涉及痘病毒和癌的方法及組合物的製作方法

2023-05-20 10:20:06 4

專利名稱：：涉及痘病毒和癌的方法及組合物的製作方法涉及痘病毒和癌的方法及組合物本申請是國際申請PCT/US2003/025141，國際申請日2003年8月11日，中國國家階段申請號03823719.9，名稱「涉及痘病毒和癌的方法及組合物」的發明專利申請的分案申請。
背景技術：
：1.發明領域本發明涉及腫瘤學和病毒學領域。更具體地說，本發明涉及包含一個或多個突變從而使其特別適於癌症治療的痘病毒，尤其是指痘苗病毒。2.相關領域的描述正常組織的內環境穩定是一種細胞增殖和細胞死亡之間高度平衡的過程。細胞增殖和細胞死亡之間失去平衡就會致癌(Solyanik等，1995；Stokke等，1997；Mumby和Walter,1991；Natoli等，1998；Magi-Galluzzi等，1998)。例如，宮頸癌、腎癌、肺癌、胰腺癌、結腸癌和腦癌只是可能發生的多種癌中的幾種(Erlandsson，1998；Kolmel,1998；Mangray和King，1998；Gertig和Hunter，1997；Mougin等，1998)。事實上，癌症的發生率相當高，僅在美國每年就有超過500,000的人死於癌症。細胞增殖和細胞死亡的維持至少部分是由原癌基因和腫瘤抑制基因調節的。原癌基因或腫瘤抑制基因可編碼誘導細胞增殖的蛋白質(如sis、erbB、src、ras和myc)、抑制細胞增殖的蛋白質(如Rb，pl6，pl9，p21，p53，NFl和WTl)或調節細胞調亡的蛋白質(如bcl-2)(Ochi等，1998Johnson和Hamdy，1998；Liebermann等，1998)。但是，基因重排或這些原癌基因和腫瘤抑制基因的突變都會導致原癌基因轉化為致癌的癌基因或使腫瘤抑制因子變成無活性的多肽。一般來說單一點突變就足以完成這種轉化。例如，腫瘤抑制蛋白P53上的點突變就可以導致其完全失去野生型p53的功能(Vogelstein和Kinzler，1992)。到目前為止，只有幾種有效的方法用於治療多種常見類型的癌。對於單個個體來說，選用何種治療措施要根據診斷結果、疾病分期以及其他因素如年齡、性別及患者的健康狀況。最常用的癌症治療方法是手術、放療和化療。手術在腫瘤的診斷和治療中扮演主要角色。通常活檢和去除癌性生長物都需要通過手術方法。但是，如果腫瘤已經轉移和擴散，則手術就不可能使患者痊癒，因此需要採用其他治療措施。放療、化療和免疫治療是手術治療措施的替代方法(Mayer，1998；Ohara,1998；Ho等，1998)。放療是指通過高能射線精確照射以摧毀癌細胞，與手術很相似，主要用於治療未轉移的局域化的癌細胞。放療的副作用包括皮膚刺激、吞咽困難、口乾、噁心、腹瀉、脫髮和無力(Curran，1998；Brizel,1998)。化療是指利用抗癌藥治療癌症，是另一種癌症治療模式。一種特定抗癌藥的療效通常由於藥物難以進入實體瘤內而受到限制(el-Kareh和SeComb，1997)。化療策略的基礎在於腫瘤組織可以生長，其中抗腫瘤藥物的靶位是快速分裂的癌細胞。最常用的化療方法包括多種抗癌藥的聯合化療，這種方法被證實可以提高多種癌的反應率(美國專利5，824，348；美國專利5，633，016和美國專利5，798，339，本文已納入作為參考)。化療藥物的主要副作用是這些藥物也可以影響正常組織細胞，最可能受影響的是那些在某些情況下快速分裂的細胞(如骨髓、胃腸道、生殖系統和毛囊)。化療藥物的其他毒性效應包括口瘡、3吞咽困難、口乾、噁心、腹瀉、嘔吐、疲乏、出血、脫髮和感染。免疫治療是癌症研究中一個快速發展的領域，是另一種治療某些類型癌的方法。從理論上說，免疫系統被刺激後可將腫瘤細胞認定為異源物質，從而將它們作為摧毀的靶位。但不幸的是，這時的免疫系統發生的反應一般都不足以阻止大多數腫瘤的生長。但是，最近研究的熱點集中在免疫治療領域以開發出增強或補充免疫系統自然防衛機制的方法。目前正在研究或正在使用的免疫治療方法有免疫佐劑(如牛結核菌、惡性瘧原蟲、二硝基氯苯和芳香化合物)(美國專利5，801，005；美國專利5，739，169；Hui和Hashimoto,1998；Christodoulides等，1998)、細胞因子治療(如幹擾素(IL-1，GM-CSF和TNF)(Bukowski等，1998;Davidson等，1998;Hellstrand等，1998)以及基因治療(如TNF，IL-1，IL-2，p53)(Qin等，1998；Austin-Ward和Villaseca,1998；美國專利5，830，880和美國專利5，846，945)和單克隆抗體(如抗神經節苷脂GM2，抗-HER-2，抗-pl85)(Pietras等，1998；Hanibuchi等，1998；美國專利5，824，311)。這些方法雖然表現出了一定的前景，但是取得成功的例子還是有限的。複製選擇性的瘤溶解病毒具有可用於癌症治療的前景(Kirn等，2001)。這些病毒可通過直接的複製依賴性和/或病毒基因表達依賴性瘤溶解效應引起腫瘤細胞的死亡(Kirn等，2001)。另外，該病毒還可以增強誘導宿主內細胞介導的抗腫瘤免疫反應(Todo等，2001；Sinkovics等，2000)。這些病毒經改造後還可以在腫瘤內表達治療性目的基因以增強抗腫瘤效應(Hermiston，2000)。但是這種治療方法還存在一些主要的限制。雖然某些種類的病毒已被證明具有一定程度的腫瘤選擇性，但是這種新方法還需要將瘤溶解病毒改造和/或增強其腫瘤選擇性以使其安全性達到最高。當通過靜脈注射時以及當具有潛在毒性的治療基因插入到這些病毒中以增強其抗腫瘤能力時這種選擇性尤其重要；基因的表達也要只限於正常組織。另外，通過其他機制如誘導抗腫瘤免疫反應或靶向到腫瘤相關血管以增強抗腫瘤能力也是值得讚許的。因此，需要找到一種更有效的並且毒性較低的癌症治療措施。使用瘤溶解病毒進行治療是一個克服上述缺點的領域。因此，本發明的目的在於解決這些問題。發明概述本發明基於以下發現痘病毒經改造後可以1)產生出對不同細胞群或不同類型的組織有不同影響的物質和/或2)產生出具有更高感染性並且通過從感染細胞內釋放出來而能夠感染其他細胞的痘病毒。本發明的痘病毒，如痘苗病毒的Copenhagen株，可以和其他治療措施(如化療)產生協同效應，通過靶向到腫瘤的血管產生有益的療效而不會對抗或抑制TNF和/或INF通路。需要說明的是痘苗病毒的任何病毒株都可以使用。在某些實施方案中，痘苗病毒的Copenhagen株或其衍生物是優選的。在一些實施方案中，痘病毒對靶細胞具有較高的毒性或治療效應，而對於其他的非靶細胞來說是相對無毒的，這是通過抗病毒反應將非靶細胞區分開來。這種病毒可用於在靶細胞內表達痘病毒或異源肽或多肽，從而導致這些細胞發生致命性感染。特別需要注意的是對於非靶細胞或非靶組織來說，痘病毒是「減毒的」，即該病毒的毒力是減弱的、降低的、下降的、被抑制的或被去除的，包括其介導宿主內源性抗病毒反應的能力。因此，本發明涉及包含痘苗病毒的組合物和方法，其中的痘苗病毒經過改造，使其可用於處理細胞或組4織，這些細胞或組織產生抗病毒反應的能力已被消除，而對於可誘導產生有效的抗病毒反應的正常細胞或組織來說，這些病毒是無效的。本發明的方法特別優選使用這種痘苗病毒來治療癌細胞或腫瘤。本發明的病毒被認為是可以溶解腫瘤的並且其安全性得到提高和/或可被正常組織加速清除，其機制在於與非正常細胞(如癌細胞或癌組織)相對應的正常細胞具有產生抗病毒反應的能力(如擁有、產生和/或誘導免疫反應)。正常細胞或組織具有這種能力，而癌細胞或癌組織通常不表達、或低水平表達可誘導或參與抗病毒反應的細胞蛋白。這種細胞蛋白包括幹擾素、TNF、趨化因子、細胞因子以及其他因子。在正常細胞或組織內，激發抗病毒免疫反應能力下降的減毒病毒可以很容易地被清除；但是在非正常細胞和/或組織內抗病毒反應減弱，因此即使是減毒的病毒也不能被有效清除。本發明某些實施方案的基礎就是本文所討論的病毒是一種經改善的治療方式，如增強其在正常細胞內的安全性、降低其毒性，因此這些病毒對正常細胞的影響要小於非正常細胞。因此，減毒病毒在癌細胞內更易複製和表達基因，其中對幹擾素的誘導或反應減弱或缺失。本發明的組合物和方法涉及痘病毒。下面所討論的病毒包含在本發明的組合物和方法中。雖然許多實施方案利用的是痘苗病毒，但是其他痘病毒也可以用同樣的方式製備或使用，因此，涉及痘苗病毒的實施方案也適用於具有相同基因的其他痘病毒或其他病毒。本發明涉及在其病毒基因組內含有一個或多個突變的經改造的痘苗病毒。突變可通過重組基因工程方法引入到病毒內，如隨機突變或將病毒重複傳代。利用重組基因工程將病毒基因組(或病毒基因組前體)改造的病毒被稱為「重組」病毒。突變可以是一個或多個核苷酸殘基的缺失或替代。突變可以在基因內(包括編碼序列和非編碼序列，如轉錄控制序列)，也可以在其他位置。編碼區的突變可產生具有缺失、插入或替代的同源肽或多肽。核酸突變也可以導致移碼突變從而產生出截短的肽或多肽，或者胺基酸序列發生改變的肽或多肽。在本發明的某些實施方案中，痘苗病毒是減毒的，這就需要改造病毒的基因組以使其毒力減弱。突變可影響具有不同功能的多肽。下列類型的多肽中的一種或多種都可以發生突變1)幹擾素調節多肽；2)補體控制多肽；3)TNF或趨化因子調節多肽；4)絲氨酸蛋白酶抑制因子；5)IL-Iβ調節多肽；6)非感染性EEV形式的多肽；以及7)可抑制感染性病毒從細胞內釋放的病毒多肽(抗感染性病毒形式的多肽)。另外，痘苗病毒的A41L或CllR(或其他痘病毒的相應多肽)也可以發生突變。每一類多肽都是直接或間接具有特定功能的多肽。該類多肽的突變不是排他性的，因為一個多肽可能不僅僅具有一種特定的功能。幹擾素調節多肽是指具有影響細胞內幹擾素誘導或活化通路活性的痘病毒多肽。幹擾素參與某些細胞或生物的抗病毒機制。痘病毒表達可抑制這種機制的幹擾素調節多肽。特別需要說明的是這些多肽可抑制、降低或消除這種特殊的抗病毒反應。這些多肽可直接或間接調節、影響、幹擾、抑制、降低、改變或消除幹擾素的活性或功能。幹擾素α、β和Y是幹擾素調節多肽的靶位。幹擾素調節多肽還可以細分為可特異性結合幹擾素的多肽；這種多肽可被稱為幹擾素結合多肽。B18R是一種可溶性的痘苗病毒多肽，是一種幹擾素結合多肽，尤其可與IFNa/β特異性結合。B8R是可與幹擾素、特異性結合的另外一種痘苗病毒多肽。幹擾素調節多肽包括而不限於B18R，在其他病毒株、如痘苗病毒的Copenhagen株中被稱為B19R，痘苗病毒的B8R，B13R,vC12L,A53R和E3L，以及具有相似活性或特徵的其他病毒多肽。幹擾素調節多肽還可以非排他性地分為優先調節IFNa和/或β通路的一類(包括痘苗病毒的B18R、B8R、B13R和vC12L)和調節IFNy通路的一類(包括痘苗病毒的B8R、B13R和vC12L)。任何具有免疫抑制功能的其他多肽也包括在內。補體控制多肽是指參與抑制補體介導的細胞殺傷和/或病毒滅活的痘病毒多肽。病毒病原的清除機制包括殺傷被感染的細胞或者通過補體依賴的機制滅活宿主內的病毒顆粒。特別需要說明的是這些多肽可抑制、降低或消除這種特殊的抗病毒反應。這些多肽可直接或間接調節、影響、幹擾、抑制、降低、改變或消除補體的活性或功能。補體控制多肽包括而不限於痘苗病毒的VCP，也被稱為C3L或C21L，以及具有該特性或功能的其他多肽(術語「功能」和「活性」可互換)。TNF調節多肽是指具有影響細胞免疫反應和炎症反應活性的痘病毒多肽，這些免疫反應或炎症反應可通過TNF受體滅活。這種反應包括誘導細胞調亡。痘病毒表達這些TNF調節多肽作為中和TNF介導的病毒清除和/或病毒感染細胞清除的方式。這些多肽具有特異性結合及抑制細胞外TNF的功能，從而抑制病毒的清除。需要特別說明的是這些多肽可抑制、降低或消除這種特殊的抗病毒反應。這些TNF調節多肽可直接或間接調節、影響、幹擾、抑制、降低、改變或消除該機制的活性或功能。因此可使病毒的感染繼續進行、病毒的毒力增強。TNF調節多肽包括而不限於痘苗病毒的A53R和B28R以及具有相似活性或特性的其他多肽。絲氨酸蛋白酶抑制因子(SPI)是指能抑制絲氨酸蛋白酶的痘病毒多肽。這種多肽被稱為serpins。這些多肽可通過其SPI活性抑制調亡誘導分子引起的調亡，因此即使在存在抗病毒調亡誘導細胞因子、fas、粒酶或其他調亡刺激因子的情況下也允許病毒複製。SPI包括而不限於痘苗病毒的B13R和B22R以及具有相似活性或特性的其他多肽。IL-Iβ調節因子是指能直接或間接影響IL-I激發的抗病毒反應的痘病毒多肽。IL-I可直接作用於B細胞，促使其增殖和合成免疫球蛋白。IL-I還可以作為一種啟動因子使B細胞對IL-5產生反應。IL-I可刺激NK細胞和成纖維細胞、胸腺細胞、膠質母細胞的增殖和活化。IL-18調節因子是指能直接或間接影響IL-18激發的抗病毒反應的痘病毒多肽。IL-18可誘導IFNγ和/或誘導T細胞和NK細胞的活化。這些IL-Iβ或IL-18調節因子可直接或間接調節、影響、幹擾、抑制、降低、改變或消除該機制的活性或功能。需要特別說明的是這些調節多肽可抑制、降低或消除這種特殊的抗病毒反應。IL-Iβ調節多肽包括而不限於痘苗病毒的B13R和B15R以及具有相似活性或特性的其他多肽。需要說明的是突變的其他IL-I調節因子也是本發明的一部分。IL-18調節因子包括而不限於vC12L和其他多肽。抑制感染性病毒從細胞內釋放的病毒多肽、抗感染性EEV形式的多肽是指直接使感染性EEV形式的痘苗病毒不產生的病毒多肽。例如，約束或抑制EEV形式從細胞膜釋放的多肽是抑制抗感染性EEV形式的多肽。參與調節病毒EEV形式的多肽包括而不限於痘苗病毒的A34R和B5R以及可影響痘病毒EEV形式形成的各種其他蛋白質。A34R上的密碼子151突變使賴氨酸替換成天冬氨酸(K151D突變)的突變可使A34R蛋白抑制EEV形式的病毒到達細胞膜的能力下降。本發明痘病毒內的其他突變包括編碼C11R、病毒EGF樣蛋白、A41L、B7R、NlL和/或vCKBP的基因上的突變，這些蛋白可能具有趨化因子結合活性(美國專利5，871，740和Seet等，2001，本文已納入作為參考)。對於vCKBP的描述見美國專利5，871，740和Seet等，2001，本文都已納入作為參考。另外需要說明的是，本發明的病毒還可以具有病毒基因組的缺失突變以便於插入異源核酸序列。這些缺失突變可以發生在非必須區，或者與輔助病毒或宿主細胞互補的必須區。在某些實施方案中，痘病毒、特別是痘苗病毒在編碼幹擾素調節多肽的第一基因上至少包含一個突變從而產生出至少缺乏第一幹擾素調節功能的病毒。在其他的實施方案中，突變發生在編碼可直接結合幹擾素的幹擾素調節蛋白的基因上。需要說明的使幹擾素結合多肽可以是B8R和/或B18R。其他比較常見的類型也可以應用。突變也可以發生在下列一種或多種多肽上1)抑制免疫反應組分的分泌型病毒因子(如TNF和其他細胞因子；趨化因子，補體級聯蛋白；幹擾素α/β和y；白細胞介素如IL-I和IL18；A41L;N1L;vC12L和C11R)；2)可抑制調亡的細胞內病毒因子(如絲氨酸蛋白酶抑制因子)和/或抑制免疫活化的細胞內病毒因子(如B13R、B22R和B7R)；以及3)可抑制感染性病毒從細胞內釋放的病毒多肽。這些種類的突變是非排他性的，因為一種蛋白可能不僅僅具有一種特定的功能。在整個申請文件中術語「缺乏X功能的病毒」是指該病毒至少缺乏蛋白質X的一種功能。如果蛋白質X在正常情況下具有兩種功能，那麼缺乏X功能的病毒就是指該病毒至少缺乏多肽X的兩種功能之一。功能的缺失可通過各種方式達到，其中包括編碼多肽X的核酸、或者參與其表達的核酸區相對於具有功能性多肽X的病毒來說是突變的。另外，這個術語並不意味著該病毒缺乏所有的X功能，但是在其基因組內有突變從而使多肽所具有的X功能1)不再表達或者2)對於功能X來說不再具有活性(多肽仍可以具有其他的完整功能)。本發明的痘苗病毒(或其他痘病毒)在下列7類基因中的一類或多類基因中可以具有修飾或突變1)編碼幹擾素調節多肽的基因(包括而不限於B8R、B18R、B13R、E3L和/或VC12L)，這些基因上的突變可導致病毒至少缺乏一種幹擾素調節功能；2)編碼補體控制多肽的基因(包括而不限於VCP)，該基因的突變可導致病毒至少缺乏一種補體調節功能；3)編碼TNF調節多肽的基因(包括而不限於A53R和B28R)，這些基因的突變可導致病毒至少缺乏一種TNF調節功能；4)編碼絲氨酸蛋白酶抑制因子的基因(包括而不限於B13R、B22R和/或K2L)，這些基因的突變可導致病毒至少缺乏一種絲氨酸蛋白酶抑制因子的功能；5)編碼IL-Ιβ調節多肽的基因(包括而不限於B15R)，這些基因的突變可導致病毒至少缺乏一種IL-Iβ調節多肽的功能；6)編碼多肽的基因(包括而不限於B5R和/或A34R)，這些基因的突變可導致感染性EEV形式的痘苗病毒增多；或7)C11R、vCKBP、B7R、NIL和/或A41L。本發明的其他痘苗病毒也可以發生突變使病毒缺乏vC12LIL-18調節功能。另外，這種病毒還可以在上述7類基因的任何一類上發生突變。需要說明的是本發明的病毒可在一類多肽的不止一個基因上發生突變，因此，病毒基因組可在同一類多肽上發生1、2、3、4、5或更多個多肽的突變而使其缺乏該類多肽的功能。需要進一步說明的是，本發明的病毒也可在不止一類多肽上發生突變。因此，病毒基因組可在編碼1、2、3、4、5、6、7或8類多肽的基因上發生突變從而使病毒缺乏編碼多肽的相7應功能。另外，本發明的病毒可在同一類多肽及不同類多肽的多個基因上發生突變。本申請中上面所討論的基因及其編碼多肽是突變的優選靶位，通過這些突變可使本發明的痘苗病毒缺乏那些特定的多肽及相應的功能。而且，有關痘苗病毒的任何突變不需要額外的試驗就可以用於其他痘病毒。可以被突變或者可以使其至少一種功能喪失的特異性痘病毒多肽包括而不限於A34R、A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、Cl1R、E3L、K2L、NIL、vC12L及vCKBP。因此，本發明的痘病毒可在編碼這些相應的痘苗病毒多肽的基因中的一個或多個上引入突變。在本發明的痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使A34R的至少一個功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個多肽的至少一個功能喪失的突變A41L、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、K2L、NIL、vC12L禾口/或vCKBP。在本發明的其他痘苗病毒中，痘苗病毒可引入使A41LR的至少一個功能喪失的突變和使下列多肽中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個多肽的至少一個功能喪失的突變A34R、A53R、B5R、B7R、B8R、B13R、B15R、B18R、B22R、B28R、B29R、C11R、E3L、1(21^、附1^、2，000/mm3』血小板絕對值為100，000/mm3)、適當的肝功能(膽紅素<1.5mg/dl)和適當的腎功能(肌氨酸酐4cm的腫瘤來說，注射的量約為4-10ml(優選IOml)，而對於50%的人源腫瘤中轉錄因子；檢查點控制；有突變，包括遺傳性的調亡Li-Fraumeni症候群PRAD1/BCL1與甲狀旁腺激素或IgG甲狀旁腺腺瘤；B-CLL細胞周期素D易位RB遺傳性的視網膜母細胞視網膜母細胞瘤瘤；骨與細胞周期素/cdk相互作瘤；與許多DNA病毒腫肉瘤；乳腺癌；偶見於用；調節E2F轉錄因子瘤抗原相關其他癌XPA著色性幹皮病；易感性切除修復；光產物識別；的皮膚癌鋅指結構實施例下面的實施例用於證明本發明的優選實施方案。本領域的熟練技術人員應該知道，下面實施例中所描述的技術代表了發明者發現的技術，它們在本發明的實踐中發揮了很好的作用，因此被認為構成了實現本發明的優選實施模式。但是，本領域的那些熟練技術人員根據本說明書可以對本文所描述的特定實施方案作出修改，只要不脫離本發明的精神和範圍一樣可以得到類似的或相同的結果。實施例1痘苗病毒在細胞系內的擴增本實施例評價了含16種不同常規痘苗病毒實驗室株/突變株(和兔痘病毒及其他痘病毒)的一組病毒Copenhagen>Dairen>Evans>USSR>Tashkent>TianTan、WR、IHD-J、IHD-W,Lister,NYCBOH,Patwadangar,King和WR突變株B8R、B18R、B13R。評價了這些病毒株在癌細胞和正常細胞內的複製能力。優選的病毒應該是在癌細胞內相對高複製而在正常細胞內弱複製的病毒(即在腫瘤和正常細胞之間有較大的治療比或指數)。共檢測了兩個人源腫瘤細胞系A2780結腸癌細胞系和HCT116結腸癌細胞系(美國模式培養物保藏所)。正常細胞包括正常的人支氣管上皮細胞(NHBE)。為了測定病毒的細胞致病效應，使增殖的細胞生長到70%匯合時(含2%FBS的DMEM)轉染0.001到10感染單位(MOI)的病毒。5到6天後培養皿用MTT(Promega)染色，然後測定吸光度值。正常細胞在生長到完全匯合後使其停止增殖，隨後用含0.2%FBS的DMEM培養。通過細胞周期分析和細胞計數來確定增殖是否停止。每個樣品測定4次，試驗至少重複兩次。在病毒複製試驗中，細胞生長(37°C、5%CO2、含2%FBS、NHBE細胞生長因子的DMEM，如Heise等，(2000)所描述)到70%匯合後用1或10感染單位(Μ0Ι，每個細胞感染的病毒量)的病毒感染。在培養基中孵育3小時後換液。48小時後(以前的數據表明痘苗病毒的複製在這個時間點達到峰值)收穫細胞和上清用於病毒滴度分析。經3輪冷凍和融解後獲得細胞裂解物，隨後在超聲/水浴中進行30秒的脈衝。然後通過蔗糖墊純化病毒，上清液和裂解物的系列稀釋物用BSC-I細胞測定病毒的滴度(純化和滴度測定方法見Alcami和Smith(1995)的描述)。典型的結果顯示在圖1-4中。痘苗病毒Copenhagen株在兩個腫瘤細胞系內的複製水平都等於或超過本試驗中的其他所有病毒(圖IA和IB；y-軸代表噬菌斑形成單位/ml+/-S.E.)。相反，在正常人源細胞中Copenhagen株的毒力比其他病毒都弱(圖2)。最後，所有病毒在癌細胞和正常細胞內爆發的比值顯示在圖3(A2780=NHBE)和圖4(HCT116NHBE)中。Copenhagen株在A2780(P<0.001)和HCTl16(ρ<0.001)中的爆發比例都明顯升高。Copenhagen株在兩株細胞內的爆發比例分別約為20，000和30，000，而其他病毒的爆發比例都低於5000，最少的低於2000(如Lister和Wyeth株)。同樣，體外細胞致病效應分析發現Copenhagen對A2780和HCTl16的腫瘤細胞殺傷活性明顯高於或等於Lister株和NYCBOH株。實施例2痘苗病毒/紫杉醇聯合治療雖然有些病毒如腺病毒和HSV已被用於和化療藥聯用，但是痘苗病毒還沒有進行過這樣的試驗(包括Copenhagen株)。痘苗病毒經改造後表達前藥活化酶(如胸苷激酶)，與相對無毒的前藥聯合應用時可通過前藥活化基因產物活化前藥而使其變成有毒性的藥物(Puhlmann等，2000)。被批准用於治療癌症患者的標準細胞毒化療藥物與痘苗病毒之間的協同作用是痘病毒，包括痘苗病毒和特異性的Copenhagen株的一個優越特性。紫杉醇(a.k.a.紫杉醇)在美國和歐洲已被批准用於治療癌症患者。痘苗病毒Copenhagen株與紫杉醇聯合處理HCT116和LNCaP癌細胞系。等效線圖解法作圖和分析結果表明痘苗病毒和紫杉醇有協同效應(圖5)。等效線圖解結果得自MTS試驗數據，如CellTiter96Aqueous非放射性的細胞增殖分析(Catalog#G542LPromegaCorp.，Madison，WI)，如圖6、7、8和9中所顯示的細胞存活率。如果沒有協調效應，也沒有拮抗作用，圖5中所有的數據點都位於代表數據點預期位置的線以下，因此這些數據點說明了痘苗病毒和紫杉醇對這些癌細胞系殺傷作用的協同效應。本方法包括在96孔培養板中培養細胞系，培養條件為5%C02、37°、含10%FCS的DMEM。細胞生長到約50%匯合時用含2%FCS的DMEM換液，然後用紫杉醇(劑量範圍為3XIO"8到3X104nM，對數增量)和/或病毒(WCopenhagen株，MOI為每個細胞10_6到IO5病毒顆粒)處理。細胞分為四組，分別用1)空白處理，2)只用病毒處理，3)只用紫杉醇處理，4)病毒處理後再用紫杉醇處理。細胞共感染6天，然後進行MTS分析(Promega，WI,USA，參見廠家的說明書)。細胞用紫杉醇共處理6天，然後進行MTS分析(參見廠家的說明書)。進行聯合處理的細胞感染病毒的方式與病毒單獨處理組一樣，然後立刻再用紫杉醇處理(固定比例的病毒紫杉醇)。然後按照上述方法分析細胞。MTS細胞存活率數據表示為對照細胞存活率的百分比，如圖6、7、8和9中所示。協同效應評價的數據分析方法(等效線圖解法作圖和分析)見Nielsen等(1997、1998)的描述。簡言之，製作劑量效應曲線，計算出每個細胞系(與未處理細胞比較)每個細胞(即，以及所有的試驗條件)的EC5tl值。每種藥物檢測9個濃度(見上)，單獨使用或聯合使用。每個試驗包括W/紫杉醇的4個不同稀釋比例(3、33、333、3333)。製作等效線圖以確定是否存在協調效應或拮抗作用。每個數據點代表3個重複的樣品。實施例3痘苗病毒灃射導致的腫瘤抑制在C57B/6小鼠腹側皮下注射懸浮於100μ1PBS中的5X105CMT_64細胞或106CMT-93細胞使其形成小鼠皮下腫瘤異種移植物。在第一組試驗中，攜帶B8R和B18R突變的WR株痘苗病毒注射到具有免疫力的C57/B6小鼠腹側皮下CMT-93腫瘤內(估計基線腫瘤大小為40-100μ1)，劑量為IO4到IO8病毒顆粒，懸浮於40μ1液體中，分別於1、3和5天注射。在腫瘤的中心刺一個針孔，在腫瘤的四個象限中分別刺出一個針孔。當針頭退出時約有1/4的液體進入到每個針孔內。對照組用補骨脂素-UV滅活的病毒和PBS處理，處理方式與治療組一樣。每兩周測量一次腫瘤的大小，得到二維數據，腫瘤的體積用如下公式計算(長)X(寬)X(寬)X(3.14/6)。通過與注射溶劑和滅活病毒的對照組腫瘤相比可以發現治療組出現了明顯的抗腫瘤效應，生存期延長，並且可以觀察到劑量-效應關係。10隻用IO8和IOkiBSR突變VV處理的小鼠中有8隻的腫瘤被完全抑制，在整個試驗過程中處於無瘤狀態(共3個月)。10隻接收相同劑量B18R注射的小鼠中有9隻的腫瘤被完全抑制，在同樣的試驗周期內處於無瘤狀態。而在對照組中只有1隻小鼠的腫瘤被完全抑制。平均生存期為2周，處理後24天處死所有的小鼠。IO8到IOki顆粒治療組的小鼠生存期明顯延長(KM生存期分析；時序檢驗；P<0.01)。觀察動物的總體狀況(如活動情況，皮毛起皺情況)，每周稱重2次；結果未發現明顯的體重變化或總體狀況改變。然後在CMT-64鼠腫瘤異種移植模型上利用B18R和對照溶劑實施相同的處理/注射方案。雖然沒有觀察到完全的反應，但是由於腫瘤生長而需要處死動物所需的延遲時間，在B18R處理組和補骨脂素-UV滅活病毒組之間有顯著差異(平均值約為2周對4周；P<0.05，時序檢驗，Kaplan-Meier分析由於腫瘤生長而需要處死動物的時間)。實施例4有關鼠腫瘤異種移植物的EEV-增強效應在具有免疫力的BALB/c小鼠腹側皮下注射懸浮於100μ1PBS中的5XIO5JC鼠乳腺癌細胞使其形成小鼠皮下腫瘤異種移植物。腫瘤一旦達到可注射的尺寸(基線腫瘤大小40-100μ1)，就將WesternReserve(無IHD-J突變的WR)W、IHD-J突變的WR(A34R/K151D突變)病毒或PBS注射到皮下JC腫瘤內。病毒劑量為每天IOw病毒顆粒，懸浮於40μ1PBS中，分別於1、3和5天注射(每個治療組含8隻小鼠)。PBS對照組用相同的方式處理。在腫瘤的中心刺一個針孔，在腫瘤的四個象限中分別刺出一個針孔。當針頭退出時約有1/4的液體進入到每個針孔內。對照組用PBS處理，處理方式與治療組一樣。每兩周測量一次腫瘤的大小，得到二維數據，腫瘤的體積用如下公式計算(長)X(寬)X(寬)X(3.14/6)。與PBS處理組和WesternReserve處理組相比，IHD-J處理組出現了明顯的抗腫瘤效應(腫瘤生長延遲和腫瘤縮小)，由於腫瘤生長而需要處死動物的時間(即生存期)明顯延長。根據Kaplan-Meier生存期分析，通過時序檢驗(用於比較存活曲線)發現，IHD-J組由於腫瘤生長而需要處死動物的時間(生存期)比PBS(ρ<0.05)和WR(ρ<0.05)組明顯延長。兩個對照組的平均存活時間為2周，而IHD-J組的平均存活時間為4.5周。治療組內的所有小鼠都未出現明顯的系統毒性反應，也沒有動物因處理而死亡。IHD-J突變可顯著提高抗腫瘤效應(與無IHD-J突變的WR病毒相比)，並且毒性效應沒有升高。腫瘤可在皮下生長，長到直徑2-6mm時可開始處理。實施例5〒髓-齢;S剛·頻IFN而樹牛_胞藤鼎撤仔if·胞郝胃利用試驗來分析缺失幹擾素(IFN)結合基因的痘病毒與野生型對照痘病毒相比是否具有更高的腫瘤特異性，在正常細胞內的複製能力是否減弱。比較WR(WesternReserve)和B18R基因(B18R)缺失的WR突變株在存在或缺少IFN-α(1，000單位/ml，體外感染後5小時加入)的情況下的複製情況(圖10)。試驗細胞為正常人支氣管上皮細胞(NHBE，CloneticsCorp.，USA)、C33A人宮頸癌細胞(ATCC)和HCT116人結腸癌細胞(ATCC)。在預試驗中，這些細胞在病毒感染前用IFN(5，000單位/ml)預處理24小時以確定其對幹擾素抗病毒複製效應的敏感性。和預想的一樣，兩種病毒對幹擾素預處理抑制效應的敏感性是一樣的。NHBE和HCT116細胞是幹擾素敏感性的，因為IFN預處理後病毒的複製明顯減少；C33A細胞是幹擾素耐受性的，因為IFN預處理對病毒的複製沒有明顯影響。癌細胞用含10%FCS的DMEM培養；正常細胞用廠商說明書描述的含血清添加物的DMEM培養。當細胞生長到70%匯合時，每個細胞用10病毒感染單位(moi)的病毒感染。感染後5小時，IFN或者以1，000單位/ml的濃度添加到培養基中(添加IFN的細胞)，或者不添加IFN(不添加IFN的細胞)。感染後48小時收穫細胞及其裂解物，然後分離痘苗病毒病測定病毒的滴度(噬菌斑形成單位的確定)(用BS-C-I細胞測定滴度，如Tscharke等，2002所描述，本文已納入作為參考)。如圖10所示，在IFN存在的情況下，含有B18R突變的痘苗病毒在兩株IFN敏感細胞，包括NHBE，內的複製被明顯抑制(ρ<0.01，斯氏t_檢驗，與不含IFN的相比)。相反，這個突變病毒在IFN耐受C33A癌細胞內的複製不被抑制。正如所預料的，野生型WR不受IFN處理的影響，因為該病毒能產生功能性B18R基因產物(P=0.8)。利用其他的IFN耐受癌細胞系可得到相似的結果。因此，與野生型病毒相比，IFN結合基因B18R的缺失可導致治療指數的增加，保護正常細胞不受損傷。在鼠腫瘤異種移植模型上也證明了B8R和B18R上的IFN結合突變可產生抗腫瘤效應。由B18R和/或B8R缺失導致的相對安全性的提高在小鼠體內是被低估的，因為鼠的靶IFN分子的親和力顯著降低(Symons等，2002)。其他一些試驗是在兔或非人靈長類動物體內進行的，注射方式為真皮內注射，方法見Symons等的描述，所得到的結果與文獻報導的兔試驗結果一致(與野生型對照病毒相比，B8R突變的痘苗病毒可增加炎症細胞的積聚，從而可以加速病毒從皮膚損傷部位的清除)。因此，抗腫瘤效應和從正常細胞加速病毒清除的效應在體外和體內都得到證實(Symons等)。57實施例6予磁丨祝TNF含有和不含有一個或多個細胞因子或趨化因子抑制基因缺失/滅活的病毒對(如野生型WR及其B29R/VCKBP缺失的突變株)用於感染具有免疫力的小鼠(C57B/6或BALB/c)體內的鼠腫瘤(如CMT-93、CMT-64或JC)。這種比較只在病毒基因產物抑制鼠細胞因子/趨化因子的程度與抑制人細胞因子/趨化因子的程度一樣時才有效。靜脈注射和/或瘤內注射病毒(病毒顆粒為IO5到101(1，注射1到6次)後檢測腫瘤組織和正常組織內病毒複製的情況(不同時間點得到的噬菌斑形成單位)、CC趨化因子水平(如免疫組化染色或ELISA分析)、細胞因子水平(如免疫組化(IHC)染色或ELIS分析)以及炎症細胞浸潤的情況(H和E或IHC染色)。另外，還要測定兩種病毒的抗腫瘤效應(Kaplan-Meier腫瘤抑制/存活曲線)和毒性(體重下降情況；血液學指標；血清生化指標)。結果將是突變病毒1)抗腫瘤效應提高，腫瘤內的炎症誘導反應加強(如免疫效應細胞增多)；在正常組織內的複製能力和毒性與野生型病毒一樣或降低(如肝、脾、肺和/或腦)；3)對腫瘤特異性的細胞免疫反應的誘導增強或維持原水平。最後，化療和/或放療聯合突變病毒比聯合野生型病毒所達到的抗腫瘤效應有望得到提高。還可以在兔或非人靈長類動物體內進行毒性試驗以進一步確定本發明病毒的特徵(Tscharke等，2002，本文已納入作為參考)。實施例7予磁丨祝IFNi腦力·頓弓細躺含有和不含有一個或多個幹擾素結合多肽缺失/滅活的病毒對(如野生型WR痘苗病毒及其B18R缺失的突變株)用於感染具有免疫力的小鼠體內的腫瘤，如上述實施例所討論的，其靶IFN分子可被痘苗病毒基因產物有效結合。需要指出的是，由於鼠幹擾素與人幹擾素相比對VV多肽具有一定的耐受性，因此在小鼠體內得到的效果可能比人體內的效果弱。如上所述，靜脈注射和/或瘤內注射病毒後檢測腫瘤組織和正常組織內的病毒複製和擴散情況。另外，還要測定兩種病毒的抗腫瘤效應和毒性。預期結果是突變病毒在正常組織內的複製能力和毒性降低(如肝、脾、肺和/或腦)，但是在腫瘤內依然可以複製並誘導腫瘤壞死。野生型痘苗病毒(如WR)在正常組織和腫瘤組織內的複製/誘導壞死的能力差異較小。另外，與鹽水處理的對照腫瘤和野生型病毒處理的對照腫瘤相比，用突變病毒處理的腫瘤血管形成能力下降(如在等量的血管標記物上通過H和E染色，CD31的免疫組化染色)。最後，化療和/或放療聯合突變病毒比聯合野生型病毒所達到的免疫介導的抗腫瘤效應和療效有望得到提高。還可以在兔或非人靈長類動物體內進行毒性試驗以進一步確定本發明病毒的特徵(Tscharke等，2002，本文已納入作為參考)。實施例8予頁it+牛實施例、昆示絲Mifg白Sfeffl泡丨因子Iil能喪失所弓丨走己的效應如上所述，含有和不含有抗調亡基因缺失/滅活的病毒對用於感染具有免疫力的小鼠體內的腫瘤。病毒包括而不限於表達或不表達B13R(SPI-2)的痘苗病毒。如上面所描述，靜脈注射病毒後檢測腫瘤組織和正常組織內病毒的複製和擴散情況。另外，在瘤內和/或靜脈注射病毒後按照上述方法評價突變病毒的抗腫瘤效應和毒性。預期結果是突變病毒在正常組織內的複製能力和毒性下降，和/或在正常組織內被清除的速度快於腫瘤組織。野生型病毒在正常組織和腫瘤組織內的複製能力和毒性的差異(如果有)較小。瘤內、腹腔內、靜脈或其他途徑注射病毒以後，突變病毒的抗腫瘤效應有望能達到或超過野生型病毒的抗腫瘤效應。聯合化療研究用的是同一個模型系統。小鼠分別接受對照藥(安慰劑)、單獨的化療藥、單獨的病毒(野生型或突變型)或病毒加化療藥處理。突變病毒加化療藥的療效有望高於單獨的化療藥和野生型病毒加化療藥的療效。病毒聯合放療也可能得到同樣的結果。實施例9予磁■■讓通側棚■頓弓細躺如上所述，含有和不含有VCP基因缺失/滅活的病毒對用於感染具有免疫力的小鼠體內的腫瘤。如上面所描述，靜脈或其他途徑注射病毒後檢測腫瘤組織和正常組織內病毒的複製和擴散情況。另外，在瘤內和/或靜脈注射病毒後按照上述方法評價突變病毒的抗腫瘤效應和毒性。預期結果是突變病毒在正常組織內的複製能力和毒性下降，和/或在正常組織內被清除的效率高於腫瘤組織。野生型病毒在正常組織和腫瘤組織內的複製能力和毒性的差異(如果有)較小。瘤內、腹腔內、靜脈或其他途徑注射病毒以後，突變病毒的抗腫瘤效應有望能達到或超過野生型病毒的抗腫瘤效應。聯合化療研究用的是同一個模型系統。例如，小鼠分別接受對照藥(安慰劑)、單獨的化療藥、單獨的病毒(野生型或突變型)或病毒加化療藥處理。突變病毒加化療藥的療效有望高於單獨的化療藥和野生型病毒加化療藥的療效。腫瘤靶向性的單克隆抗體聯合病毒也可能得到同樣的結果。氺氺氺氺氺氺氺氺氺根據本說明書，本說明書和權利要求書所描述的所有組合物和方法無需特別的試驗就可以製備和實施。本發明的組合物和方法是利用優選實施方案來描述的，但是，本領域的技術人員在不背離本發明的概念、精神和範圍的情況下，可以對本發明的組合物和/或方法以及本文所描述的方法的步驟或步驟的順序作出改動。更具體地說，本文所描述的因子可用某些化學和物理相關的因子代替，但是可以得到相同或相似的結果。對於本領域技術人員來說很明顯的是，所有這種相似的替代和修改都被認為包含在權利要求所定義的本發明的精神、範圍和概念之內。參考文獻下面的文獻都已特地納入本文作為參考。美國專利4，554，101美國專利4，683，195美國專利4，683，202美國專利4，684，611美國專利4，800，159美國專利4，879，236美國專利4，883，750美國專利4，946，773美國專利4，952，500美國專利5，220，007美國專利5，279，721美國專利5，284，760美國專禾5916776美國專禾5916779美國專禾5919626美國專禾5919630美國專禾5922574美國專禾5925517美國專禾5925525美國專禾5925565美國專禾5928862美國專禾5928869美國專禾5928870美國專禾5928905美國專禾5928906美國專禾5928906美國專禾5929227美國專禾5932413美國專禾5932451美國專禾5935791美國專禾5935819美國專禾5935825美國專禾5939291美國專禾5942391美國專禾5945100美國專禾5981274美國專禾5994624Alcami和Smith,Cell.，71(1):153_67，1992.Alcami等，Sem.Virol.，5:419_427，1998.Alcami等，Virology，74(23):11230_9，2000.Almendro等，J.Immunol.，157(12):5411_5421，1996.Andoh等，CancerImmunol.Immunother.,50(12):663_72，2002.Angel等，Mol.Cell.Biol.，7:2256，1987.Angel等，Cell,49:729，1987b.Angel等，Mol.Cell.Biol.，7:2256，1987a.Arap等，CancerRes.，55(6)1351-1354，1995.Atchison禾口Perry，Cell，46:253，1986.Atchison和Perry，Cell，48121,1987.Austin-Ward和Villaseca,Rev.Med.Chil.，126(7):838_45，1998.Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,John,Wiley&Sons,Inc,NewYork,1994.Bajorin等，J.Clin.Oncol.，6(5):786_92，1988.Bakhshi等，Cell.,41(3):899_906，1985.Banerji等，Cell.，27(2Pt1):299_308，1981.Banerji等，Cell.，33(3):729_740，1983.Bellus,J.Macromol.Sci.PureAppl.Chem.，A31(1)1355—1376，1994.Berkhout等，Cell,59:273_282，1989.Blanar等，EMBOJ.，8:1139，1989.Blasco和Moss，J.Virology，66(7):4170_4179，1992.Blasco等，J.Virology，67(6):3319_3325，1993.Bodine和Ley,EMBOJ.，6:2997，1987.Boshart等，Cell，41:521，1985.Bosze等，EMBOJ.,5(7)1615-1623，1986.Boyd等，Cell.,79:341_351，1994.Braddock等，Cell,58:269，1989.Braisted和Wells，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93(12):5688_5692，1996.Brizel,Semin.Radiat.Oncol.,8(4):237_246，1998.Bukowski等，Clin.CancerRes.，4(10):2337_47，1998.Bulla禾ΠSiddiqui,J.Virol.,62:1437，1986.Burton禾口Barbas，Adv.Immunol.，57191-280，1994.Caldas等，Nat.Genet.，8(1):27_32，1994.Campbell和Villarreal，Mol.Cell.Biol.，8:1993，1988.Campere禾口Tilghman,GenesandDev.,3:537,1989.Campo等，Nature,303:77，1983.Caragine等，CancerRes.,62(4):1110_5，2002.Carbonelli等，FEMSMicrobiol.Lett.，177(1):75_82，1999.Celander和Haseltine,J.Virology,61-.269,1987.Celander等，J.Virology,62:1314，1988.Chandler等，Cell,33:489，1983.Chandler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(8):3596_601，1997.Chang等，Mol.Cell.Biol.，9:2153，1989.Chatterjee等，ProcNatl.AcadSci.U.S.A.，86:9114，1989.Chen和Okayama,Mol.CellBiol.，7(8):2745_2752，1987.Cheng等，CancerRes.，54(21):5547_5551，1994.Choi等，Cell，53:519，1988.Christodoulides等，Microbiology，144(Pt11):3027_37，1998.Cleary和Sklar，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(21):7439_7443，1985.Cleary等，J.Exp.Med.，164(1):315_320，1986.Cocea,Biotechniques,23(5):814_816，1997.Cohen等，J.Cell.Physiol.，5:75，1987.63Colamonici等，J.Biol.Chem.，27015974-15978，1995.Cooley等，Science，239(4844):1121_1128，1988.Costa等，Mol.Cell.Biol.，881,1988.Cripe等，EMBOJ.，6:3745，1987.Culotta禾口Hamer,Mol.Cell.Biol.，9:1376，1989.Culver等，Science,256(5063)1550-1552，1992.Cunningham和Wells，Science，244(4908)1081-1085，1989Curran,Semin.Radiat.Oncol.,8(4Suppl1)2~4,1998.Dandolo等，J.Virology,47:55_64，1983.Davidson等，J.Immunother.,21(5):389_98，1998.DeVilliers等，Nature，312(5991)-.242-246,1984.Deschamps等，Science,230:1174_1177，1985.DilIman,CancerBiother.Radiopharm.，14(1):5_10，1999.Dobbelstein禾口Shenk,J.Virology,70:6479_6485，1996.Durrant禾口Spendlove,Curr.opin.Investig.Drugs,2(7):959_66,2001.Edbrooke等，Mol.Cell.Biol.，9:1908，1989.Edlund等，Science,230:912_916，1985.Eliopoulos等，Oncogene，11(7)1217-28，1995.el-Kareh和Secomb，Crit.Rev.Biomed.Eng.,25(6):503_571，1997.Erlandsson,CancerGenet.Cytogenet.,104(1)1-18,1998.歐洲專利申請320308歐洲專利申請329822Feng禾口Holland，Nature，3346178,1988.Firak和Subramanian，Mol.Cell.Biol.，6:3667，1986.Foecking和Hofstetter，Gene，45(1)101-105，1986.Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:3348_3352，1979.Frohman,PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications,AcademicPress,N.Y.,1990.Fujita等，Cell,49-.357,1987.GB申請2202328Genbank登錄號NC_001559Gertig等，Semin.CancerBiol.，8(4):285_98，1998.Gilles等，Cell，33:717，1983.Gloss等，EMBOJ.，6:3735，1987.Gnant等，CancerRes.，59(14):3396_403，1999.Godbout等，Mol.Cell.Biol.，8:1169，1988.Goebel等，Virology,179(1):247_66和517-63，1990.Goodbourn禾口Maniiitis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,851447,1988.Goodbourn等，Cell，45:601，1986.Gopal,Mol.CellBiol.，5:1188_1190，1985.Graham禾口VanDerEb,Virology,52:456_467，1973.Graham等，Virology，229(1)12-24，1997.Greene等，ImmunologyToday,10:272，1989Gross等，GenesDev.,13(15)1899-911，1999.Grosschedl禾口Baltimore，Cell,41:885，1985.Hanibuchi等，Int.J.Cancer,78(4)480-5,1998.Harland和Weintraub，J.CellBiol.，101:1094-1099，1985.Haslinger禾口Karin，Proc.Natl.AcacLSci.USA，82:8572,1985.Hauber禾口Cullen，J.Virology，62:673，1988.Heise等，CancerGeneTher.,6(6)=499-504,1999.Hellstrand等，ActaOncol.,37(4):347_353，1998.Hen等，Nature,321-.249,198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