檢測己烷雌酚的免疫膠體金試劑及製備方法
2023-05-19 19:58:11
專利名稱：檢測己烷雌酚的免疫膠體金試劑及製備方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測抗體的免疫膠體金試劑，還涉及該試劑的製備方法。
背景技術：
現有用於檢測己烷雌酚的方法主要有酶聯免疫吸附(EIA)、放射免疫試驗(RIA)、免疫親和色譜(IAC)、氣/質聯用分析法。酶聯免疫吸附(EIA)方法的缺陷是需要專門的儀器設備如酶標儀來配合使用；檢測操作人員需要經過專業培訓；操作過程相對比較複雜，檢測所需時間比較長；檢測所需費用較高，不能實現單人份檢測。放射免疫試驗的缺陷是需要專業的儀器設備輔助，且設備昂貴；操作人員需要經過專業培訓；操作過程複雜，要求高；試劑需要低溫保存；由於試驗涉及到放射性同位素，試驗不是很安全，所以很少採用；檢測費用較高；檢測所需時間長。免疫親和色譜(IAC)的缺陷是需要製備專門的免疫親和色譜柱；操作人員需要經過專業培訓；操作過程複雜，要求高；檢測費用高；檢測所需時間長；主要用於樣品處理，在殘留分析中的應用和研究尚處於探索階段。氣/質聯用分析法的缺陷是需要專業的儀器設備輔助，且設備昂貴；樣品的預處理程序繁瑣，要求高；對操作時使用的水及各種溶劑有著嚴格的要求；操作過程複雜，時間長；需要經過專業培訓的技術人員操作，操作人員要有豐富的相關經驗；操作人員必須了解影響色譜分析的各種幹擾因素，了解所使用的預處理方法的優缺點，才能獲得可靠的分析結果；需要昂貴的儀器設備輔助，難以在城市及中小企業中普及；儀器保養的要求高，保養的好壞直接影響分析結果的準確性；檢測費用高。
發明內容
本發明的目的是為了克服當前技術在推廣使用中存在的缺陷，提供一種不需要特定儀器設備輔助的檢測試劑，並且能有效地降低檢測成本，減輕需檢測單位的負擔。同時提供該試劑的製備方法。
檢測己烷雌酚的免疫膠體金試劑及製備方法，該試劑包括樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、結合墊，中間粘附硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。膠體金結合墊上包被了抗己烷雌酚特異性單克隆抗體--膠體金標記物。硝酸纖維素膜上包被了己烷雌酚-BSA偶聯物和羊(兔)抗鼠IgG。
該試劑的製備方法包括以下步驟(1)製備己烷雌酚-BSA偶聯物將己烷雌酚與BSA按1∶5～50(mol/mol)比例混勻，使己烷雌酚與BSA形成穩定的顆粒，通過純化形成己烷雌酚-BSA偶聯物；(2)製備抗己烷雌酚特異性單克隆抗體用己烷雌酚-BSA偶聯物多次免疫Balb/c純系小鼠，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞在體外融合形成雜交瘤細胞，經選擇性培養基篩選可得陽性雜交瘤細胞株。通過將雜交瘤注入小鼠腹腔獲取腹水或體外細胞培養收集培養上清液等方式，大量製備抗己烷雌酚特異性單克隆抗體；(3)製備羊(兔)抗鼠IgG用己烷雌酚-BSA多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊或家兔，純化後得羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。(4)製備膠體金用檸檬酸三鈉等還原劑將氯金酸還原成20nm～40nm的膠體金顆粒；(5)製備單克隆抗體膠體金標記將膠體金與抗己烷雌酚特異性單克隆抗體按1∶0.005～0.015(ml/mg)比例混勻，使膠體金與抗己烷雌酚特異性單克隆抗體形成穩定的膠體顆粒，通過純化、濃縮形成抗己烷雌酚特異性單克隆抗體—膠體金標記物；(6)將抗己烷雌酚特異性單克隆抗體--膠體金標記物包被在膠體金結合墊上，將己烷雌酚-BSA偶聯物和羊(兔)抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜的檢測區和控制區，充分乾燥。
本發明的積極效果在於價格低廉，生產流程簡單，成本低，檢測的費用比使用其它檢測方法都要便宜得多；檢測速度快，全過程只需15-30分鐘，可以實現自我檢測；可以現場檢測；特異性好、靈敏度高、重複性好；操作簡便，快速定性，結果準確、快速，操作簡便，無需衝洗過程和標準對照，可分批或單個樣品及時檢測；易於推廣使用，操作人員無需專業培訓，按說明書即可完成操作。
具體實施例方式
將PVC背襯一端依次粘附樣品墊、膠體金結合墊，中間粘附硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊。膠體金結合墊上包被了抗己烷雌酚特異性單克隆抗體--膠體金標記物。硝酸纖維素膜上包被了己烷雌酚-BSA偶聯物和羊(兔)抗鼠IgG。
按以下步驟製備(1)製備己烷雌酚-BSA偶聯物將己烷雌酚與BSA按1∶5～50(mol/mol)比例混勻，使己烷雌酚與BSA形成穩定的顆粒，通過純化形成己烷雌酚-BSA偶聯物；(2)製備抗己烷雌酚特異性單克隆抗體；用己烷雌酚-BSA偶聯物多次免疫Balb/c純系小鼠，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞在體外融合形成雜交瘤細胞，經選擇性培養基篩選可得陽性雜交瘤細胞株。通過將雜交瘤注入小鼠腹腔獲取腹水或體外細胞培養收集培養上清液等方式，大量製備抗己烷雌酚特異性單克隆抗體；(3)製備羊(兔)抗鼠IgG用己烷雌酚-BSA多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊或家兔，純化後得羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。(4)製備膠體金將100ml 0.01％氯化金用0.9ml 1％檸檬酸三鈉還原成40nm大小的顆粒；(5)製備單克隆抗體膠體金標記用0.1mol/L K2CO3將膠體金溶液的pH值調至8.1左右，將膠體金溶液與單克隆抗體按100ml膠體金溶液中加入1mg單克隆抗體的比例混合均勻，使膠體金與抗體形成穩定的膠體金複合物，再通過多次離心、棄上清、清洗，通過純化、濃縮形成抗己烷雌酚特異性單克隆抗體—膠體金標記物，冷藏備用；(6)用Biodot點膜機將抗己烷雌酚特異性單克隆抗體--膠體金標記物包被在膠體金結合墊上，將己烷雌酚-BSA偶聯物和羊(兔)抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜的檢測區和控制區，充分乾燥。(7)將硝酸纖維素膜、膠體金結合墊、樣品墊、吸水墊等依次粘在PVC背襯上；(8)將粘好的PVC材料切成一定寬度的試劑條，即製成檢測己烷雌酚的免疫膠體金試劑。
在檢測前先將樣本和試劑條(板)放在室溫條件下放置一段時間(約10分鐘)，使其恢復至室溫；從鋁箔袋中取出檢測試劑條，按MARK線下箭頭所示的方向將試劑條浸入樣本溶液中，液面不得超過MARK線，5秒-8秒後取出，平放在操作臺上；如果是試劑板從鋁箔袋中取出檢測試劑板，平放在操作臺上，往加樣孔中滴加3滴(約120ul)樣品溶液；3分鐘-15分鐘內即可判斷結果，30分鐘後判斷的結果為無效。結果判斷如果樣品中有要檢測的「己烷雌酚」存在，則檢測線處不出現條帶，而質控線上出現紅色條帶，此時結果為陽性；如果樣品中沒有要檢測的「己烷雌酚」存在，則檢測線處有紅色條帶出現，同時質控線上也出現紅色條帶，此時結果為陰性。如果質控線上沒有紅色條帶出現，則該產品無效。
權利要求
1.檢測己烷雌酚的免疫膠體金試劑及製備方法，該試劑包括樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、膠體金結合墊，中間粘附硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊，其特徵在於膠體金結合墊上包被了抗己烷雌酚特異性單克隆抗體—膠體金標記物，硝酸纖維素膜上包被了己烷雌酚-BSA偶聯物和羊(兔)抗鼠IgG。
2.根據權利要求1所述的檢測己烷雌酚的免疫膠體金試劑及製備方法，其特徵在於該試劑的製備方法包括以下步驟(1)製備己烷雌酚-BSA偶聯物將己烷雌酚與BSA按1∶5～50(mol/mol)比例混勻，使己烷雌酚與BSA形成穩定的顆粒，通過純化形成己烷雌酚-BSA偶聯物；(2)製備抗己烷雌酚特異性單克隆抗體用己烷雌酚-BSA偶聯物多次免疫Balb/c純系小鼠，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞在體外融合形成雜交瘤細胞，經選擇性培養基篩選可得陽性雜交瘤細胞株。通過將雜交瘤注入小鼠腹腔獲取腹水或體外細胞培養收集培養上清液等方式，大量製備抗己烷雌酚特異性單克隆抗體；(3)製備羊(兔)抗鼠IgG用己烷雌酚-BSA多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊或家兔，純化後得羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。(4)製備膠體金用檸檬酸三鈉等還原劑將氯金酸還原成20nm～40nm的膠體金顆粒；(5)製備單克隆抗體膠體金標記將膠體金與抗己烷雌酚特異性單克隆抗體按1∶0.005～0.015(ml/mg)比例混勻，使膠體金與抗己烷雌酚特異性單克隆抗體形成穩定的膠體顆粒，通過純化、濃縮形成抗己烷雌酚特異性單克隆抗體—膠體金標記物；(6)將抗己烷雌酚特異性單克隆抗體--膠體金標記物包被在膠體金結合墊上，將己烷雌酚-BSA偶聯物和羊(兔)抗鼠IgG包被在硝酸纖維素膜的檢測區和控制區，充分乾燥。
全文摘要
檢測己烷雌酚的免疫膠體金試劑及製備方法，該試劑包括樣品墊、膠體金結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯，PVC背襯一端依次粘附樣品墊、膠體金結合墊，中間粘附硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊，其特徵在於膠體金結合墊上包被了抗己烷雌酚特異性單克隆抗體—膠體金標記物，硝酸纖維素膜上包被了己烷雌酚－BSA偶聯物和羊(兔)抗鼠IgG。該試劑是一種特異性強、敏感性高、簡易快速、費用低廉、能現場檢測，全過程只需30分鐘，操作人員無需專業培訓，按說明書即可完成操作。
文檔編號A61K39/395GK1547018SQ20031010946
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月16日 優先權日2003年12月16日
發明者張少恩 申請人:博頓生物檢驗技術(杭州)有限公司