的釋放曲線；
[0047]圖8為本發明所述實施例10中裝載軟骨細胞的微球膠原水凝膠和塊狀膠原水凝膠體外培養3d、7d和14d的雷射共聚焦圖片；
[0048]圖9為本發明所述非勻質水凝膠的製備方法的工藝流程圖。

【具體實施方式】
:
[0049]本發明的製備工藝流程為(如圖9所示):凝膠材料溶液調pH後與細胞懸液製成凝膠材料-細胞混合液，在油性溶液中分散後進行凝膠化處理，再將所得到的產物清洗處理，獲得裝載細胞的微球；微球再分散於溫敏材料或光敏材料的連續相溶液中，凝膠化處理形成非勻質水凝膠。
[0050]其中，使用溫敏材料時，細胞材料混合液需要在低溫條件下進行混合；使用光敏材料時，細胞材料混合液中需要加入光引發劑；分散處理是在一定攪拌條件下，使細胞材料混合液分散於油性溶液中；持續攪拌分散一段時間後，進行凝膠化處理微球粗品；經反覆清洗分離或者過濾分離後獲得微球；將裝載細胞的微球分散於溫敏材料或光敏材料的連續相溶液中，進一步凝膠化構建成非勻質水凝膠。
[0051]以下通過實施例再對本發明的上述內容作進一步的詳細說明。但不應當將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實例。在不脫離本發明的精神和原則之內做的任何修改，以及根據本領域普通技術知識和慣用手段做出的等同替換或者改進，均應包括在本發明的保護範圍內。以下實施例中所用原料均可以從市場上購得。
[0052]實施例1
[0053](I)取200mL菜籽油，加入少量Tween-60，在冰浴條件下，利用磁力攪拌器以1500rpm的轉速攪拌菜籽油,將ImL濃度為15mg/mL的膠原溶液緩緩滴加到菜籽油中連續攪拌20min，將上述水相-油相混合液升溫至37°C，並始終保持攪拌lOmin，攪拌完成後，對混合液進行清洗和分離，去除油相，得到平均粒徑約為30微米的膠原微球。
[0054](2)將步驟⑴中製得的膠原微球分散於濃度為15mg/mL的膠原溶液中，將上述含微球的膠原溶液轉移至模具，升溫至37°C保持30min，即可獲得膠原連續相包裹膠原微球的非勻質膠原水凝膠。將所得水凝膠剖開，在掃描電鏡下可觀察到材料內部微球與連續相之間具有大量界面。
[0055]實施例2
[0056](I)取4mL橄欖油與6mL玉米油在800rpm的轉速下攪拌混勻獲得混合油相溶液，在攪拌條件下，將4mL含光引發劑1184的透明質酸(經馬來酸酐改性的透明質酸)溶液(透明質酸濃度為3mg/mL)緩慢滴加到上述混合油相溶液中，連續攪拌30min。採用波長為365nm、光強為30mW/cm2的紫外光輻射360s引發聚合反應，使透明質酸微球凝膠化，並始終保持攪拌1min ;對混合液進行清洗和分離，去除油相，得到平均粒徑約為1000微米的透明質酸微球。
[0057](2)將步驟(I)中製得的透明質酸微球分散於濃度為8mg/mL的經馬來酸酐改性的透明質酸溶液中，將上述含微球的透明質酸溶液轉移至模具，採用波長為365nm、光強為30mff/cm2的紫外光輻射360s引發聚合反應，即可獲得透明質酸連續相包裹透明質酸微球的非勻質透明質酸水凝膠。
[0058]細胞黏附實驗顯示，實施例1與實施例2中所得的非勻質水凝膠具有良好的生物相容性和良好營養物質傳輸能力，細胞可在其表面很好的黏附、鋪展、爬行和生長。
[0059]實施例3
[0060]按以下步驟製備裝載軟骨細胞的膠原微球:
[0061](I)取濃度為10mg/mL的膠原溶液，在冰浴中用少量2mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.0左右後，稀釋至膠原終濃度為4.5mg/mL ；
[0062](2)將上述膠原溶液於4°C靜置2h，待氣泡脫去後獲得中性膠原溶液；
[0063](3)將事先準備好的處於指數生長期的軟骨細胞，計數並用MEM培養基配成細胞懸液，再將其加入到ImL上述中性膠原溶液中並分散均勻，使細胞密度為I X 16個/mL ；
[0064](4)選擇粘度為50mPa.s的甲基矽油72mL，不加入表面活性劑；
[0065](5)在冰浴條件下，利用磁力攪拌器以500rpm的轉速攪拌甲基矽油，緩緩將上述軟骨細胞膠原混合液滴加到甲基矽油中，連續攪拌20min ；
[0066](6)將上述水相-油相混合液升溫至37°C，並始終保持攪拌30min ；
[0067](7)攪拌完成後，對混合液進行離心，再將上層液體傾倒掉；
[0068](8)用pH 7.4的PBS緩衝液衝洗離心後的沉澱，再離心傾去上層液體，重複該清洗離心過程2次；
[0069](9)最後離心得到的沉澱即為裝載軟骨細胞的膠原微球，將其分散於MEM培養基用於後續的培養。
[0070]分散於培養基的膠原微球用光學顯微鏡拍照後，用圖像處理軟體對其尺寸進行統計，光學照片如圖1所示，統計結果如圖2所示，可見膠原微球尺寸為202.1 ±55.7 μ m，且分布較為集中。裝載軟骨細胞的膠原微球培養Id後，取樣進行雷射共聚焦顯微鏡觀察，結果如圖3所示，可見細胞黏附、增殖良好。
[0071]實施例4
[0072]按以下步驟製備裝載軟骨細胞的膠原微球:
[0073](I)取濃度為15mg/mL的膠原溶液，在冰浴中用少量lmol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.0左右後，稀釋至膠原終濃度為8.5mg/mL ；
[0074](2)將上述膠原溶液於4°C離心lOmin，取無氣泡液體為中性膠原溶液；
[0075](3)將事先準備好的處於指數生長期的骨髓間充質幹細胞細胞，計數並用αΜΕΜ培養基配成細胞懸液，再將其加入到ImL上述中性膠原溶液中並分散均勻，使細胞密度為5 X 17 個/mL ；
[0076](4)選擇粘度為10mPa *s的液體石臘36mL,加入0.5% (v/v) Span-80,用磁力攪拌器以800rpm的轉速攪拌獲得油相溶液；
[0077](5)在冰浴條件下，緩緩將上述骨髓間充質幹細胞膠原混合液滴加到油相溶液中，連續攪拌30min ；
[0078](6)將上述水相-油相混合液升溫至37°C，並始終保持攪拌15min ；
[0079](7)攪拌完成後，對混合液進行離心，將上層液體傾倒掉後將沉澱分散於a MEM培養基中；
[0080](8)將上述含有膠原微球的a MEM培養基經100 μ m篩網過濾，並用50mL以上的培養基衝洗；
[0081](9)最後得到的沉澱即為裝載骨髓間充質幹細胞的膠原微球，將其分散於αΜΕΜ培養基用於後續的培養。
[0082]分散於培養基的膠原微球用光學顯微鏡拍照後，用圖像處理軟體對其尺寸進行統計，結果如圖4所示，可見膠原微球尺寸為194.0±85.2μπι，且分布較為集中。裝載骨髓間充質幹細胞的膠原微球連續培養14d，並分別在培養3d、7d和14d時取樣進行雷射共聚焦顯微鏡觀察，結果如圖5所示，可見細胞黏附、增殖良好，且有明顯的細胞外基質分泌。
[0083]實施例5
[0084]按以下步驟製備裝載骨髓間充質幹細胞的透明質酸微球:
[0085](I)取適量用甲基丙烯酸酐改性的透明質酸，用PBS緩衝液配製成濃度為20mg/mL的溶液；
[0086](2)向上述溶液中加入光引發劑12959，使其終濃度為0.1% ;
[0087](3)將事先準備好的處於指數生長期的骨髓間充質幹細胞細胞，計數並用αΜΕΜ培養基配成細胞懸液，再將其加入到ImL上述透明質酸溶液中並分散均勻，使細胞密度為I X 17 個 /mL ；
[0088](4)選擇粘度為80mPa.s的液體石臘54mL,加入0.2% (v/v) Span-80,用磁力攪拌器以650rpm的轉速攪拌獲得油相溶液；
[0089](5)在持續攪拌下，緩緩將上述骨髓間充質幹細胞透明質酸混合液滴加到油相溶液中，連續攪拌35min ；
[0090](6)採用波長為365nm、光強為30mW/cm2的紫外光輻射60s引發聚合反應，使透明質酸微球凝膠化，並始終保持攪拌1min ；
[0091](7)攪拌完成後，對混合液進行離心，將上層液體傾倒掉後將沉澱分散於a MEM培養基中；
[0092](8)將上述含有微球的a MEM培養基經100 μ m篩網過濾，並用50mL以上的培養基衝洗；
[0093](9)最後得到的沉澱即為裝載骨髓間充質幹細胞的透明質酸微球。
[0094]分散於培養基的透明質酸微球用光學顯微鏡拍照後，用圖像處理軟體對其尺寸進行統計，結果如圖6所示，可見透明質酸微球尺寸為144.2±53.4μπι，且分布較為集中。
[0095]實施例6
[0096]按以下步驟製備非勻質膠原水凝膠:
[0097](I)取濃度為10mg/mL的膠原溶液，在冰浴中用少量2mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.0後，稀釋至膠原終濃度為6.0mg/mL ；
[0098](2)將上述膠原溶液於4°C離心lOmin，取無氣泡液體為中性膠原溶液；
[0099](3)將預先製備好的裝載不同細胞或同種細胞不同密度的膠原微球(例如實施例1和實施例2)分散於上述中性膠原溶液中；
[0100](4)將上述含微球的膠原溶液轉移至模具，升溫至37°C保持30min即可獲得裝載局部高密度細胞的非勻質膠原水凝膠。
[0101]實施例7
[0102]按以下步驟製備非勻質膠原-透明質酸水凝膠軟骨細胞-骨髓間充質幹細胞共有限接觸培養體系:
[0103](I)用pH為7.4的PBS緩衝液配製馬來酸酐改性的透明質酸溶液，濃度為25mg/mL，加入光引發劑12959至濃度為0.1% ；
[0104](2)將事先準備好的處於指數生長期的軟骨細胞，計數並用MEM培養基配成細胞懸液，再將其加入到ImL上述透明質酸溶液中並分散均勻，使細胞密度為I X 16個/mL ；
[0105](3)將預先製備好的裝載不同骨髓間充質幹細胞密度的微球(例如實施例2的膠原微球和實施例3的透明質酸微球)分散於上述透明質酸溶液中；
[0106](4)將上述含微球的透明質酸溶液轉移至模具,採用波長365nm、光強為30mW/cm2的紫外光輻射90s，即可獲得裝載軟骨細胞和骨髓間充質幹細胞的有限接觸共培養水凝膠體系。
[0107]實施例8
[0108]在實施例1-5中製備的凝膠微球中取至少兩種，共同分散於連續相溶液介質中或共同分散於經改性或經部分凝膠化處理的連續相介質中，再對上述混合體系進行凝膠化處理，可獲得連續相中同時包載多種凝膠微球的非勻質水凝膠。所述凝膠微球可以是有不同材料製成的，也可以包載不同的細胞，也可以具有不同的細胞包載密度。還可以在所述凝膠化處理之前向所述連續相溶液介質或共同分散於經改性或經部分凝膠化處理的連續相介質中加入細胞，獲得連續相中包載了細胞的非勻質水凝膠。
[0109]在該非勻質水凝膠結構中部分水凝膠的改性處理步驟可以與細胞分開，從而避免改性處理過程對細胞的影響，從而可以獲得性能更優異的細胞-水凝膠複合物。
[0110]細胞培養實驗表明，在裝載了多種細胞的非勻質水凝膠中，各種細胞在各自所處區域均能正常生長，狀態良好。
[0111]實施例8
[0112]將上述實施例1、2、6、7、8中獲得的非勻質水凝膠再分散於連續相溶液介質中或共同分散於經改性或經部分凝膠化處理的連續相介質中，再對上述混合體系進行凝膠化處理，可獲得多層非勻質水凝膠。
[0113]實施例9
[0114]傳質性能對比試驗
[0115]以牛血清蛋白(BSA)為模擬物質，安裝本發明實施例1所述的製備方法，在步驟
(I)中的膠原溶液中加入BSA，製備出裝載BSA的膠原微球水凝膠(非勻質水凝膠)，同時採用傳統膠原水凝膠製備方法製備裝載BSA的膠原塊狀水凝膠(BSA與膠原溶液充分混合後進行凝膠化處理得到)。兩種方法均採用相同的膠原濃度、相同的凝膠化溫度、裝載相同濃度的BSA，得到的微球水凝膠和塊狀水凝膠分別浸泡在PBS緩衝液中，間隔若干時間取少量緩衝液檢測其中的蛋白含量，並以此計算水凝膠中BSA的釋放比例。
[0116]傳質實驗對比結果如圖7所示，從中可以發現膠原微球中的BSA比塊狀水凝膠中的BSA釋放的更快，表明微球水凝膠具有更好的傳質效果，能在較短的時間內實現水凝膠內外物質濃度的平衡。
[0117]實施例10
[0118]軟骨細胞體外培養對比試驗
[0119]採用相同濃度的膠原溶液為原料，分別製備裝載有相同密度軟骨細胞的微球水凝膠和塊狀水凝膠，採用相同的體外細胞培養條件，分別在培養3d、7d和14d時對樣品進行雷射共聚焦顯微鏡觀察。
[0120]軟骨細胞體外培養對比試驗結果如圖8所示(上排為塊狀水凝膠，下排為微球水凝膠)，從中可以發現隨著培養時間的延長，膠原微球水凝膠中軟骨細胞的增殖更加明顯，細胞形態和聚集狀態都要比塊狀膠原水凝膠更好，表明膠原微球水凝膠更有利於軟骨細胞的增殖、表型。
[0121]以上所述僅為本發明的優選實施例，對本發明而言僅是說明性的，而非限制性的；本領域普通技術人員理解，在本發明權利要求所限定的精神和範圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發明的保護範圍。
【權利要求】
1.一種細胞-凝膠材料複合微球，其特徵在於，包括凝膠微球和分布在所述凝膠微球內部的細胞。
2.根據權利要求1所述的細胞-凝膠材料複合微球，其特徵在於，所述凝膠微球為球形或接近球形，尺寸分布為30-1000微米。
3.根據權利要求1所述的細胞-凝膠材料複合微球，其特徵在於，構成所述凝膠微球的材料為具有良好生物相容性的環境敏感型的凝膠材料。
4.根據權利要求3所述的細胞-凝膠材料複合微球，其特徵在於，所述環境敏感性凝膠材料為溫敏材料、光敏材料或者離子敏感材料中的至少一種。
5.一種包載細胞的非勻質水凝膠，其特徵在於，包括凝膠化的連續相和如權利要求1所述的細胞-凝膠材料複合微球，所述細胞-凝膠材料複合微球分布在所述凝膠化的連續相中。
6.根據權利要求5所述的非勻質水凝膠，其特徵在於，在所述凝膠化的連續相外圍還包覆有至少一層凝膠化的連續相或者所述凝膠化的連續相作為凝膠單元又分布在另外一層凝膠化的連續相中。
7.—種如權利要求1所述的細胞-凝膠材料複合微球的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: I)製備凝膠材料-細胞混合液；2)將所述凝膠材料-細胞混合液分散於油性溶液，經乳化和凝膠化處理，得到細胞-凝膠材料複合微球。
8.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟I)具體為:將凝膠材料溶液PH調節至6.5-7.5，靜置或離心去泡，得到中性凝膠材料溶液；將經計數的細胞由少量培養基或緩衝液配成細胞懸液，再加入到上述中性凝膠材料溶液中。
9.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟2)具體為:向油性溶液中加入體積百分濃度為09Γ10%的表面活性劑，然後在機械攪拌作用下，加入凝膠材料-細胞混合液，使凝膠材料均勻分散於所述油性溶液中形成油包水的微球，攪拌兩相混合液的同時選擇相應的凝膠條件實現微球的凝膠化。
10.一種權利要求1所述的細胞-凝膠材料複合微球的應用，其特徵在於，將其用於製作仿生組織修復材料或用於多種細胞共培養。
【文檔編號】C12N5/077GK104436306SQ201410632652
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月11日 優先權日:2014年11月11日
【發明者】林海, 劉鈞, 樊渝江, 張興棟 申請人:四川大學