一種檢測ABAT基因的引物組合、試劑盒及應用的製作方法
2023-05-19 20:17:17
本發明涉及生物醫學工程領域，且特別涉及一種檢測ABAT基因的引物組合、試劑盒及應用。
背景技術：
γ-氨基丁酸GABA(γ-aminobutyric acid，GABA；)代謝途徑是廣泛存在於動植物和微生物中的TCA(Tricarboxylic Acid，TCA)循環一個代謝旁路；該代謝途徑最早在馬鈴薯塊莖中發現。GABA代謝途徑主要由三個酶組成：穀氨酸脫羧酶GAD(Glutamate decarboxylase，GAD)、γ-氨基丁酸轉氨酶GABA-T(γ-aminobutyric acid transaminases，GABA-T；在人體中簡寫為ABAT)和琥珀酸半醛脫氫酶SSADH(succinic semialdehyde dehydrogenase，SSADH)。GABA代謝途徑起始於TCA循環中的α-酮戊二酸α-KG(α-Ketoglutarate，α-KG)經穀氨酸脫氫酶GDH(glutamate dehydrogenase，GDH)的催化生成穀氨酸Glu(glutamate，Glu)，穀氨酸經線粒體跨膜運輸進入細胞質中；在細胞質中經穀氨酸脫羧酶GAD催化一個非可逆反應，生成γ-氨基丁酸GABA，γ-氨基丁酸GABA又經線粒體跨膜運輸進入線粒體內；γ-氨基丁酸GABA經γ-氨基丁酸轉氨酶GABA-T作用，生成琥珀酸半醛SSA(succinic semialdehyde，SSA)；琥珀酸半醛SSA再經琥珀酸半醛脫氫酶SSADH(succinic semialdehyde dehydrogenase，SSADH)的催化生成琥珀酸Succinate回到TCA循環中，而且SSADH催化的這一步反應是一個不可逆反應。
GABA途徑在動植物和微生物中都發揮著重要的作用，尤其是與動植物及人類的生長發育密切相關。GABA途徑在人體中與神經系統的發育和功能密切相關，GABA在脊椎動物中樞神經系統中是一種抑制性神經遞質；在人體中GABA能通過神經活動調節降低血壓的作用。GABA途徑能保持大腦中興奮和抑制間的平衡，在大腦線粒體中這一途徑顯得尤為重要。
人體GABA的缺乏和過度累積會導致非特異的神經系統功能紊亂，包括精神運動性阻滯、語言發育推遲和癲癇等。人體GABA的累積有可能是ABAT基因突變等原因造成，ABAT基因缺失導致GABA代謝受阻而累積，進一步影響神經系統功能。但是，如果ABAT基因序列本身正常，但是由於ABAT基因甲基化的影響，也會導致ABAT的轉錄翻譯異常，進而影響GABA的代謝，導致GABA的累積。
目前，市場上幾乎沒有針對ABAT基因的檢測手段，更少有針對ABAT基因序列甲基化和ABAT基因的檢測試劑盒。
技術實現要素：
本發明的第一目的在於提供一種檢測ABAT基因的引物組合，此引物組合能快速準確的檢測ABAT基因，且該引物組合沒有髮夾結構、引物二聚體結構，反應靈敏，擴增片段長度合適；退火溫度合適，無非特異性條帶。
本發明的第二目的在於提供上述引物組合在製備用於ABAT基因突變檢測的試劑中的應用。
本發明的第三目的在於提供上述引物組合在製備用於胎兒產前ABAT基因突變檢測的試劑盒中的應用，該試劑盒能方便快捷、準確、特異性的鑑定ABAT基因，且該試劑盒的成本低廉，適合推廣應用。
本發明解決其技術問題是採用以下技術方案來實現的。
一種檢測ABAT基因的引物組合，引物組合包括用於擴增SEQ ID NO.1所示的鹼基序列的第1-1202位區段的第一引物對、用於擴增SEQ ID NO.1所示的鹼基序列的第913-2414位區段的第二引物對和用於擴增SEQ ID NO.1所示的鹼基序列的第2399-4412位區段的第三引物對；第一引物對的鹼基序列如SEQ ID NO.2-3所示；第二引物對的鹼基序列如SEQ ID NO.4-5所示；第三引物對的鹼基序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
還包括用於擴增SEQ ID NO.8所示的鹼基序列的第1344位－1529位區段的第四引物對，第四引物對的鹼基序列如SEQ ID NO.9-10所示。
還包括用於擴增SEQ ID NO.8所示的鹼基序列的第5006位－5403位區段的第五引物對，第五引物對的鹼基序列如SEQ ID NO.11-12所示。
上述的任一項引物組合在製備用於ABAT基因突變檢測的試劑中的應用。
上述任一項引物組合在製備用於ABAT基因突變檢測的試劑盒中的應用。
上述的任一項引物組合在製備用於胎兒產前ABAT基因突變檢測的試劑盒中的應用。
一種檢測ABAT基因的試劑盒，試劑盒包含上述的檢測ABAT基因的引物組合和/或上述的檢測ABAT基因甲基化的引物組合。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：針對人體ABAT基因表達序列設計的引物能快速準確的檢測該基因，針對ABAT基因序列設計的甲基化引物，能快速判斷基因的甲基化情況；上述引物組合在胎兒產前檢測及其試劑盒中的應用，能幫助檢測快速檢測ABAT基因；上述引物組合在製備ABAT基因檢測試劑盒中的應用，具有更廣泛的應用。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對範圍的限定，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。
圖1為本發明實驗例中的瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖2為本發明實驗例中的瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖3為本發明實驗例中的瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實施方式
為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
下面對本發明實施例的檢測ABAT的引物組合和檢測ABAT基因甲基化的引物組合及應用作進一步的說明。
GABA在人體中，尤其是在神經系統中，具有重要的作用，如果GABA的水平異常，會導致神經系統功能紊亂。GABA的水平異常跟編碼γ-氨基丁酸轉氨酶ABAT基因異常有關。當ABAT基因存在缺失突變等情況會導致GABA水平的異常。然而，由於表觀遺傳的影響，即使ABAT基因的鹼基序列為發生變化，但是如果序列發生甲基化，也會導致基因的表達異常，進而影響GABA水平的異常。
因此，發明人針對上述情況，設計了針對ABAT基因編碼序列的引物組合和針對ABAT基因甲基化的藥物組合。
一種檢測ABAT基因的引物組合，引物組合包括用於擴增SEQ ID NO.1所示的鹼基序列的第1-1202位區段的第一引物對、用於擴增SEQ ID NO.1所示的鹼基序列的第913-2414位區段的第二引物對和用於擴增SEQ ID NO.1所示的鹼基序列的第2399-4412位區段的第三引物對；第一引物對的鹼基序列如SEQ ID NO.2-3所示；第二引物對的鹼基序列如SEQ ID NO.4-5所示；第三引物對的鹼基序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
該引物組合分為三段且具有交叉重疊的區段，交叉重疊即不會導致人為的遺漏而導致檢測不準確；能全面準確的覆蓋ABAT基因的全長，如果ABAT基因有缺失或者突變的情況，就能通過電泳或者測序的方法，知道具體的缺失或突變的具體位點。
進一步地，還包括用於擴增SEQ ID NO.8所示的鹼基序列的第1344位－1529位區段的第四引物對，第四引物對的鹼基序列如SEQ ID NO.9-10所示。
進一步地，還包括用於擴增SEQ ID NO.8所示的鹼基序列的第5006位－5403位區段的第五引物對，第五引物對的鹼基序列如SEQ ID NO.11-12所示。
基因組DNA經過重亞硫酸鹽的處理後，通過上述檢測ABAT基因甲基化的引物組合的擴增產物，能夠通過測序和序列比對；如果序列的胞嘧啶轉變為胸腺嘧啶，則判斷該鹼基未發生甲基化，如果胞嘧啶為轉變成胸腺嘧啶，則該點發生了甲基化。通過此方法能快速的判斷出ABAT基因的甲基化情況。
上述的引物組合在製備用於ABAT基因突變檢測的試劑盒中的應用。
該試劑有利於大規模的推廣應用，能在很大程度上降低胎兒檢測的成本。
上述的引物組合在製備用於胎兒產前ABAT基因突變檢測的試劑盒中的應用。
胎兒產前檢測，更有利於得到健康的胎兒，而且對胎兒的健康狀況有更明確的了解；或者可以提前準備好對策。
一種檢測ABAT基因的試劑盒，包括上述任一項的引物組合。
進一步地，上述試劑盒還包括PCR反應緩衝液、ddH2O和200μL的PCR反應管中一種或多種。
進一步地，上述PCR反應緩衝液包括Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+和溴酚藍。
進一步地，Taq DNA聚合酶為高保真的Taq DNA聚合酶。
在進行PCR反應的時候，使用高保真的Taq DNA聚合酶，能保真擴增的反應的時候，擴真的序列保持與模板的一致性。
進一步地，檢測ABAT基因的試劑盒還包括重亞硫酸鹽。
使用重亞硫酸鹽處理目的基因片段，未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶；而甲基化的胞嘧啶則保持不變；通過PCR反應後，尿嘧啶轉化成胸腺嘧啶，然後對PCR產物測序；通過比對測序結果，如果序列的胞嘧啶轉變成了胸腺嘧啶，則該點未甲基化；如果胞嘧啶未發生轉變則鹼基發生了甲基化。通過此方法判斷序列甲基化位點，精確度高，能找到片段中的每一個甲基化位點。
以下結合實施例對本發明的特徵和性能作進一步的詳細描述。
實施例1
本實施例提供檢測ABAT基因的引物組合，包括用於擴增ABAT基因編碼序列mRNA序列的第1-1202位區段的第一引物對、用於擴增ABAT基因編碼序列mRNA序列的第913-2414位區段的第二引物對和用於擴增ABAT基因編碼序列mRNA序列的第2399-4412位區段的第三引物對。第一引物對、第二引物對和第三引物對的序列如表1所示。
上述三對引物組合擴增的片段，覆蓋ABAT基因編碼序列mRNA全長序列。
本實施例提供的檢測ABAT基因編碼序列具體方法，具體如下：
第一部分，細胞樣本的提取
1取樣，通過羊水穿刺，抽取15-25nL的羊水，1500rpm離心5min，取沉澱；
2培養，將沉澱用培養基製成細胞懸液分別加入到兩個細胞培養瓶中培養瓶，培養瓶中加有F10培養液2.1mL和小牛血清0.9mL，37培訓箱靜置培養6-7天；
3富集，用胰蛋白酶處理培養液，然後培養液轉移到離心管中，1500rpm離心10min,棄上清液，沉澱的細胞樣品保存備用；
第二部分胎兒細胞總RNA提取及反轉錄
1取第一部分獲得細胞樣品(50-100mg)液氮研磨，研磨過的樣品加入到RNase-free的EP管中，每管用1mL的Trizol處理，靜置5min；
2以12000rpm離心5min，棄沉澱，加入200μL的氯仿-異戊醇，震蕩均勻後，靜置15min；
3以4℃，12000rpm離心10min，吸取上清液至另外的RNase-free的EP管中，加入500μL異丙醇，混勻，-20℃放置25min；
4以4℃，12000rpm離心10min，棄上清；用75％的乙醇(RNase-free)1mL洗滌兩次，晾乾；
5加50μL的ddH2O(RNase-free)溶解得到total RNA，-80℃保存備用；
6加反轉錄酶，dNTP，oligo dT primer，total RNA反轉錄得到cDNA樣品。
第三部分ABAT基因編碼序列的擴增
用第二部分第6步獲得的cDNA樣品為模板0.5μL，PCR反應Mix反應液10μL，引物對0.5μL/0.5μL，ddH2O 8.5μL，混合均勻；
反應程序：94℃預變性2min，94℃變性30s，55-65℃退火30s，72℃延伸1kb/min(延伸時間)，72℃延伸2min，35個循環。得到擴增產物，通過電泳觀察結果。
第一引物對的退火溫度為60℃，延伸時間為80s；第二引物對的退火溫度為55℃，延伸時間為100s；第三引物對的退火溫度為57℃，延伸時間為130s。
表1 ABAT基因檢測引物對
實施例2
本實施例提供的檢測ABAT基因的引物組包含了實施例1提供的引物組合外，還包括用於擴增ABAT基因組序列片段的第1344位－1529位區段的第四引物對。第四引物對的序列如表1所示。
本實施例提供第四引物對的使用方法，具體如下：
採用實施例1提供的方法製備細胞樣品
1取細胞樣品(50-100mg)加血清至1mL，加入等體積的PBS緩衝液，混勻後12000rpm離心5min，棄上清；
2加入667μL的STE，24μL的20％的SDS，37℃水浴1h，加10μL的20mg/mL的蛋白酶K混勻，55℃水浴消化過夜；
3消化的樣品加入等體積的Tris飽和酚，充分搖勻，12000rpm離心10min，取上清加入等體積的Tris飽和酚，充分搖勻，12000rpm離心10min；
4取上清加入等體積的氯仿：異戊醇，漩渦震蕩，再12000rpm離心10min，重複一次；
5取上清液加入2倍體積的冰醋酸，1/10體積醋酸鈉水平搖動，直到可見絮狀DNA析出，-20℃處理30min或冰浴15～20min，取出後再次12000rpm離心10min，使DNA沉澱；
6用70％的乙醇洗滌2次。晾乾，加入TE緩衝液溶解，-20℃保存備用。
ABAT基因的基因組序列的擴增
本實施例獲得DNA樣品用重亞硫酸鹽處理，獲得的DNA樣品為模板0.5μL，PCR反應Mix反應液10μL，引物對0.5μL/0.5μL，ddH2O8.5μL，混合均勻；
反應程序：94℃預變性2min，94℃變性30s，66℃退火30s，72℃延伸30s(延伸時間)，72℃延伸2min，35個循環。得到擴增產物。
實施例3
本實施例提供的檢測ABAT基因的引物組包含了實施例1和實施例2提供的引物組合外，還包括用於擴增ABAT基因組序列片段第5006位－5403位區段的第五引物對。第五引物對的序列如表1所示。第五引物對的退火溫度65℃，延伸30s。
本實施例提供的第五引物對的具體使用方法，參考實施例2提供的使用方法。
實施例4
本實施例提供一種檢測ABAT基因的試劑盒，該試劑盒包括實施例1提供的引物組合。該試劑盒可用於檢測ABAT基因編碼序列，可以檢測胎兒的ABAT基因是否正常和完整。且本實施例提供的試劑盒具有良好的靈敏性和特異性，使檢測結果更為準確。
當然，在其他本實施例中，本發明提供的檢測ABAT基因的試劑盒，還可以包括由Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+和溴酚藍構成的PCR反應緩衝液、ddH2O和200μL的PCR反應管中的一種或多種。
試劑盒的片段擴增方法參考實施例2的處理方法。
實施例5
本實施例提供一種檢測ABAT基因的試劑盒，該試劑盒包括實施例1和實施例2提供的引物組合。該試劑盒可用於檢測ABAT基因編碼序列，可以檢測胎兒的ABAT基因是否正常和完整，以及ABAT基因的基因組片段序列是否有甲基化現象發生。且本實施例提供的試劑盒具有良好的靈敏性和特異性，使檢測結果更為準確。
當然，在其他本實施例中，本發明提供的檢測ABAT基因的試劑盒，還可以包括由高保真Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+和溴酚藍構成的PCR反應緩衝液、ddH2O和200μL的PCR反應管中的一種或多種。
試劑盒的中第一至第三引物對的使用方法參考實施例1的使用方法；第四引物對的使用方法參考實施例2的處理方法。
實施例6
本實施例提供一種檢測ABAT基因的試劑盒，該試劑盒包括實施例1、實施例2和實施例3提供的引物組合。該試劑盒可用於檢測ABAT基因編碼序列，可以檢測胎兒的ABAT基因是否正常和完整，以及ABAT基因的基因組片段序列是否有甲基化現象發生。且本實施例提供的試劑盒具有良好的靈敏性和特異性，使檢測結果更為準確。
當然，在其他本實施例中，本發明提供的檢測ABAT基因的試劑盒，還可以包括由高保真Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg2+和溴酚藍構成的PCR反應緩衝液、ddH2O、200μL的PCR反應管和重亞硫酸鹽中的一種或多種。
試劑盒的中第一至第三引物對的使用方法參考實施例1的使用方法；第四引物對的使用方法參考實施例2的處理方法。擴增加過通過基因測序可以獲得精確的結果。
實驗例
荀某，26歲，懷孕14周。進行了胎兒產前檢查，包括ABAT基因的檢測。
檢測原理：
羊水穿刺，是提取羊水中胎兒的脫落細胞，提取羊水中胎兒脫落細胞DNA等遺傳信息，對胎兒進行檢查。
本實驗例採用實施例6提供的試劑盒進行胎兒ABAT基因的產前檢測。
第一至第三引物對的PCR擴增反應產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段大小正確，如圖1到圖3所示，圖中M表示DNA的Marker，圖中數字1-3表示三個平行試驗；圖1中目的片段長度1202bp，圖2中目的片段1501bp，圖3中目的片段2013bp；且第一至第三引物對擴增產物經測序無鹼基突變。第四和第五引物對的PCR擴增反應產物經測序無甲基化位點。基於以上結果，可以判斷出荀某的胎兒ABAT基因表達正常，出現相應疾病的可能性基本排除。
綜上所述，本發明實施例的檢測ABAT基因的引物組合、檢測ABAT基因甲基化的引物組合以及檢測ABAT基因的試劑盒能準確的檢測ABAT基因的轉錄、甲基化等，節約時間。結果正確可靠。幫助孕婦家庭控制風險。
以上所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發明的實施例的詳細描述並非旨在限制要求保護的本發明的範圍，而是僅僅表示本發明的選定實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
SEQUENCE LISTING
青島松良基因科技有限公司
一種檢測ABAT基因的引物組合、試劑盒及應用
12
PatentIn version 3.5
1
4412
DNA
Homo sapiens
1
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atttcgttct ctccccatgg ggcactgaca ga 4412
2
20
DNA
Homo sapiens
2
gtgatcaccc tcattacctc 20
3
19
DNA
Homo sapiens
3
ggctttagag tgcgtggtc 19
4
19
DNA
Homo sapiens
4
cggagaactt tgtggagaa 19
5
21
DNA
Homo sapiens
5
atatggcact tgagatggac t 21
6
22
DNA
Homo sapiens
6
atctcaagtg ccatattctg tg 22
7
20
DNA
Homo sapiens
7
tctgtcagtg ccccatgggg 20
8
8994
DNA
Homo sapiens
8
atggcctcca tgttgctcgc ccagcgcctg gcctgcagct tccagcacag ctaccgcctg 60
ctggtgcctg gtaagccccg ggggtcttga taagaactgg tactaatgga agataccatc 120
cagactaggg attcctgggc tggaagagcc cttggggata aagggaccag ccagtgagtg 180
tttctgggac tgtcccactg tattagtctg ttctcatgct gctaataaag gtacacctga 240
gactgggtat tttatgaaga aaaagaggtt taatggtctc acagtttcat atggctgggg 300
aggcctcaca atcatggcgg aaggtgaagg aggaacaaag gcacgtctta catggctaca 360
ggcaagagag catgtgcagg ggaactcccg tttgtaaaaa catcagatcg tgtgagactt 420
actcaattga ctatcatgag aacagcatgg gaaagaccca cccccatgat tcaattacct 480
cccactgggt ccctcccatg acgtgggaat tatgggagct atgatttaag atgagatttg 540
aatgaggaca cagccaaacc acatcaccca ctatccataa aactgtcacc atcgccacct 600
cctttctctc tcccatctct gtcatatgat cctgtcccaa gtgcctcggt ctgatgggat 660
tggatccacc ctggagccac tctgcctgca ggtaggcggt ggcctccaca gccagatggc 720
cccaggccat ctctgcaggg accgctgggg aaaacacaca tctgggatcg ctgctaagga 780
acaaagaaag ccataagcga ctctgaaatt gacctagagc ccagctgtgc ttcagggtca 840
ctggatcact ggatgggagg caccatctta ggaatgtctc acccccactc tgccccacac 900
ccatggccac ttgcactggc tccttcttcc ttctgtttga cgtctttgag acctccctcc 960
caatagtccc atgagggagg gaggctcaag tgaatcctat tttacaggtg agagaactca 1020
ggcttagaga agcaaagcca tttgcccaag gtcacacagc cacttgcaag caactctgtc 1080
cggctccaat gctaactact cctccgtgtg cctccatgtg gctctggaga cagagccgcc 1140
agcaggagcc tcccttcaca tgccccgaga gtggcctcct gcagagatat aaagtgcctg 1200
gctcggggct ggccatgaaa taggttcaga aagaccagtg agcctccagc ctgtccccag 1260
ctctctcaca gcccctgtgc ttgtcatcat ggtgtccctt gttggcaggc cttactgcct 1320
tctgaagaca aactgctagc cgtgtccttg gtctgcatgt tgaatgctgg tgtgtatgtc 1380
ctgggtggca taaacagtag gagcgttcgc ccctccccaa ggagtatgag taggctttat 1440
tttaaaataa acatcttggc cgggcgcagt ggctcacaac tgtaatccca gcactttggg 1500
aggcgaggtg ggcagatcac ctgaggtcag gggtcgagac cagcctggcc aacatggtga 1560
aaccccgtct ctaccaaaaa tacaaaaatt agccaggtat ggtggtggat gcctgtaatc 1620
ccaactactc agcaggctga ggcaggagaa tcgcttgaat ccaggaggta gaggtggcag 1680
tgagctggat cgtgccactg tactccagcc tgggcaacat cgaggctctg tctcaaaaaa 1740
ataaaaaata aataaataaa catcttattt tttaaaaatt ttagatttac agagaagtta 1800
caaagatatt acagggagaa cccatatggc cctcaccagt ttcctccctt gttaacatct 1860
tacatcacca agatgcagtt gtcaacacta agaaactagc tggccaggcg cggtggctca 1920
cgcctataat gccagcactt tgggaggccg aggcaggagg atcatctgag gtcagaagtt 1980
cgagaccagc ctgggcaaca tggtgaaacc tcatctctac taaaaataca aaaaaaaaat 2040
tagccgggtg tggtggcagg cacctgtaat cccagctact tgggaggctg aggcagaaga 2100
agcacttgaa cccagaaggc ggaggttgca gtaagctgag attgagccac tgtacttcag 2160
cctgggcaac agactgagat taaaaaaaaa aaaaagaaag gaaaggaaga gaaggaagga 2220
aggaaggaag gaaggaagga aggaaggagg aaagaaagaa agaaagaaaa ggaaagaaag 2280
aaagaaggac agacagacaa gacagtggct cacagctgta accccagcaa tttgggaggc 2340
tgaggcagga ggatcgcttg agcccagggg tttgagacca gcctgggcaa catagggaga 2400
ccctgtctct gtgaaaaata caaaacttag ctgggcatgg tgacatgtgc ttgtagtctc 2460
agctactggg gaggctgaag cgggaggatt gcttgagcct gggagatcga ggctgcagtg 2520
agccatgatc atgccacagc actccagcct gggtggcctt gtcttaaaat aataataata 2580
gataaataag tttttaaaga cactaagaaa ctgaccttgg tatgttacca ttaaccaaac 2640
tccagacttt tatttggctt tcactcattt ttcctttaat gtctttttct gctccaggat 2700
ccaatccagg tacacacatt gcattgattt gtctcatctt ccatggcctc ctctggtctg 2760
tgacagtttc tcagtctttt ccttattctt ctcgacctgg gtggttttaa gaagttatca 2820
atggcttttg aggttttgct tttccttttt tcttttttgt ttttgttttt gtttttgttt 2880
ttgttttttt tttggtgtgt gtgtatgtgt gtctgagatg gagtctcact ctgttggcca 2940
ggctggagtg gtgccgtggt gcaatctcga ctcactgcaa cctccacctc ccggattcaa 3000
gtgatcctcc tgcctcagcc tcccaagtag ctgggattac aggcacctgc caccatgccc 3060
ggctaatttt tatatttttt gtagagacag ggttttacca tgttggccag gctagtctcc 3120
aactcctgac ctcaagtgat ccacccatct tggcctccca aagtgttagg attactggca 3180
tgagccactg cacctggcca aggttttgct ttatttattt atttataaga gaagcatatt 3240
aatgtttacc cataattatg ctaaactaaa tcagaaagat gtaggtatgg agggttccaa 3300
gtcagaaaga gagtctggca cagatgatcc attcattcca taactaaggc tgttgggcac 3360
ctactgcatg ccaagtgctg tgctgggtat taaggatgtg gcagtgaaga aagacatgtg 3420
gctcttgtgg agctctagcc tggtggcgca tgtggcacca tctttaaagg tcattctcca 3480
ggacatctga gctttcctaa ggagacacca tgggaagagc actaggtcaa gattcatgtg 3540
attggattgc taccttcacc acacattaac caagtgagcc taaccgatat accttatcca 3600
agcctcggtt ttctcatcag gaaaacgggt ctaataatca tatccttcct atttcacaaa 3660
tttcttgcat tagaagaaat ggttcatatg ggccaggcac agtggcccac acctgtaata 3720
ccaacacttt gggaggctga ggcgggtgga tcacctgagg tcaggagttc aggaccagcc 3780
tggccaacat gatgaaaccc cgtctctact aaaaatacaa aaattagctg cgcatggtgg 3840
tgtgcacctg taatcccagc tacttgggag gctgaggcag gagaatgggt tagaacccag 3900
gaggcggagg ttatggttca tgtgaaagca ctttatttgt atttacagta aggtgggaag 3960
tgtcctaact cccattttac aagcatggaa atacaggcac aatgcaaaaa acaaaaaaac 4020
agaaaaaata gaaatggcta aatcacagag tttcttacct ttacctcttc tgcattttct 4080
tggctggagc tgaatctttt ttggcacatt tatgatttag aaaaccatat ggtgagattt 4140
tgtcttctct tttgacttat tgatttggga tatctagtaa gccagaatat ggttttttaa 4200
gaatactaaa acacagtgtt ggcaaagata caggaatacg tgtactctcg tacactgcta 4260
ttaggcaagt agcaaccagg ggaaggatta aaaaatgata ggaattacag cttactttta 4320
acccatttag ccctcacctc cactccttaa ggtaaaggaa acttcaagtc agggaaatta 4380
agttgccaga gccacagagc tgatgagcgg ctgagccagg cttttgagct aagcccagtt 4440
ggctccagga cccgagccac tgtattgatt atctgccgcc acgtaacaca tacctccaga 4500
tttagcagat tgggatccta tgtttattat ctcacagttt ctgcgggttg ggactccagg 4560
ggtgacttag ccagatcctc tggctcaagg tctgtcatga gggtgtaatg gagctgtcag 4620
ctggggctgt ggtctcatat gatggctcaa cttggcggtt ggacgatcta ctggcagtcc 4680
cacttacggg gttgtggctg gattcagttc cttggatgct gtcagccaga agccactctc 4740
agttccttga tacgtggacc tcttcacaga gccgcttaca atgtggcaac tgctccctca 4800
aagcaagaga gggtgccaaa aatggaagcc tcagcctgca gccataccca cagcattttc 4860
ctgcttctcc atggtgtctc caccaggtcc ctgtgaggcc attaaagtga cgatagttaa 4920
cgatctgaca tggtgttccc aatggcatca ttttatgcct ccccaaaatt aataatctta 4980
tgttggtaaa tagaatacag agagtgggag accacatcaa aattgttatt gctgggtaga 5040
aaattaaatg tgttttcttt tttccatgtt gcttattggt atcttcctca ataaacattt 5100
tatcacaaaa taagtggggt ggacagttgc aggagcagat aaaaaaaatt ttttaacaga 5160
aaagcagagc aaacaactcc agttggactt gaccttcgtt ctggccaggc tcatgtacag 5220
agctttggct gtttgggaac acgacattcg tttatcactc tcggtctaaa gatcaagaga 5280
acattaacaa tgtttgctag ctactgtgta gtttggagct aaaaatagac tctggcttgg 5340
catggccatt gagggctgtg agccccagag ggccaggctg gatggaccat tcacatattg 5400
tgtctggtct tgtgtgtcaa taacatactc ttgccttctg gatgtgttat tttattcaag 5460
aatgaaaatg cttgatcatt cagtattaat tcaaaccggt tttttgcatc tttgtgatca 5520
tgatcaaaat ttgcctttag gagaagtgtg ttgttttgct gcaaatgttt cattcaaagg 5580
ctagcactcg atgaaatcaa agatagcctc agttccattc atagcttcta ggaaacaggt 5640
cagatgggca aatttcctgc taaccacttg ctagctgtgt gatcttgggc aaattaatta 5700
acctctctga gcctcagcgt cttcttctgt aatgtaagaa taataacatt tacctcatag 5760
gagtttgtga gaattaaatg agataagcca tgtaaattgc tccagatgat tcctggttgt 5820
taccctaagt gctcagtaca cacttgaatc tgcttctgtg tcttcataga tgagatccaa 5880
gagaaggttt acttgtccct tcaatttttg ttctgttctc ttgtggtgta ttgttatatg 5940
tcatcattaa gagaatattc attgtaatag tatttggtta ttttcctttt ttaaaaatgc 6000
caacattgag atatagaagg aaaagcagaa gtattgggat tgcaagaacc tgggttccaa 6060
tgctgactct tcaactcact agctgtgtga catcgggaaa gtcacttaac atctctgatc 6120
ctcaactgta aactgtgaac aacaatacta tctatatggt tgtatttaat tgtggattac 6180
ttaaaataga tggaagtttg cctaaatagg gccagcctag cattttagta aagactgaat 6240
atgtgttaat ttccccattc cccccctttc tgatagcgca gttgcaaaca aacttatgga 6300
aaacatgata ggagctgata cagttctcgg aacagaccca tctgccttgg acctgtcctc 6360
agcattcctg gcttgtgccc catagcgccc agttagccag ttctcaccct ttcttcacca 6420
cctctcccag ctcctgtttc cccatggcct tgacatgctc attatcgcag ttccacttga 6480
tcccacgctc tccagtcatt tctctctgga tccattcagc cgcagctccc cctgtgtact 6540
gctcccattc ccagtatttc cacactccgg ttcccaagaa atctgattgc tacaatgcaa 6600
tgtcaagaca ctttctggag aaaagaaagg aggacgcgtg tgtcctcatt taagaacagc 6660
ttgctaattt ctgatttttc attttccccc tttgctggaa acaaagcaag atctgcactg 6720
gtgaagagct atttttatca aaatatgcgt ccctgaagat ctagttggaa tcaatgctgt 6780
ccagttatcc tgagttctgg caaaggaaaa gataaatagt ttagtgtaaa aaactagggc 6840
cgggtacggt ggcttatgcc tgtaatccca gcactttggg gggccaaggc gggtggattg 6900
cctgagctca ggagttccag accatcctgg gaaacatggc aaaacccctt ctctgccaaa 6960
aatgcaaaaa attagccggg catggtgacg catgcctgtg atcccagcta ctcagggggc 7020
taaggtgaga ggattgcttg aaaccgggat gcagaggttg caatgagctg agatcgcacc 7080
actgcattcc ggcttgggcg acagagtgag accctgtctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 7140
agtagccggg cgcagtgttg tgtgcctgta gtcctagcta cgtgggaggc tgaggcagga 7200
ggatcacttg agcccaggag ttcaacgcca ggctgggcaa catagcgaga cctcatttct 7260
ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagtcatcga tatgttctag gacctttagc tctcttctaa 7320
tggaatactt ttaggaattc cctttttcag atcaaagaga agaaaataaa agctgttttt 7380
cttcatcctt atataagtat agtgctgtat tttaacggta ctttatgttc aaaagacagc 7440
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gcatgtgtgt ctctgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtca cgggagatct 7620
tggcacattt cttaacttct ctgagcttta gagtcccctc ttgtgtaatg gaaacagtta 7680
tatatatata tatatatata cacacatttt ataatatatt atataatata tattttagtt 7740
ataatgtatt atataatata tattttagtt atagtatata atatgtattt tagttataat 7800
atattatgta atatatactt tagttttaat atataatata ttttagttgt aatatataat 7860
atatatttta gttatatgat atatatttta gttataatat ataatatata ttttagttat 7920
aatatgttat atattttagt tataatatat attttagtta tatatgtagt tatataatat 7980
atatttttgt ttattatata tatgaagatg aaattagatt atttatgtaa tttatataaa 8040
gtgtccactg attccctagt ttggtacaat tatggcaacc ccagtaagag gaactaacat 8100
ttcccaacca ccaaatagta ccaggaaggt gaaagatcaa gagtaacact gaagggattt 8160
ctaggggttc ctgacagtaa accctcacac acttgtcttg gatacaccgc acctgtcttt 8220
cactcaggga tcagcaaggc ttgggcttga gctacccttt gtgtttcagc aacatgtgga 8280
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Homo sapiens
11
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Homo sapiens
12
taacctcaaa taatctaccc acctc 25