用於從澱粉植物的可溶部分獲得β-澱粉酶製劑的方法
2023-05-20 06:24:41
專利名稱：用於從澱粉植物的可溶部分獲得β-澱粉酶製劑的方法
用於從澱粉植物的可溶部分獲得β-澱粉酶製劑的方法本發明涉及一種用於從來自澱粉工業的殘渣獲得β-澱粉酶製劑的方法。更具體地，本發明涉及一種從澱粉植物的組分(澱粉、蛋白質以及纖維)的溼法提取期間產生的液體殘渣(也稱為「可溶部分」，雖然它們還含有不同且多樣的殘餘不溶物質、顆粒以及膠體)獲得β-澱粉酶製劑的方法。為了本發明的目的，術語「澱粉植物」旨在表示在澱粉工業中能夠被加工的為了從其中提取澱粉的植物，如特別是玉米、馬鈴薯、甘薯、小麥、水稻、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、木薯、 高粱、魔芋、黑麥、蕎麥以及大麥。在一個具體的實施方案中，這些「澱粉植物」包括玉米、馬鈴薯、小麥、水稻、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、木薯、高粱、魔芋以及大麥。本發明還涉及所述方法，該方法包括可溶部分的澄清的一個第一步驟、以及然後任選地一個超濾的第二步驟從而獲得關於β-澱粉酶的純化的(從不含有它的鹽的意義而言)和/或濃縮的製劑。在一個優選的實施方案中，本發明還涉及所述方法，該方法包括可溶部分的澄清的一個第一步驟、一個超濾的第二步驟、以及然後一個滲濾的第三步驟從而獲得關於澱粉酶的純化(從它被排除鹽的意義而言)且濃縮的製劑。最後，本發明使得有可能提供一種β -澱粉酶製劑，它具有一種質量這樣有可能以與純化的β -澱粉酶相同的方式來使用它，特別是用於生產富含麥芽糖的糖漿。澱粉酶是從(α 1 — 4)-連接的葡萄糖聚合物或低聚物的非還原端釋放麥芽糖單元的外水解酶，該反應在遇到的第一個α 1 — 6分支點處停止。在發芽(穀類種子人工發芽)期間，「糖化力」的主要組分(對應於α-澱粉酶、 β-澱粉酶、α-葡萄糖苷酶和脫支酶的結合活性)、以及從這種酶合劑(enzyme cocktail) 中分離的β-澱粉酶活性對於生產麥芽糖或產生自澱粉的其他可發酵糖而言是必需的。如此獲得的麥芽糖和其他可發酵糖旨在用於，例如，經由酵母的乙醇發酵。因此，僅僅β -澱粉酶的糖化活性並用於大量的應用中-在麵包製作中，-在麥芽工業中，-作為一種食品添加劑，或甚至作為一種「消化」劑，-用於生產麥芽糖和富含麥芽糖的糖漿(麥芽糖醇的前體和麥芽糖醇糖漿)，-用於生產增甜劑，-在藥學中，用於生產疫苗。穀類的β -澱粉酶、豆類的β -澱粉酶和塊莖的β -澱粉酶關於它們的酶活性都是類似的。然而，作為用於麥芽工業、或用於其他生物技術方法的澱粉酶的來源，一些澱粉植物優先於其他澱粉植物的事實取決於它們的種子關於β-澱粉酶的豐富度，並且取決於從這些富含多種酶活性的介質中可以分離它們的容易程度。因此，清楚地鑑定了兩種提取β -澱粉酶的來源。第一種提取「常規的」澱粉酶的來源是小麥、大麥或黑麥的胚乳，這是已知用於主要生產大量澱粉酶的一種來源。
提取的第二種來源相應於人工發芽的種子。因此特別是β -澱粉酶的一種人工富集是通過引起發芽來進行的；然後使澱粉酶活性與其他澱粉酶和葡萄糖苷酶活性一起過表達。本發明涉及的技術領域是提取的第一種來源，使得有可能像這樣更有效地以更大的量生產澱粉酶。本發明的技術領域還涉及從澱粉工業中的植物加工所生成的殘餘可溶部分，這些植物如小麥、大麥、黑麥、玉米、高粱、蕎麥、水稻、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、馬鈴薯、 木薯、甘薯或魔芋。β -澱粉酶的第二種來源更具體地旨在用於製備酶合劑。本領域的技術人員已經接受未發芽的大麥、黑麥或小麥種子都是用於大規模商業製備澱粉酶的生物材料的選擇。此外，本領域的技術人員還已知，可以從未發芽的大麥、小麥或黑麥種子中提取的一半的β-澱粉酶可以容易地通過用水和鹽溶液提取以游離酶的形式獲得。另一半部分處於「結合」形式，對於它的提取需要添加還原劑或蛋白酶。不可以直接提取的另一種β-澱粉酶部分被稱為「潛在的」部分，也已經被描述 為了從穀類種子中將它提取，洗滌劑是必需的。而且，根據預期的應用將描述於現有技術中的β -澱粉酶提取方法進行了調整。更具體地，旨在用於澱粉糖化和用於實驗測試的那些澱粉酶是集中地從植物來源 (如大豆、小麥、大麥、燕麥、黑麥和甘薯)中提取的，或者是通過微生物(如多粘芽孢桿菌等)來生產的。在由澱粉製備麥芽糖的情況下，第一種束縛是要儘可能限制其他低聚糖(如葡萄糖和麥芽三糖)的伴隨性產生。第二種束縛在於使用一種基本不含有真菌毒素、鹽和低分子量蛋白質和肽(小於50kDa並且優選小於30kDa)，並且不會引起過敏的(具體是通過在製備方法中重亞硫酸鹽的缺乏)的澱粉酶製劑，以允許富含麥芽糖的糖漿的迅速並且容易的純化(過濾、脫色、脫礦質)以及獲得更穩定的糖漿。在麥芽工業中，例如，已知葡萄糖的存在通過抑制酵母生長而幹擾酵母它們的發酵。為了從麥芽糖糖漿商業生產麥芽糖醇，推薦的是要限制山梨醇和麥芽三糖醇的產生。因此，本領域的技術人員將優選使得有可能獲得儘可能純的β -澱粉酶製劑的方法。當然這些方法將具有昂貴的缺點。因此專利US 3 492 203描述了從麩皮中提取純的β -澱粉酶用於製備富含麥芽糖的糖漿。因此避免了從麥芽(還含有難於從β -澱粉酶中分離的α -澱粉酶)開始的方法。那麼麩皮具有較價廉的優點，並且作為培養基是可回收的，但是特別選擇它是因為它的佔優勢的澱粉酶含量。該方法在於這種情況在20°C與40°C之間的溫度下用水提取純的β -澱粉酶。然而，這一方法使得有可能從麩皮中僅僅有效地回收一半的可獲得的β-澱粉酶。而且，這種方法的主要缺點是它提供了一種細菌學不穩定的澱粉酶因此，生產的澱粉酶必須即時用於糖化澱粉。未進行巴斯德滅菌。
在專利US 3 801 462中，β -澱粉酶是從甘薯，更具體地是從在銼磨甘薯的步驟之後的洗滌水中提取的。該實際的提取方法由在ρΗ 4-4. 5的處理以及處於沉澱物形式的β -澱粉酶的回收組成。當溫度被調整至55°C時提取率更高。然而，α -澱粉酶和麥芽糖酶活性仍汙染這個富集β -澱粉酶的部分，這當然使得獲得一種純的製劑變得複雜。專利US 4 675 296提出了通過一種用水提取的方法(在5°C與50°C之間的溫度， 持續5至70h)用於製備商品澱粉酶的一種方法，但是這需要從完整的或部分脫殼的大麥粒開始。所述方法是難於實現的，因為它是基於使用穀粒的表面作為一種會阻留所述穀粒的除了澱粉酶之外的所有組分的半透膜。然而，添加一種還原劑以促進β -澱粉酶的釋放是有用的，所述還原劑是基於二氧化硫或硫酸的。而且，推薦用鹽、多元醇、糖或酸來穩定該酶。在文獻中的其他方法推薦使用酶以促進β -澱粉酶的提取。因此在國際專利申請WO 02/06四80中，在具有纖維素酶、半纖維素酶和β-葡聚糖酶活性的多種酶的複方合劑的存在的條件下，在一種水性介質中從穀類提取了 β -澱粉酶。所獲得的提取物必須被精細地純化以分離因此從反應混合物中回收的澱粉酶。選擇的穀類是大麥和小麥。在還原條件下(含有亞硫酸鹽的水)，以明確定義的比例，在清楚設定的溫度和反應時間範圍的條件下，並且在PH 6. 5下進行提取。在US 3 769 168中，富集β -澱粉酶的提取物的純化途徑是優選的。用一種膨潤土或高嶺土型吸附劑處理從麩皮、從大豆或從甘薯製備的粗提取物。吸附這些β-澱粉酶然後使用一種具有大於0.5 μ的離子強度以及超過5的ρΗ 值的溶液洗脫。根據上述內容，對於提供一種簡單並且相對價廉的用於獲得β -澱粉酶製劑的方法仍有未滿足的需要，這些製劑具有足夠的質量以允許特別是富含麥芽糖的糖漿的有效生產。因此，本發明的目的是要滿足這一需要，並且值得稱道的是，在很多研究之後，本申請公司已經發現這一目標可以針對所有預期而達到，只要使用來自澱粉工業的殘渣，特別是來自澱粉工業的液體殘渣(也稱為「可溶部分」，雖然它們仍然含有不同且多樣的殘餘不溶物質、顆粒以及膠體)。更具體地，用於獲得根據本發明的β -澱粉酶製劑的方法在於選擇是β -澱粉酶的來源的介質、在于澄清所述介質、進而任選地在於進行超濾以回收或甚至濃縮它們所包含的β-澱粉酶，這些介質來自下組，該組由以下各項組成小麥、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻、大麥、黑麥、蕎麥、甘薯以及馬鈴薯的可溶部分，優選小麥、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻、大麥以及馬鈴薯的可溶部分，更優選小麥和大麥的可溶部分。優選地，用於獲得根據本發明的β -澱粉酶製劑的方法在於選擇是β -澱粉酶的來源的介質、在于澄清所述介質、進而在於進行超濾和滲濾以回收並且濃縮它們所包含的β-澱粉酶，這些介質來自下組，該組由以下各項組成小麥、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻、大麥、黑麥、蕎麥、馬鈴薯以及甘薯的可溶部分，優選小麥和大麥的可溶部分。在用於獲得根據本發明的β -澱粉酶製劑的方法中，不進行PH值校正，該ρΗ值天然地約為4. 5。值得稱道的是，本申請公司已經發現，來自在除了發酵(作為氮源)的領域或動物營養(與產生自小麥的產物混合)的領域之外的領域中的開發很差的澱粉工業的這些殘渣可以構成一種選擇的介質，用於以足以用於目標應用(例如製備富含麥芽糖的糖漿)的質量水平來容易地提取感興趣的酶(並且更具體是β-澱粉酶)。根據本發明的方法的特徵在於a)澱粉植物的可溶部分是選自下組，該組由以下各項組成小麥、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻、大麥、黑麥、蕎麥、甘薯以及馬鈴薯，優選小麥、馬鈴薯、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻以及大麥，並且更優選小麥和大麥的可溶部分，b)以這樣一種方式進行所述可溶部分的澄清，以從中除去不溶物質和膠體，c)任選地，以這樣一種方式進行所述澄清的可溶部分的超濾，以獲得含有濃縮的 β-澱粉酶和超濾滲透物的超濾滲餘物，d)回收生成的濃縮的β-澱粉酶。優選地，根據本發明的方法的特徵在於a)澱粉植物的可溶部分是選自下組，該組由以下各項組成小麥、馬鈴薯、豌豆、 蠶豆、馬蠶豆、水稻、大麥、黑麥、蕎麥以及甘薯，並且優選小麥和大麥的可溶部分，b)以這樣一種方式進行所述可溶部分的澄清，以從中特別地除去不溶物質、膠體和微生物材料，c)以這樣一種方式進行所述澄清的可溶部分的超濾，以獲得含有濃縮的β -澱粉酶和超濾滲透物的超濾滲餘物(也稱為濾液)，d)進行含有濃縮的β -澱粉酶的所述超濾滲餘物的滲濾，e)回收生成的濃縮的β-澱粉酶。該超濾滲透物還可以與步驟b)的不溶物質和膠體混合。因此根據本發明的方法只涉及物理提取技術的組合，例如過濾或離心技術，並且並不涉及任何酶提取步驟。因此不需要含有纖維素酶、半纖維素酶和/或葡聚糖酶的酶合劑。也不需要進行PH校正。根據本發明的方法的第一步驟在於選擇澱粉植物的可溶部分，這些可溶部分來自下組，該組由以下各項組成小麥、馬鈴薯、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻、大麥、黑麥、蕎麥以及甘薯，優選小麥、馬鈴薯、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻以及大麥，並且更優選小麥和大麥的可溶部分。在本發明中，術語「可溶部分」旨在表示在澱粉植物的貴重組分的溼法提取期間所產生的殘留水。術語「貴重組分」在這裡旨在表示在常規澱粉工業(並且特別是根據該澱粉植物)中開發的組分澱粉(無論它是哪一種澱粉)、蛋白質、纖維、膠質。因此根據本發明的所述可溶部分不包括，或基本不包括這些貴重組分。出於這個原因，這些可溶部分也稱為殘留水或可替代地稱為液體殘餘物。小麥的可溶部分或小麥可溶物，例如源自在溼小麥澱粉工業方法中，從澱粉的分離產生的小麥「B」澱粉分離流。B-澱粉或第二澱粉是實質上由優勢比例的小澱粉顆粒或損壞的顆粒組成的澱粉。根據本發明，由澱粉精煉水組成的小麥可溶物通常具有5%的乾物質，特別是小於8%的乾物質。通過回收在澱粉提取的開始從塊莖破碎所產生的可溶部分而獲得馬鈴薯、甘薯或木薯的可溶部分，或馬鈴薯、甘薯或木薯可溶物。豌豆的可溶部分或豌豆可溶物從豌豆浸漬水產生並且是在破碎和分離不同的豌豆組分之前回收的。蠶豆的可溶部分或蠶豆可溶物從蠶豆浸漬水產生並且是在破碎和分離不同的蠶豆組分之前回收的。馬蠶豆的可溶部分或馬蠶豆可溶物從馬蠶豆浸漬水產生並且是在破碎和分離不同的馬蠶豆組分之前回收的。水稻的可溶部分或水稻可溶物從水稻浸漬水產生並且是在破碎和分離不同的水稻組分之前回收的。大麥、黑麥或蕎麥的可溶部分，或大麥、黑麥或蕎麥可溶物從「B」-澱粉分離流產生，該分離流從在大麥澱粉工業方法中的澱粉分離產生。B-澱粉或第二澱粉是實質上由優勢比例的小澱粉顆粒或損壞的顆粒組成的澱粉。這些可溶部分還含有高分子量蛋白質，其中的一些具有感興趣的酶活性，但是它們與所有類型的不溶碎片(特別是纖維、痕量的澱粉、等)、膠體物質(特別是磷脂、糖蛋白、 胚乳的外層細胞(也稱為糊粉層)、等)以及微生物材料(微生物、細菌、等)相混雜。本申請公司確實面臨直到現在所描述的現有技術的偏見，這些可溶部分由本領域的技術人員僅僅使用在具有低附加值的兩個應用領域中- 一種在發酵中的氮源，在蛋白酶處理之後，已經使殘餘高分子量蛋白組分可被微生物同化，-家畜動物的營養源，並且進一步與纖維物質(例如在小麥可溶物的情況下的麩皮)一起添加。因此根據本發明的方法的第二個步驟在於以這樣一種方式進行所述可溶部分的澄清的步驟，以從中除去不溶物質和膠體。通過在每次進行了處理之後測量溶液的濁度來驗證這一澄清步驟。濁度表示就使它渾濁的物質而言的液體的含量。它是由吸收、散射和/或反射光的膠體顆粒引起的。使用實驗室比濁計(或濁度計)進行濁度測量。這一方法被標準化(NF EN ISO 7027)；使用福爾馬胼的兩個濁度測量單位作為標準品。-FNU (福爾馬胼濁度單位)，或NFU被使用於2001年12月20日的法令號 2001-1220中。這種單位度量了在波長860nm處在90°的角度的濁度。-FAU(福爾馬胼衰減單位)度量透射光(180° )。環境保護局(EPA-USA)推薦的濁度單位是NTU(比濁法濁度單位)。該測量是在以 90°散射的但是在不同於860nm的波長下的光中進行的。關於酶活性的測量，它在於測定糖化澱粉酶(diastase)活性，是一種常規用於測定大麥芽或其他酶製劑的澱粉酶活性的測量(參考文章DIASTASE ACTIVITY-DIASTATICPOffER-Food Chemical Codex6 的 General Tests and Assay/Appendix 部分 V/pp 1117-1118)。糖化澱粉酶活性表示為糖化力的度數(° DP)，定義為當在20°C下將所述樣品置於IOOml的底物中持續1 h時，足以還原5ml的費林液體(Fehling liquor)的包含在0. 5ml 5%酶製劑的樣品溶液中的酶的量。由於糖化力使得有可能測量所有澱粉酶類型的酶活性，本申請公司藉助其他的更特異的酶法(例如使用對於α -澱粉酶特異的Megazyme測定試劑盒，由Ceralpha Method 銷售)證實根據本發明的澱粉酶製劑不含有其他汙染活性。同樣地，如同將要在下文中例證的那樣，在實驗室中使用根據本發明的酶製劑的糖化作用測試顯示出高麥芽糖含量，而沒有任何葡萄糖的顯著存在。可以以三種不同的方式來進行根據本發明的方法的澄清的該第一個步驟1)在根據本發明的方法的一個第一實施方案中，這些可溶部分的澄清是藉助於選自下組的技術通過過濾來進行的，該組由以下各項組成前置過濾、加壓過濾以及真空過濾ο開始的可溶部分具有高濁度，不能測量給予它們高負載的膠體顆粒和剩餘不溶物的該濁度。在使用加壓過濾器的情況下，使這些可溶部分通過這個預加載有微晶纖維素的過濾器。根據所使用的纖維素的類型，出自該過濾器的產物於是具有約20至60NTU的濁度。在真空過濾的情況下，本申請公司推薦使用帶式過濾器或旋轉濾器進行過濾。例如，使用在真空下的預加載有一層纖維素的預備層過濾器。2)在根據本發明的方法的一個第二實施方案中，這些可溶部分的澄清是通過離心來進行的。根據離心沉澱的流速和濃度，來自該可溶物的離心的上清液於是也具有20至 60NTU的濁度(離心機的加速度越高，存在於該上清液中的產物的濁度就越低)。更具體地，本申請公司推薦使用以下設備進行這個離心步驟-一臺Ν47自動清洗或噴嘴分離器型盤式離心機，或-一臺BTUX高性能渦旋噴嘴分離器型盤式離心機(這兩種類型的離心機ΝΑ7或 BTUX分別由Westfalia和AlfaLaval公司銷售)。但是任選地在離心之後，為了儘可能減少可溶部分的加載，可能是有用的是進行一個額外的「安全」過濾。所選擇的過濾器是一臺Padovan 水平板式加壓過濾器。該過濾器加載有具有細粒度的纖維素的一個預備層。於是將過濾的這些可溶部分加入(通過用纖維素或多或少地大量注滿)。該濾液的濁度因此下降到在5與10NTU之間的一個值。3)在根據本發明的方法的一個第三實施方案中，可溶部分的澄清是通過切向膜過濾來進行的。更具體地，本申請公司推薦通過用多層膜(例如陶瓷膜，具有從0. 1至Iym的孔隙率)的切向微孔過濾來進行該膜過濾。在這種情況下的滲透物有利地具有一個約ONTU的濁度。然而，這種技術會導致吸附到這些膜上的β-澱粉酶的損失。然而，相對於最初存在於這些可溶部分中的量，這個損失是可以忽略的。根據本發明的方法的這個澄清步驟可以由這三種實施方案中的任何一種組成 (過濾、離心或切向膜過濾)，或者由這三種實施方案中的兩種或三種的任何組合組成。任選地，可以在這個澄清步驟之前通過任何本領域的技術人員已知的技術進行一個絮凝這些膠體顆粒的步驟，而且，如同將在下文舉例說明。為了得到一種不含有汙染性殘餘鹽的製劑並且濃縮所述關於β -澱粉酶的製劑， 以這樣一種方式進行所述澄清的可溶部分的超濾以獲得含有β-澱粉酶和一種超濾滲透物的超濾滲餘物。然後以這樣一種方式以恆定的體積透析該超濾滲餘物以降低在所述滲餘物中雜質的濃度。更具體地，本申請公司推薦使用具有從10 OOODa至50 OOODa的截斷閾值(優選具有30 OOODa(也用30kDa表示)的截斷閾值)的膜進行該超濾。在配備有在盒式超濾器(cassette)中的實驗室規模的具有30 OOODa截斷閾值的聚磺酸化膜(polysulfonated membrane)以及中試規模(pilot scale)的具有 30 OOODa 截斷閾值的聚磺酸化螺旋膜的模塊上超濾這些可溶部分。隨著體積濃縮因子(VCF)的增加，在該滲餘物中的酶變得濃縮。對於十升的定量測定為22° DP/ml的起始溶液，對於VCF為5時，獲得兩升 110° DP/ml的滲餘物和八升不具有糖化力的滲透物。依照根據本發明的方法，以恆定的體積滲濾該超濾滲餘物。這是因為具有高純度的大分子的獲得需要實行這樣一個滲濾步驟以便使得不被膜阻留的溶質從該超濾滲餘物中去除(通過稀釋和滲透)。根據本發明的方法的最後步驟可以在於將該超濾滲透物與步驟b)的不溶物和膠體混合。使這種混合物與來自澱粉工業的未處理的可溶部分再結合。如將被舉例說明的那樣，並且令人驚訝和出乎意料地的是，如此製備的製劑具有這樣一種品質，使得有可能照原樣作為旨在用於製備富含麥芽糖糖漿的酶的來源而使用它，無需額外的處理。實例1 從小麥可溶物中獲得一種β -澱粉酶的第一製劑-實驗室規模在從小麥製造澱粉的過程中，在可溶物蒸發器的入口處收集了 60升的可溶部分， 在濃縮後按慣例進行用於家畜飼料的一個步驟，由本申請公司以名稱Corami 銷售。這些可溶部分具有的pH值為4並且β -澱粉酶活性為約25° DP/ml。在一臺由Westfalia公司銷售的SAl除渣式盤式離心機中，以40升/小時的流速離心這些60升的可溶部分。從離心回收45升的上清液。測量的濁度為60NTU。然後在一臺56cm2 的 Choquenet 實驗室箱板過濾器(chamber sheetfilter)、一臺預加載有 Clar-O-Cel 13/6 (CECA)和 Vitacel LlO (J. Rettenmaier und S6hne )纖維素的布過濾器上將它們過濾。用這些纖維素以lg/Ι的速率還進行連續注滿。回收40升具有8NTU的濁度和22° DP/ml的β -澱粉酶活性的濾液。然後在具有多層0. ISm2的膜的微孔實驗室模塊上將該濾液進行超濾。回收39. 5升的超濾濾液以及在因子為75的情況下的濃縮的滲餘物，具有在1500
9與1600° DP/ml之間的β -澱粉酶活性。用2. 5倍體積的水以這樣一種方式以恆定的體積連續透析該超濾滲餘物，使得在因子為10的情況下降低這些可溶物的雜質的濃度。然後在+4°C下儲存生成的β -澱粉酶製劑。實例2 從小麥可溶物獲得一種β -澱粉酶的第一製劑-用絮凝劑的實驗室規模在從小麥製造澱粉的過程中，在可溶物蒸發器的入口處收集了 ρΗ值為4. 3的120 升的可溶部分。然後用20ppm的!^e3+和25ppm的聚合Flopam AN 923PWG陰離子絮凝劑(SNF)以這樣一種方式將它們進行處理以絮凝這些不溶性顆粒和膠體顆粒。然後在實例1的條件下以40升/小時的流速離心如此處理的這些可溶部分。獲得90升的如此離心的可溶部分。它們具有約17NTU的濁度以及21° DP/ml的 β-澱粉酶活性。以與實例1相同的方式，使這個部分在一臺箱板過濾器上經受精濾。獲得80升的具有5NTU濁度的過濾溶液。然後在具有0. ISm2的具有30kDa的截斷閾值的膜的微孔實驗室模塊上進行超濾。回收79升的超濾濾液以及在因子為80的情況下的濃縮的滲餘物，具有在1500與 1600° DP/ml之間的β -澱粉酶活性。用2. 5倍體積的水以這樣一種方式以恆定的體積連續透析該超濾滲餘物，使得在因子為10的情況下降低這些可溶物的雜質的濃度。然後在+4°C下儲存生成的β -澱粉酶製劑。實例3 從小麥可溶物中獲得一種β -澱粉酶的第一製劑-中試規模中試由在其中如實例2中收集和製備的IOm3的小麥可溶部分的測試組成。通過在一臺ΝΑ7離心機上以自淨操作方式離心，去除這些不溶顆粒和膠體顆粒。回收7m3的具有22NTU的濁度的上清液。隨後在一臺加載有預定義的纖維素的0. 3m2 AMAFILTER過濾器上通過前置過濾對這種上清液進行過濾。用ig/ι的纖維素將其注滿。一經過濾，該溶液具有5NTU的濁度。在一臺由具有30kDa的截斷閾值的聚磺酸化螺旋膜組成的設備上進行超濾。於是獲得了 75升的在因子約為95的情況下濃縮的並且具有約2000° DP/ml的 β-澱粉酶活性的滲餘物。用2. 5倍體積的水以這樣一種方式以恆定的體積連續透析該超濾滲餘物，使得在因子為10的情況下降低這些可溶物的雜質的濃度。為了使酶穩定，加入50kg由本申請公司以商標\6080比@銷售的、含有99.5%的乾物質的山梨糖醇粉末。最終的製劑具有1550° DP/ml的β -澱粉酶活性。實例4 從大麥可溶物中獲得β -澱粉酶製劑將IOOkg的大麥粉和72升的水加入到一臺捏合機中從而獲得一種硬麵團。在環境溫度下靜置30分鐘之後，在由本申請公司製造的旋轉篩中以逆流的方式用水洗滌該麵團，從而將澱粉從麩質中分離出。
收集200升的澱粉懸浮液，並且在一個100 μ m的第一振動篩上進行篩分，然後在 63 μ m的第二振動篩上進行篩分，以去除纖維、膠質以及殘餘麩質。然後在一臺在名稱SEDICANTER下以商標FL0TTWEG銷售的沉降式離心機上以高流速O001/h)以這樣一種方式離心該濾液，以分離在濃縮物中的A-澱粉(大顆粒)和在上清液中的B-澱粉(小顆粒)。在SAl盤式除渣式分離機(WESTFALIA)上以減小的流速001/h)以這樣一種方式再次離心B-澱粉懸浮液溢流，以分離在濃縮物中的B-澱粉以及在上清液中的可溶部分。pH 值為4.5。所有這些現有步驟使得有可能獲得一種根據本發明的可溶部分，即不含有貴重組分，特別是不含有澱粉(無論它是哪一種澱粉)、蛋白質、纖維和膠質。取60升的具有 120NTU的濁度的所述可溶部分。根據實例號2的絮凝方法處理該可溶部分。在一臺前述的除渣離心機上以401/h的流速進行離心，並且回收40升的具有 28° DP/ml的β -澱粉酶活性和2INTU的濁度的可溶部分。在一臺預加載有Clar-O-Cel 13/6 (CECA)和 Vitacel LlO (J. Rettenmaier und S6hne)纖維素的箱板過濾器上將這個可溶部分進行過濾。用lg/Ι的纖維素將該可溶部分注滿。獲得40升具有6NTU的濁度和27° DP/ml的β -澱粉酶活性的濾液。如在實例2中所述，在一臺具有0. 18m2的30KDa膜的微孔實驗室模塊上進行超濾。在約為65的因子的情況下進行濃縮。最後獲得0. 6升的具有1700° DP/ml的β -澱粉酶活性的濃縮酶溶液。用2. 5倍體積的水以這樣一種方式以恆定的體積連續透析該超濾滲餘物，使得在因子為10的情況下降低這些可溶物的雜質的濃度。用400g的由本申請公司以商標Neosorb 銷售的、含有99. 5%的乾物質的山梨糖
醇粉末來將其穩定化。於是該酶製劑具有1400° DP/ml的β -澱粉酶活性。實例5 獲得富含麥芽糖的糖漿，使用商購的純化β -澱粉酶作為對照a)單獨通過β -澱粉酶的作用獲得麥芽糖糖漿在實驗室中使用從GENENC0R公司(0PTIMALT BBA)商購的純化β -澱粉酶以及使用根據實例1製備的依照本發明的澱粉酶製劑進行糖化的比較。將處於4%。的濃度的β-澱粉酶(基於幹澱粉的商購的酶)添加到一種含有30% 的乾物質的液化澱粉的溶液中，該溶液具有為6的葡萄糖當量水平(具有DE6的麥芽糊精的溶出度)。有意調高該劑量以檢測可能存在的寄生酶活性(parasiticenzymatic activity)。在58°C的溫度和pH值5的條件下進行該反應M小時。該結果表示為由β -澱粉酶作用產生的葡萄糖單體和低聚物的％，低聚物具有等於2以及更大的聚合度(通過鈉型高壓液相色譜法測定)。DP2對應於麥芽糖，DPl對應於葡萄糖並且DP3對應於麥芽三糖。
權利要求
1.一種用於從澱粉植物的可溶部分獲得β-澱粉酶製劑的方法，其特徵在於a)澱粉植物的可溶部分是選自下組，該組由以下各項組成小麥、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、 水稻、大麥、黑麥、蕎麥、甘薯以及馬鈴薯，並且優選小麥和大麥的可溶部分，b)以這樣一種方式進行所述可溶部分的澄清，以從中除去不溶物質和膠體，c)任選地，以這樣一種方式進行所述澄清的可溶部分的超濾，以獲得含有濃縮的 β-澱粉酶和超濾滲透物的超濾滲餘物，d)回收生成的濃縮的澱粉酶。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於進行步驟c)，以及在步驟c)和d)之間，進行含有濃縮的β-澱粉酶的所述超濾滲餘物的滲濾。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於這些可溶物的澄清是藉助於選自下組的技術通過過濾來進行的，該組由以下各項組成前置過濾、加壓過濾以及真空過濾。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於該真空過濾是使用帶式過濾器或旋轉過濾器來進行的。
5.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於該澄清是通過離心來進行的。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於該離心是使用自淨型或噴嘴分離器型盤式離心機、或高性能渦旋噴嘴分離器型盤式離心機來進行的。
7.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於該澄清是通過切向膜過濾來進行的。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於該切向膜過濾是一種具有在0.1與Ιμπι之間的截斷閾值的微孔過濾。
9.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於該超濾是使用具有從10OOODa至50 OOODa、優選具有30 OOODa的截斷閾值的膜來進行的。
10.根據如權利要求1至9的任何一項所述的方法獲得的β-澱粉酶製劑用於製備富含麥芽糖的糖漿的用途。
全文摘要
本發明涉及一種用於從澱粉植物的可溶部分獲得β-澱粉酶製劑的方法，其特徵在於澱粉植物的可溶部分是選自下組，該組由以下各項組成小麥、豌豆、蠶豆、馬蠶豆、水稻、大麥、黑麥、蕎麥、馬鈴薯以及甘薯，並且優選小麥和大麥的可溶部分，以這樣一種方式進行所述可溶部分的澄清以從中除去不溶物質和膠體，以及任選地，以這樣一種方式進行所述澄清的可溶部分的超濾以獲得含有濃縮的β-澱粉酶和超濾滲透物的超濾滲餘物，滲濾所述含有濃縮的β-澱粉酶的超濾滲餘物並且回收生成的β-澱粉酶。
文檔編號C07K1/14GK102378764SQ201080014957
公開日2012年3月14日 申請日期2010年3月30日 優先權日2009年3月30日
發明者文森特·科爾博伊斯, 皮耶裡克·杜夫洛特, 達米恩·帕賽 申請人:羅蓋特兄弟公司