一個山梨抗寒轉錄因子PubHLH及其應用的製作方法

2023-05-20 02:53:01

一個山梨抗寒轉錄因子PubHLH及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一個山梨抗寒轉錄因子PubHLH及其應用。山梨bHLH類轉錄因子基因PubHLH，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO：1所示，在SEQ?ID?NO：1所示序列的409-2043bp處為該基因的編碼區；其編碼的胺基酸序列如序列表SEQ?ID?NO：2所示。本發明從山梨中克隆到一個新的bHLH基因PubHLH，利用農桿菌介導的遺傳轉化方法將該基因轉化菸草和梨，獲得的轉基因植株抗寒能力明顯提高，經生物學功能驗證，表明本發明克隆的PubHLH基因具有調控抗寒功能。本發明所述的山梨bHLH類轉錄因子基因PubHLH可在植物抗寒性狀改良或構建抗寒轉基因植物中應用。
【專利說明】—個山梨抗寒轉錄因子PubHLH及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於植物基因工程領域，涉及一個山梨抗寒轉錄因子PubHLH及其應用，具體涉及從山梨(Poncirus trifoliata)中克隆得到一個 bHLH(basic helix-loop-helix,喊性螺旋-環-螺旋)家族轉錄因子PubHLH，然後將該基因分別導入到菸草和梨中，獲得的轉基因植株抗寒性明顯提聞。
【背景技術】
[0002]植物經常遭受一系列的環境脅迫，包括乾旱、高溫、低溫、鹽鹼等，其中，低溫是影響作物生長發育和產量及限制植物地理分布最為重要的因素之一。在長期的演化的過程中，植物已經形成一套複雜的機制來應對和適應這些非生物逆境。近二十年來，國內外科學家在對植物響應非生物逆境分子機理解析方面已經取得了長足的進步(Qin et al.，2011)。現在清楚的是，植物逆境響應是一個非常複雜的多個信號途徑的過程。外界脅迫信號由已知或未知的傳感元件識別，激活第二信使(如鈣離子，活性氧和肌醇磷酸鹽)。之後，由不同的信號元件轉導、傳達、放大脅迫信號，最終導致一系列的生理和代謝改變。人們在鑑定參與逆境響應答的信號轉導元件中已經取得了很大的進步。
[0003]前人的研究的表明，在複雜的逆境信號傳導途徑包括了大量的逆境響應基因，根據基因產物的功能大體上可以分為兩類。一類是由直接保護細胞免受損傷的功能蛋白組成，另一類是由在 信號轉導和基因表達起調控作用的調節蛋白組成(Agarwal etal.，2006 ；Chinnusamy et al.，2006 ；Shinozaki and Yamaguch1-Shinozaki2007 ；Lata andPrasad, 2011)。對逆境響應基因的研究不僅能夠了解逆境響應機制，而且也使得人們通過轉基因創造抗性增強的轉基因植物(Wang et al., 2003 ；Qin et al., 2011 ；Lata andPrasad, 2011)。大量研究表明，通過過量表達功能基因和調控因子能夠顯著提高植物的抗逆性。但是，功能基因和轉錄因子在組成性表達的結果可能不同(Agarwal et al.，2006)。與功能基因相比，轉錄因子在提高植物的抗性功能更強大。一個轉錄因子的超表達能夠激活一系列的靶基因，它們可以會一起來共同應對逆境，而不是一個轉入的功能基因起作用。因此，轉錄因子遺傳轉化是植物抗性遺傳改良的一種重要途徑和手段。
[0004]植物基因組擁有大量的轉錄因子；例如，擬南芥中有多於1500個轉錄因子，佔它的基因組將近 6% (Riechmann et al., 2000),其中 bHLH (basic helix-loop-helix,喊性螺旋-環-螺旋)類轉錄因子是調控網絡中重要的成員，該家族蛋白具有bHLH域，HLH區域位於bHLH模體的C端，由約60個胺基酸組成的兩個功能明顯不同bHLH模體組成。HLH模體參與同型二聚體或異質二聚體的形成是由於α-螺旋的相互作用。鹼性區域位於bHLH模體的N端，含有大約15個鹼性胺基酸,它決定著DNA和蛋白互作的特異性(Buck andAtchley, 2003 ;Toledo_0rtiz et al., 2003 ；Li et al., 2006)。bHLH轉錄因子在真核生物中廣泛分布，如在擬南芥和水稻中分別有147和167個基因(Li et al.，2006 ；ToIedo-Ortizet al., 2003) 0在動物中，bHLH家族成員的功能已經被廣泛研究，但在植物中的研究相對較少。自第一個植物bHLH蛋白(Lc)在玉米中被報導(Ludwiget al.，1989)以來，在一些植物中鑑定了部分bHLH轉錄因子。已經表明，植物bHLH蛋白在不同的生物學過程起轉錄調控作用，包括皮毛或根毛髮育(Bernhardt et al., 2003 ；Tominaga-ffada et al., 2012 ；Karas et al., 2009)、葉綠體發育(Monte et al., 2004),類黃酮生物鹼和花青素合成(Nesiet al.，2000 ；Yamada et al.，2011)。一些bHLH蛋白，諸如PIF3 (光敏色素相互作用因子3)、PIF4 及 HFRl 參與光誘導的信號轉導(Ni et al.，1998 ；Huq and Quail, 2002 ；Fairchild etal., 2000) 0然而，植物bHLH轉錄因子在環境脅迫應答方面卻不多。其它與脅迫應答有關的bHLH轉錄因子包括AtbHLH38、AtbHLH39、FIT，它們能被缺鐵所誘導，AtbHLH38、AtbHLH39的過量表達能增強植物對鐵或鎘的吸收(Yuan et al., 2008 ；Lignam et al., 2011 ；ffu etal.，2012)，表明它們在重金屬毒害應答中起作用。此外，水稻的一個bHLH基因也被發現參與乾旱脅迫應答(Seo etal.，2011)。可見，雖然鑑定bHLH基因比較容易，但是預測不同物種中bHLH基因的功能需要花費大量的創造性勞動。
[0005]山梨是梨產業中應用較廣泛的一種砧木，極抗寒，是研究木本植物抗寒性及克隆有關抗寒基因的理想材料。因此，克隆山梨抗寒有關基因是抗寒基因工程的關鍵和基礎。

【發明內容】

[0006]本發明目的是提供一種從極抗寒的山梨(Pyrus ussuriensis)中克隆出的一個bHLH類轉錄因子PubHLH。
[0007]本發明的另一目的是提供該基因的應用。
[0008]本發明的目的通過以下技術方案實現:
[0009]一種山梨bHLH類轉錄因子基因PubHLH，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，在SEQ ID NO:1所示序列的40 9-2043bp處為該基因的編碼區；其編碼的胺基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，它包含1635bp的開放閱讀框，編碼544個胺基酸，等電點為5.8，預測的分子量為58.9kD。
[0010]克隆上述的基因PubHLH的cDNA序列的引物對，其核苷酸序列如下所示:
[0011]正向引物:5』-TTGCTGCCATGCTGCCGAGGCTGAACGGTGGTG-3> (SEQ ID NO:3)；
[0012]反向引物:5』-GGGGTACCCTACACCATGCCATGGAACCCG-3』 (SEQ ID NO:4)。
[0013]含有本發明所述基因PubHLH的重組表達載體，優選以PCAMBIA1302為出發載體。
[0014]含有本發明所述的山梨bHLH類轉錄因子基因PubHLH的宿主菌。
[0015]本發明所述的山梨bHLH類轉錄因子基因PubHLH在植物抗寒性狀改良或構建抗寒轉基因植物中的應用。
[0016]本發明所述的山梨bHLH類轉錄因子基因PubHLH編碼的蛋白在植物抗寒性狀改良或構建抗寒轉基因植物中的應用。
[0017]本發明所述的重組表達載體在植物抗寒性狀改良或構建抗寒轉基因植物中的應用。
[0018]有益效果:本發明從山梨中克隆到一個新的bHLH基因PubHLH，利用農桿菌介導的遺傳轉化方法將該基因轉化菸草和梨，獲得的轉基因植株抗寒能力明顯提高，經生物學功能驗證，表明本發明克隆的PubHLH基因具有調控抗寒功能。本發明為植物抗非生物逆境分子設計育種提供了新的基因資源，為實施綠色農業、節水農業提供新的遺傳資源，該遺傳資源的開發利用有利於降低農業生產成本和實現環境友好。【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是本發明的技術流程圖。
[0020]圖2是本發明的PubHLH基因在低溫脅迫切(4°C處理)下的表達。橫坐標為相應時間點取樣，縱坐標為採用實時定量PCR分析本發明基因的相對表達量。
[0021]圖3是本發明的PubHLH基因亞細胞定位。其中:圖3A，GFP基因(對照)在明場(圖左)、紫外線(UV)光(右)上的成像；圖3B，PubHLH基因在明場(左)、UV光(右)下的成像。 [0022]圖4是本發明的PubHLH基因轉錄激活鑑定。圖4pDEST?32是空載體轉化的酵母在不同培養基上的生長情況；pDEST?32-PubHLH是融合載體轉化的酵母在不同培養基上的生長情況。
[0023]圖5是PMV質粒圖譜
[0024]圖6為一種PubHLH基因轉基因植株的PCR鑑定示意圖。利用PubHLH基因特異引物進行PCR鑑定菸草後TO代轉基因植株。M =Marker, P:質粒pMV-PubHLH，WT:野生型植株，
4、5、9、13:轉基因株系。
[0025]圖7為菸草轉基因植株中外源基因PubHLH的表達量分析(半定量RT-PCR)。WT為野生型，其它作為轉基因系。
[0026]圖8是本發明中實施例轉PubHLH基因株系(#4和#9)及野生型(WT)非轉基因植株(WT)低溫處理表型和成活率統計。其中:圖8A是30天大的菸草植株在室溫生長和0°C處理2天的表型；圖SB是30天大的菸草植株在室溫生長和0°C處理2天的成活離統計。
【具體實施方式】
[0027]以下結合具體實施對本發明做出詳細的描述。根據以下的描述和這些實施，本領域技術人員可以確定本發明的基本特徵，並且在不偏離本發明精神和範圍的情況下，可以對本發明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
[0028]實施例1PubHLH基因克隆及表達分析
[0029]4°C低溫處理下從山梨葉片抽提RNA並反轉錄，所得的第一鏈cDNA用於擴增PubHLH基因全長。擴增基因PubHLH引物對為:正向引物:PubHLH Forward, 5』 -TTGCTGCCATGCTGCCGAGGCTGAACGGTGGTG-3』 (SEQ ID NO:3);反向引物:PubHLH Reverse, 5』 -GGGGTACCCTACACCATGCCATGGAACCCG-3』 (SEQ ID NO:4)。50 μ I 的反應體系中包括 10ng cDNA, IX 緩衝液(TransStart FastPfu Buffer), 1mM dNTP, IU Taq 聚合酶(TransStart FastPfu DNAPolymerase)(前述緩衝液和Taq聚合酶購自TRANS公司)，1.0 μ M上述引物。PCR反應在Roche480 (Applied B1system)擴增儀上按以下程序完成:95°C，I分鐘，95°C變性20秒，58°C退火20秒，72°C延伸60秒，40個循環；循環完成後72°C延伸5分鐘。產生一條單一PCR條帶產物，經I %的瓊脂糖凝膠電泳後，用E.Z.N.Ag' DNA凝膠回收試劑盒(購自Omega公司，美國)回收特異帶，提取步驟參照使用說明。回收純化的DNA溶液與pMDlS-T載體(購自TaKaRa公司)進行連接反應，按說明書操作，連接反應體系中插入PubHLH基因與PMD18-T載體的摩爾比為3:1連接反應總體積是10μ 1，其中包括5μ I的2Χ緩衝液(購自寶生物工程大連有限公司)，4.5μ I純化的PCR產物，0.5μ I T載體。16°C過夜連接。取10 μ I連接產物，採用熱擊法(參照《分子克隆實驗手冊》第三版，科學出版社，2002)轉化大腸桿菌DH5 α，在含有50mg/L氨苄黴素的LB固體平板中篩選陽性克隆，挑取3個克隆測序(由南京金斯瑞科技有限公司完成)，測序結果表明，本發明克隆PubHLH基因全長為1650bp，通過測序、比對確定是本發明需要的目的基因，序列如SEQ ID NO:1所示，將這個基因命名為PubHLH，它包括1635bp的編碼閱讀框，編碼544個胺基酸，等電點為5.8，預測的分子量為58.9kD。BLASTX分析該序列與已知的bHLH(所有已發表的文獻和資料庫)序列同源。推導的PubHLH基因的胺基酸序列與報導的蘋果(MdbHLH，ABS50251)的序列雖然同源性達91%，但是蘋果MdbHLH這個基因的功能與抗寒沒有關係，其主要功能是控制蘋果的色素。多序列比對結果顯示PubHLH有C末段保守結構域，bHLH-ZIP結構域，和一個SUMO結構域。ExPASy分析表明編碼的胺基酸PubHLH有二個核定位信號(NLS)。SMART預測胺基酸PubHLH有I轉錄激活區域。
[0030]為分析PubHLH基因是否對響應低溫處理，採用實時定量PCR(正向引物 PubHLH-F2:5』 -CCCTTGAGTCCTTC-3』 (SEQ ID NO:5)；反向引物 PubHLH_R2:5』 -CCCATCTCCCTCTT-3』 (SEQ ID NO:6))分析該基因在4°C處理O~48小時下的表達。結果表明4°C低溫(見圖2)處理能誘導該基因表達，表明它是一個低溫應答候選基因。
[0031]實施例2PubHLH基因亞細胞定位、轉錄激活分析
[0032]由於PubHLH基因有I個核定位信號(NLS)，本發明利用洋蔥表皮來研究PubHLH基因的亞細胞定位。利用RT-PCR擴增出PubHLH基因整個ORF閱讀框，並在其擴增引物兩端分別加上NcoI和SpeI兩個酶切位點。其擴增引物為(正向引物PubHLH-Fl:5，_CCATGGATGCTGCCGAGGCTGAACGGTGGTG-3 』 (SEQ ID NO:11);反向引物 PubHLH-Rl:5，-GGACTAGTCACCATGCCATGGAACCCGAT CAA-3』 (SEQ ID NO:12)，首先將擴增產物進行酶切。同時用NcoI和SpeI雙酶切pCAMBIA1302，回收產物並連接，從而得到pCAMBIA1302-PubHLH_GFP重組載體，並將其轉入農桿菌EHA105。農桿菌侵染洋蔥表皮按如下方法進行:(I)劃平板，挑單克隆(含有重組質粒的農桿菌)於3毫升YEB培養基(含卡那黴素40 μ g/ml，利福平25mg/L)，28°C震蕩培養24小時，至0D_約0.6。⑵用手術刀將洋蔥內表皮劃成Icm2大小，撕下置於MS基本培養基(含3%蔗糖，0.75%瓊脂，不含激素)上暗培養24小時。(3)按體積比為1:1000比例，接種50 μ I農桿菌菌液於50毫升YEB (含卡那黴素40 μ g/ml，利福平25 μ g/ml)中，28°C振蕩培養12-24小時。(4)4000rpm，4°C離心10分鐘，棄上清。(5)加入50毫升YEB培養基(含有1mM MgCl2)，將洋蔥表皮放入菌液中浸泡30分鐘。(6)吸乾表面菌液，置於MS基本培養基(含3%蔗糖，0.75%瓊脂，不含激素)上28°C暗培養兩天。用Olympus BX71型顯微鏡觀察報告基因定位情況，結果表明，對照載體轉化時整個細胞中均有螢光(圖3A)，而重組載體轉化的細胞中螢光只能在核中檢測到(圖3B)，說明PubHLH是一個核定位蛋白。
[0033]實施例3植物轉化超表達載體構建
[0034]根據pMV載體(專利申請號201210258254.4)的多克隆位點和PubHLH基因的編碼區序列上的酶切位點分析，選擇Xhol和KpnI作為內切酶。首先將以PubHLH基因的克隆子為模板進行PCR擴增(擴增引物對正向引物:PubHLH Forward, 5，-TTGCTGCCATGCTGCCGAGGCTGAACGGTGGTG-3』 (SEQ ID NO:3);反向引物:PubHLH Reverse, 5，-GGGGTACCCTACACCATGCCATGGAACCCG-3』 (SEQ ID NO:4)，接後將PCR產物連同pMV載體一起在在37°C下進行酶切，酶切3-4h後純化回收。連接反應體系中PubHLH基因與載體pMV比率為3:1，反應總體積為10 μ 1，10 X Τ4連接緩衝液I μ 1，Τ4連接酶I μ 1，16°C連接13-16小時。連接產物轉化大腸桿菌菌株DH5 α，在含有100mg/L卡那黴素的LB固體平板中篩選，挑單克隆PCR檢測呈陽性後抽提質粒進行酶切，測序確定序列無誤後，即PMV-PubHLH重組載體構建成功。應用凍融法將重組載體導入到根癌農桿菌GV3103中並保菌。
[0035]實施例4菸草遺傳轉化
[0036]根癌農桿菌介導的菸草遺傳轉化步驟如下:
[0037]1.根癌農桿菌培養:取超低溫冰箱中保存的根癌農桿菌菌液，在添加了卡那黴素50mg/L的LB平板上劃線，刮取劃線菌斑，加入液體MS基本培養基中，28°C 180轉/分鐘振蕩培養，待菌液濃度達到0D_ = 0.5時作浸染。
[0038]2.浸染:取未轉基因的菸草葉片，切成0.5cmX0.5cm大小，然後放入製備好的根癌農桿菌菌液中，浸泡5分鐘，期間不斷振蕩。
[0039]3.共培養:取浸染後的菸草葉片，無菌濾紙吸乾上面的的菌液，然後接種於共培養培養基上暗培養3天。
[0040]4.篩選培養:經共培養3天後的菸草葉片，用無菌水衝洗3~5次，再轉移入添加了 100mg/L卡那黴素和400mg/L頭孢黴素的篩選培養基中。
[0041]5.生根培養:待篩選培養基上的不定芽長到Icm左右時，切下並轉入添加了100mg/L Km和500mg/L Cef的生根培養基上。
[0042]6.菸草苗轉入土培 :待生根後的轉化苗長滿培養瓶，由生根培養基中取出，用自來水洗淨轉化苗上的培養基，並栽植於滅菌的營養土中。
[0043]實施例5梨遺傳轉化
[0044]根癌農桿菌介導的梨遺傳轉化步驟如下:
[0045]1.根癌農桿菌培養:取超低溫冰箱中保存的根癌農桿菌菌液，在添加了卡那黴素50mg/L的LB平板上劃線，刮取劃線菌斑，加入液體MS基本培養基中，28°C 180轉/分鐘振蕩培養，待菌液濃度達到0D_ = 0.8時作浸染。
[0046]2.浸染:選取試管苗健康幼嫩的葉片，用無菌刀片垂直於葉片中脈橫切2~4個傷口，然後放入製備好的根癌農桿菌菌液中，浸泡5~10分鐘，期間不斷振蕩。
[0047]3.共培養:取浸染後的梨葉片，無菌濾紙吸乾上面的的菌液，然後接種於共培養培養基上暗培養3天，葉片背面朝下接種於不定芽誘導培養基上，暗培養溫度25±2°C ;所述的共培養培養基為:NN69+TDZ1.0~3.0mg/L+IBA0.2~0.5mg/L+蔗糖30~50g/L+瓊脂 5.0 ~6.5g/L, PH 值為 5.8 ；
[0048]4.篩選培養:經共培養3天後的梨葉片，用無菌水衝洗3~5次，再轉移入添加了 100mg/L卡那黴素和400mg/L頭孢黴素的篩選培養基中。所用的篩選培養基為:NN69+TDZ1.0 ~3.0mg/L+IBA0.2 ~0.5mg/L+ 蔗糖 30 ~50g/L+ 瓊脂 5.0 ~6.5g/L+100mg/L卡那黴素+400mg/L頭孢黴素，PH值為5.8 ;
[0049]5.生根培養:待篩選培養基上的不定芽長到Icm左右時，切下並轉入添加了100mg/L Km和500mg/L Cef的生根培養基上。所述的生根培養基為:1/2MS+IBA0.6mg/L+蔗糖60g/L+瓊脂6g/L，培養基pH值為5.8。
[0050]實施例6轉基因植株的分子鑑定
[0051]1、葉片DNA提取[0052]取適量的葉片放入1.5mL離心管中，加液氮，充分研磨後；加入700 μ 165°C預熱的DNA提取緩衝液十六烷基三乙基溴化銨(簡稱CTAB，配方:10mM Tris-HCl (pH8.0)，1.5MNaCl, 50mM EDTA (pH8.0)溶液加I %聚乙烯吡咯烷酮，2% (體積)CTAB，65°C水浴充分溶解備用，用前在65°C水浴預熱後，加入1-4% (體積)巰基乙醇，混勻)，65°C溫浴60-90分鐘，隔15分鐘取出上下輕輕顛倒混勻；10000g，離心10分鐘；取上清，加600 μ I氯仿，顛倒混勻靜置3分鐘;10000g，離心15分鐘；取上清450 μ 1，加入900 μ I預冷無水乙醇，420 μ 15ΜNaCl，混勻後，冰凍30分鐘，lOOOOg，離心10分鐘；棄上清後，用I ml75%的乙醇，洗滌3次後，加適量雙蒸水溶解。
[0053]2、半定量RT-PCR檢測PubHLH基因的超表達
[0054]本研究採用半定量RT-PCR分析轉基因梨及菸草植株中外源基因PubHLH的表達量，轉基因株系葉片RNA提取使用Trizol試劑盒，其步驟如下:1、研缽預冷。研缽用
0.5MNa0H浸泡lOmin，再用滅菌DEPC洗3_4次，加液氮預冷(鋁箔放冰上預冷冷藏葉片)；2、稱重0.1g葉片於1.5ml離心管，液氮研磨後，加Iml Trizol混勻(裂解cell並保護RNA)。3,40C 10000-12000g，離心 15min，取上清，加 200 μ L 氯仿，用力搖 15s 孵育 2min，4°C 10000-12000g，離心 15min。4、取上清，加 500 μ L 異丙醇，孵育 lOmin。4°C 12000g,離心10min。配75%的酒精。5、棄上清，加lml75 %的酒精(用滅菌DEPC水配)輕搖。4°C 7200g，5min離心。6、棄上清，風乾，沉澱用30-50 μ L DEPC水溶解，-80°C保存。7、取1-2 μ L檢測RNA的濃度和質量。將RNA反轉錄成cDNA其方法同第二章，半定量所用引物為 PubH LH 基因特異引物(正向引物 PubHLH-F2:5』 -CCCTTGAGTCCTTC-3』 (SEQ IDNO:5);反向引物 PubHLH-R2:5，-CCCATCTCCCTCTT-3，(SEQ ID NO:6))，反應程序為 94°C時3分鐘，94°C變性30秒，60°C退火45秒，72°C延伸45秒，30個循環；循環完成後72°C延伸10分鐘。轉基因菸草外源基因表達量採用半定量PCR分析，轉基因菸草分析用Tubulin 做內參，引物序列為:正向引物 Tubulin-F:5』 -TCCAGGACAAGGAGGGTAT-3 (SEQ IDNO:7) 』 ；反向引物 Tubulin-R:5』 -CATCAACAACAGGCAACCTAG-3』 (SEQ ID NO:8)。梨 Actin正向引物 Actin-Fl:5』 -CAATGTGCCTGCCATGTATG-3 (SEQ ID NO:9) 』 ；反向引物 Actin-Rl:5』 -CCAGCAGCTTCCATTCCAAT-3』 (SEQ ID NO:10)。結果表明，在轉基因株系中的 PubHLH 基因表達均比野生型高，分別選取菸草(#4和#9)兩個超表達系用於抗性研究。梨中有5個系的表達水平比野生型明顯增強，其中兩個系用於抗寒性評價。
[0055]實施例7轉基因植株的抗性評價
[0056]同批收的菸草未轉化植株(WT)和轉PubHLH超表達純系(#4、#9)將WT、#4和#9在MS生長培養基上生長30後移栽到盆中生長7天後，正常生長的植株沒有差別，但在0°C處理2天後，WT植株均出現萎蔫，而#4和#9植株生長仍然正常，表明轉基因植株的抗寒能力明顯比野生型強(圖8A)，統計成活率，結果表明，兩個轉基因系的成活率明顯高於野生型(圖8B)，上述研究表明轉PubHLH基因的菸草植株抗寒能力比未轉化植株(WT)明顯增強。
[0057]為了評估PubHLH轉基因梨超表達對低溫的抗性，正常生長情況下，對照及超表達系形態沒有明顯的差異，在0°c處理48小時後，發現野生型比轉基因系萎蔫更嚴重且呈水潰狀；25°C恢復生長5天，轉基因的兩個系恢復快而對照不能恢復正常生長變成枯黃，且頂芽已經死亡。上述研究結果表明，轉基因系的抗寒能力比野生型強。[0058]主要參考文獻如下:
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【權利要求】
1.一種山梨bHLH類轉錄因子基因PubHLH，其特徵在於核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中第409-2043bp處為該基因的編碼區。
2.權利要求1所述的山梨bHLH類轉錄因子編碼的蛋白，其特徵在於胺基酸序列如SEQID NO:2 所示。
3.用於擴增權利要求1所述的山梨bHLH類轉錄因子基因cDNA的引物對，其特徵在於正向引物序列如SEQ IDNO:3所示，反向引物序列如SEQ IDNO:4所示。
4.含有權利要求1所述基因PubHLH的重組表達載體。
5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於以pMV為出發載體。
6.含有權利要求1所述的山梨bHLH類轉錄因子基因PubHLH的宿主菌。
7.權利要求1所述的山梨bHLH類轉錄因子基因PubHLH在植物抗寒性狀改良或構建抗寒轉基因植物中的應用。
8.權利要求2所述的山梨b HLH類轉錄因子基因PubHLH編碼的蛋白在植物抗寒性狀改良或構建抗寒轉基因植物中的應用。
9.權利要求4所述的重組表達載體在植物抗寒性狀改良或構建抗寒轉基因植物中的應用。
【文檔編號】C07K14/415GK104031923SQ201410274379
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】張紹鈴, 黃小三, 靳叢, 齊開傑 申請人:南京農業大學