一種固相dna晶片雜交液及雜交方法
2023-05-20 11:57:41
專利名稱：一種固相dna晶片雜交液及雜交方法
技術領域：
本發明涉及一種固相DNA晶片雜交液及簡易雜交方法。
背景技術：
隨著人類基因組(測序)計劃(Human genome project)的逐步實施以及分子生 物學相關學科的迅猛發展，越來越多的動植物、微生物基因組序列得以測定，基因序列數據 正在以前所未有的速度迅速增長。基因晶片(又稱DNA晶片、生物晶片)技術就是順應這 一科學發展要求的產物，它的出現為解決此類問題提供了光輝的前景。基因晶片技術已經 越來越多的應用於基因診斷、分析、以及基因治療等方面。該技術係指將大量(通常每平方 釐米點陣密度高於400)探針分子固定於支持物上後與標記的樣品分子進行雜交，通過檢 測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數量和序列信息。目前已有多種方法 可以將寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。這些方法總體上有兩種，即合成點樣與原位 合成(in situ synthesis)兩種。支持物有多種如玻璃片、矽片等但需經特殊處理。作點 樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸附帶負電荷的探針分子，通常需包被以氨基矽烷 或多聚賴氨酸等。作原位合成的支持物在聚合反應前要先使其表面衍生出羥基或氨基(視 所要固定的分子為核酸或寡肽而定)並與保護基建立共價連接。也有一些探針被固定到一 些微球上，並且在溶液中實現晶片雜交，這種晶片一般叫做液相晶片。基因晶片主要包括四個基本要點晶片方陣的構建、樣品的製備、生物分子反應和 信號的檢測。其中生物分子反應，晶片上的生物分子之間的反應是晶片檢測的關鍵一步。雜 交反應是螢光標記的樣品與晶片上的探針進行的反應產生一系列信息的過程。通過選擇合 適的反應條件使生物分子間反應處於最佳狀況中(如雜交溫度，雜交時間，雜交液的組成 成分等)，減少生物分子之間的錯配比率。寡核苷酸探針與靶分子之間進行生物分子反應一般需要用到雜交液，.Sambrook, E. F. Fritsch,T. Maniatis,Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ed. 2nd, 1989, vol. 1-3，據文獻報導探針的長度， 雜交溫度，以及其他一些因素都會影響到雜交效果的好壞。如果雜交過程在低於DNA分子 的熔解溫度(Tm值)的5-10°C進行時，能夠有效的減少錯配或非Watson/Crick鹼基配對， 加大Watson/Crick鹼基配對的正確率。雜交液通常情況下都包括一種鹽(含單價陽離子的鹽)，金屬離子螯合劑如EDTA、 以及防止非特異性雜交的封閉劑。含單價陽離子的鹽，如SSPE、SSC能使雜交緩衝液的PH 維持在6. 8-8. 5之間。SDS為表面活性劑，鮭魚精DNA和脫脂奶粉均可去除背景信號。一 般情況下雜交緩衝液包含6XSSPE(0. 9M NaCl，60mM磷酸鹽(pH 7.4) ；6mM EDTA)；或者 6X SSC(0. 9M NaCl，90mM 檸檬酸鈉(pH 7. 0)) ,0. 5% w/v sodium dodecyl sulfate (SDS)； 100 μ g/ml鮭魚精DNA，0. 1 %的脫脂奶粉，去除背景信號。基因晶片雜交溫度和時間取決於探針的組成(探針的長度及探針中所包含不同 鹼基的含量)以及目標分子的複雜度，雜交溫度一般在20°C到70°C之間，雜交時間一般在2h到2d之間。低的雜交溫度在20°C到50°C之間(一般情況下在37°C -45°C範圍內)，高 的雜交溫度在50°C到70°C之間(一般情況下在60°C-65°C範圍內)。高的雜交溫度可以 提高Watson/Crick鹼基的配對機率，低的雜交溫度只能通過延長雜交時間來提高Watson/ Crick鹼基配對機率。低的雜交溫度雜交時一般需要過夜雜交或者更長的時間(8h-24h)。 雜交溫度低經常會出現雜交信號不好，背景信號高，雜交結果有斑點等，這就影響了晶片的 品質。這個問題需要通過提高雜交溫度和縮短雜交時間來解決。
發明內容
本發明的目的是提供一種能夠以較低成本，簡單、快速的實現固相DNA晶片雜交 的雜交液及採用此雜交液進行雜交的方法。為了達到上述目的，本發明人經過大量不同類型晶片的雜交試驗得到雜交液成分 及採用此雜交液進行雜交的優選方法。本發明的技術方案如下一種固相DNA晶片雜交液，其特徵在於它是由NaCl，Na-MES，EDTA, SDS原料組成； 其 NaCl 717mM, Na-MES 400mM, EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。本發明採用所述固相DNA晶片雜交液進行雜交的方法，按如下的步驟進行2)當PCR擴增產物用螢光素進行單鏈標記時，PCR標記產物於65°C烘乾；2)用預熱的去離子水回溶標記產物，再加入預熱好的雜交液，充分混勻；3)混合液加入孵育室，孵育溫度為探針Tm-10°C，並封閉好雜交倉，放入水浴鍋 內，溫度控制在50°C -60°C，雜交時間2-6小時；其中雜交時去離子水和雜交液以體積比為 1 1混合溶解產物。本發明對於在PCR擴增的同時進行標記的雜交方法1)當在PCR擴增的同時進行標記時，PCR產物在95°C充分退火；2)退火後的PCR產物迅速放到冰上，放置lOmin，使其淬滅；3)取淬滅後的PCR產物與去離子水和已充分預熱的雜交液混合；其中雜交時去離 子水和雜交液以體積比為11混合溶解產物；4)混合液加入孵育室，封閉好雜交倉，水浴雜交。本發明所涉及雜交液具體的為雜交液包含717mM NaCl,400mM Na-MES(嗎啉乙磺 酸鈉鹽)，100 μ M EDTA，0. 2% (w/v) SDS (十二烷基磺酸鈉)。雜交液保存溫度為-20°C也可 以存放於4°C。本雜交液為2X雜交液，使用時要用去離子水1 1稀釋。雜交液和去離子 水回溶PCR產物前應放於65°C充分預熱。具體的雜交方法為1、在第一次PCR擴增產物基礎上用螢光素進行單鏈標記時的雜交方法1)PCR標記產物於65°C烘乾。2)用10 μ 1預熱的去離子水回溶標記產物，再向其中加入10 μ 1預熱好的雜交液， 充分混勻。3)混合液加入孵育小室並封閉好雜交倉，放入水浴鍋內。步驟3)所述混合液放入水浴鍋中孵育，孵育溫度為探針Tm-10°C，一般在55°C到 70°C之間最為適宜，雜交溫度過高會引起PCR產物蒸乾影響雜交結果，雜交溫度過低會降 低Watson/Crick鹼基配對機率引起錯配。雜交時間一般控制在2_6小時即可。2、在PCR擴增的同時進行標記時的雜交方法
1)PCR產物在95°C充分退火。2)退火後的PCR產物迅速放到冰上，放置lOmin，使其淬滅。3)取適量的淬滅後的PCR產物與合適量的去離子水和10 μ 1已充分預熱的雜交液
混合ο4)混合液加入孵育室，封閉好雜交倉，放入水浴鍋水浴雜交。本發明的固相DNA晶片雜交的雜交液與現有使用的雜交液相比所具有的積極效 果在於(1)本雜交液配方簡單，降低了生產成本且易保存。(2)本發明的方法簡便易行，可以提高雜交溫度，有效地縮短雜交時間。通過使用 本雜交液可以很好的控制雜交時產生的背景值，提高雜交信號，減小背景值對信號值所產 生的幹擾，優化雜交效果。(3)本雜交液的雜交效果與使用商品化的雜交液的雜交效果對比實驗說明利用 本雜交液與商品化雜交液對侵襲性真菌基因晶片，水產品特異基因晶片，奶粉基因晶片及 水產品間區基因晶片進行雜交得到如圖5的雜交對比圖。可以看出在縮短雜交時間的同 時，晶片雜交信號有所增強，背景雜點有所減少。
圖1為侵襲性真菌基因晶片在不同溫度梯度下雜交結果圖，其中圖IA-D分別為 55°C、57°C、59°C、61°C。圖2為侵襲性真菌基因晶片在不同時間梯度下雜交結果圖，其中圖2A-D分別為 2h、4h、6h、8h。圖3A-L為雜交液穩定性及保存條件試驗雜交結果圖，其中A-F中雜交液保存於 4°C，時間依次為一個月到六個月，G-L中雜交液保存於-20°C，時間依次為一個月到六個月。圖4A為侵襲性真菌基因晶片雜交效果圖。圖4B為利用ITS序列檢測水產品中主要致病菌基因晶片雜交效果圖。圖4C為利用特異基因檢測水產品中主要致病菌基因晶片雜交效果圖。圖4D為奶粉基因晶片雜交效果圖。圖4E為致瀉性大腸桿菌基因晶片雜交效果圖。圖5A-D為使用本雜交液的雜交效果與使用商品化的雜交液的雜交效果對比實 驗，其中圖Al、Bi、Cl、Dl為本雜交液雜交效果圖，圖A2、B2、C2、D2為商品化雜交液雜交效果圖。
具體實施例方式下面通過最佳實施例對本發明作進一步的詳細說明。以下實施例僅僅是用於說明 而不是限制本發明，其中所用原料均有市售。實施例1雜交液的組成NaCl717mM,Na-MES 400mM,EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。雜交 液的雜交方法
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1)當PCR擴增產物用螢光素進行單鏈標記時，PCR標記產物於65°C烘乾；2)用10 μ 1預熱的去離子水回溶標記產物，再加入10 μ 1預熱好的雜交液，充分混 勻；3)混合液加入孵育室，雜交溫度溫度為探針Tm-10°C，並封閉好雜交倉，放入水浴 鍋內；溫度控制在50°C，雜交時間6小時。本發明所述的雜交液為2X雜交液，使用時要用去離子水1 1稀釋。其中雜交 液和去離子水回溶PCR產物前應放於65°C充分預熱。雜交液保存溫度為4°C或-20°C。實施例2雜交液的組成:NaCl717mM, Na-MES 400mM, EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。雜交液的雜交方法1)當PCR擴增產物用螢光素進行單鏈標記時，PCR標記產物於65°C烘乾；2)用10 μ 1預熱的去離子水回溶標記產物，再加入10 μ 1預熱好的雜交液，充分混 勻；3)混合液加入孵育室，雜交溫度為探針Tm-10°C，並封閉好雜交倉，放入水浴鍋 內；溫度控制在60°C，雜交時間4小時。本發明所述的雜交液為2X雜交液，使用時要用去離子水1 1稀釋。其中雜交 液和去離子水回溶PCR產物前應放於65°C充分預熱。實施例3雜交液的組成:NaCl717mM, Na-MES 400mM, EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。雜交液的雜交方法1)當在PCR擴增的同時進行標記時PCR產物在95°C充分退火；2)退火後的PCR產物迅速放到冰上，放置lOmin，使其淬滅；3)取淬滅後的PCR產物與10 μ 1去離子水和10 μ 1已充分預熱的雜交液混合；4)混合液加入孵育室，封閉好雜交倉，水浴雜交。本發明所述的雜交液為2Χ雜交液，使用時要用去離子水1 1稀釋，雜交液保存 溫度為4°C或_20°C。實施例4雜交液的實際應用侵襲性真菌基因晶片雜交試驗選取侵襲性真菌基因晶片中的克柔氏念珠菌作為試驗對象。1)按照侵襲性真菌基因晶片所要求的PCR程序和PCR體系擴增靶基因片段。2)利用螢光素cy3-dUTP對第一步PCR產物進行標記。3)標記產物放於65°C烘乾，之後用已經過預熱的去離子水和雜交液各10μ 1回溶。4)將回溶後的產物加入孵育小室中，封閉好雜交倉，放入水浴鍋即可。其中的雜交液組成:NaCl717mM, Na-MES 400mM, EDTA 100 μ Μ, SDS 0. 2% (w/v)。使用侵襲性真菌基因晶片中的克柔氏念珠菌作為對象來研究雜交液的最適雜交 溫度和雜交時間。侵襲性真菌基因晶片中克柔氏念珠菌有五根探針，探針的Tm值均在65°C 左右。選取55°C、57°C、59°C、61°C四個溫度梯度來驗證不同溫度對晶片雜交效果的影響。同時選取2h、4h、6h、8h來驗證不同時間梯度對雜交效果的影響。通過實驗發現在探針Tm值-10°C範圍內雜交效果相差不大，所以選擇較低的雜交 溫度57V。因為當雜交溫度超過60°C以後很容易將PCR產物蒸乾影響雜交結果。雜交時 間選取了四個梯度，通過實驗發現2h時已經可以產生較強的雜交信號，4-8小時雜交效果 相差不大。所以為了更好的實現雜交效果又要儘可能的縮短雜交時間，雜交時間一般選取 2-6小時即可。實施例5利用ITS序列檢測水產品中主要致病菌基因晶片雜交試驗在利用ITS序列檢測水產品中主要致病菌基因晶片檢測範圍中選取金黃色葡萄 球菌作為試驗對象，按照上述實施例3中所述雜交液的雜交方法來進行雜交，得到如圖4B 的雜交效果圖。本晶片雜交溫度為57°C，雜交時間為6h。實施例6利用特異基因檢測水產品中主要病原微生物基因晶片雜交試驗在利用特異基因檢測水產品中主要致病菌基因晶片檢測範圍中選取志賀氏菌作 為試驗對象，按照上述實施例3中所述雜交液的雜交方法來進行雜交，得到如圖4C的雜交 效果圖。本晶片雜交溫度為56°C，雜交時間為5h。實施例7奶粉基因晶片雜交試驗在奶粉基因晶片檢測範圍中選取蠟樣芽胞桿菌作為實驗對象，按照上述實施例 3中所述雜交液的雜交方法來進行雜交，得到如圖4D的雜交效果圖。本晶片雜交溫度為 57°C，雜交時間為6h。實施例8致瀉性大腸基因晶片雜交試驗在致瀉性大腸基因晶片檢測範圍中選擇侵襲性大腸桿菌EIEC作為檢測對象。1)按照致瀉性大腸桿菌基因晶片所要求的PCR程序和PCR體系對本實驗所選取的 靶基因進行擴增。2) PCR 產物在 95 °C 變性。3)變性後的PCR產物迅速放入碎冰中使PCR產物淬火。4)取2μ1 PCR產物與8μ 1去離子水和10μ 1雜交液混勻，將回溶後的產物加 入孵育小室中，封閉好雜交倉，放入水浴鍋即可。圖4Ε為雜交效果圖，本晶片雜交溫度為 60°C，雜交時間1. 5h。
權利要求
一種固相DNA晶片雜交液，其特徵在於它是由NaCl，Na MES，EDTA，SDS原料組成；其NaCl 717mM，Na MES 400mM，EDTA 100μM，SDS 0.2％(w/v)。
2.一種採用權利要求1所述固相DNA晶片雜交液進行雜交的方法，其特徵在於按如下 的步驟進行1)當PCR擴增產物用螢光素進行單鏈標記時，PCR標記產物於65°C烘乾；2)用預熱的去離子水回溶標記產物，再加入預熱好的雜交液，充分混勻；3)混合液加入孵育室，孵育溫度為探針Tm-IOV，並封閉好雜交倉，放入水浴鍋內，溫 度控制在50°C-60°C，雜交時間2-6小時；其中雜交時去離子水和雜交液以體積比為1 1 混合溶解產物。
3.一種採用權利要求1所述固相DNA晶片雜交液進行雜交的方法，其特徵在於按如下 的步驟進行1)當在PCR擴增的同時進行標記時，PCR產物在95°C充分退火；2)退火後的PCR產物迅速放到冰上，放置lOmin，使其淬滅；3)取淬滅後的PCR產物與去離子水和已充分預熱的雜交液混合；其中雜交時去離子水 和雜交液以體積比為11混合溶解產物；4)混合液加入孵育室，封閉好雜交倉，水浴雜交。
4.權利要求3所述的雜交方法，其中的雜交液為2X雜交液，使用時要用去離子水 1 1稀釋。
5.權利要求2所述的雜交方法，其中雜交液和去離子水回溶PCR產物前應放於65°C充 分預熱。
全文摘要
本發明涉及一種固相DNA晶片雜交液及雜交方法。它是由NaCl，Na-MES，EDTA，SDS原料組成；其NaCl 717mm，Na-MES 400mm，EDTA 100μm，SDS 0.2％(w/v)本雜交液主要成分包括NaCl，Na-MES，EDTA，SDS。雜交時只需將標記的PCR產物烘乾，用已預熱好的雜交液與去離子水1∶1混合溶解，然後將其加入孵育室孵育即可。本發明的方法簡便易行，可以提高雜交溫度，有效地縮短雜交時間。通過使用本雜交液可以很好的控制雜交時產生的背景值，提高雜交信號，減小背景值對信號值所產生的幹擾，優化雜交效果。
文檔編號C12Q1/68GK101948922SQ20101028798
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月21日 優先權日2010年9月21日
發明者馮露, 張戀心, 曹勃陽, 李榮榮, 楊磊, 王磊 申請人:天津生物晶片技術有限責任公司