一種原位同時測定培養基中四價、五價釩含量的方法
2023-05-20 00:33:36 1
一種原位同時測定培養基中四價、五價釩含量的方法
【專利摘要】本發明公開的一種原位同時測定培養基中四價、五價釩含量的方法，用於研究牛肉膏蛋白腖液體培養基中微生物對四價釩的氧化作用和對五價釩的還原作用強度。該方法通過調整培養基配方，建立了顯色反應體系（包括反應試劑量、添加順序、顯色時間及其他條件），利用分光光度法，比較微生物作用前後培養基的吸光度曲線的變化，實現了培養基中四價、五價釩的原位同時測定。該方法具有設備要求低，操作簡單、測定準確，重現性好等特點，特別適合定性定量研究微生物對釩的氧化還原能力。
【專利說明】一種原位同時測定培養基中四價、五價釩含量的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種測定培養基中四價、五價釩的方法，該方法實現了培養基中四價、五價釩的原位同時測定，用於定性定量測定微生物對釩的氧化還原作用。
【背景技術】
[0002]釩作為一種環境重金屬汙染物正越來越受到人們的關注，與釩相關的報導不斷出現，人們除了希望了解環境中釩含量的情況外，更多地開始對釩不同價態進行研究。自然界中釩存在著廣泛的氧化還原反應，其中很重要的一部分是通過微生物完成的。因此判別哪些微生物可以進行釩的氧化還原作用及作用強度，對於釩汙染環境修復、釩汙染解毒、微生物釩耐受機理、釩礦微生物浸提、釩的地球生物轉化等問題都具有重要意義。
[0003]實際操作過程中，常將釩作為外援添加物添加到培養基中，在實驗室條件下來研究微生物對釩的氧化還原作用。對於釩的測定方法很多，例如原子吸收和發射光譜、電化學方法、流動注射法、高效液相色譜法、比色法等。對於不同價態釩的測定通常選擇分離測定，將四價和五價的釩用色譜柱分離，然後分別測定；或者分步測定，第一步直接測定樣品中四價的釩含量，第二部把五價的釩全部還原，再測定四價釩的總量，然後減去第一步測定的四價釩含量，從而間接的表示出五價釩含量。這些方法前處理複雜耗時，不能及時的反映微生物對釩的氧化還原作用。對於不同價態釩的同時測定方法也有一些，但是在樣品前處理中需要消煮。消煮過程中，培養基中的有機物大量被氧化，勢必造成釩的化學還原反應發生，無法客觀的反應出微生物的氧化還原貢獻量。
[0004]為了及時、準確的反應微生物對培養基中不同價態釩的氧化還原能力，一種原位同時測定培養基中四價、五價釩的方法就特別有意義，然而目前還沒有這種方法。
【發明內容】
[0005]為了解決上述技術難題，本發明的目的是提供一種原位同時測定培養基中四價、五價釩的方法。用於研究培養基中的微生物對釩的氧化還原作用及強度。
[0006]本發明解決上述技術問題所採用的技術方案是:培養基配方調整、以同濃度培養基為溶劑製作標準曲線、建立顯色反應體系、用0.22 ym濾膜過濾、定性結果分析及定量波長選擇等方法。
[0007]無特殊說明時，所有試劑均使用優級純標準，試劑配製過程以超純水進行稀釋。方法的檢測範圍為4"16 mg.L'
[0008]本發明採用分光光度法測定培養基中的四價、五價釩，具有操作簡便、條件易得，簡單快速準確，可重複等優點，適合推廣使用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1不同濃度四價、五價釩單獨吸光度曲線參考線
圖中40(T600 nm範圍內較平緩的線(吸光度隨波長的改變，變化不大)為只含四價釩顯色後的吸光度曲線，濃度越大吸光度值越大；400 nm處吸光度較大，而在50(T600 nm範圍內基本沒有吸收的曲線為只含五價釩顯色後的吸光度曲線，濃度越大，400^450 nm範圍內的吸光度越大；最下面的一條線為去離子水吸光度曲線。
[0010]圖2五價釩被還原舉例圖(定性分析)
在50(T600 nm範圍內從上到下四條線代表四種液體的吸光度曲線，這四種液體分別是:內含5 mg/L VOSO4的新鮮培養基溶液、內含5 mg/L Na3VO4培養基接種後培養3天、內含5 mg/L Na3VO4的新鮮培養基、未加釩的新鮮培養基。從圖中可以看出，在微生物存在的情況下培養數天，50(T600 nm範圍內的吸光度值升高(表示四價釩含量在增加)，同時400-450nm範圍的吸光度值降低。
[0011]圖3四價釩被氧化舉例圖(半定量)
圖中標有數字的線表示只含有四價釩的新鮮培養基的吸光曲線，數字表示四價釩的濃度，單位為mg/L。圖中未標數字的線為釩發生了氧化反應的線(四價、五價釩同時存在)，內含7 mg/L的四價釩的培養基，在微生物存在的情況下培養數天後，四價釩的含量降低到:3-5mg/L。50(T600 nm範圍內的吸光度值降低，同時400~450 nm範圍的吸光度值升高。
[0012]圖4標準曲線(定量計算)
配製內含4~16 mg/L的四價、五價釩的培養基，在對應波長下測定吸光度值，繪製標準曲線。每條線最近處的方程是取截距為零的線性擬合方程，R2表示相關係數。
【具體實施方式】
[0013]主要試劑配置
1、四價釩標準液:釩含量為20%的V0S04(分子量163)0.25g，濃磷酸Iml定容到500ml (0.1 mg.L 1)；
2、五價釩標準液=Na3VO4.12H20 (分子量 400) 0.4g，定容到 500 ml (0.1 mg.l-1)；
3、磷鎢酸應用液(顯色劑)=Na2WO4.2Η20 (分子量330) 132g，溶於300 ml水，磷酸調PH= 3，定容於 500ml (0.8M)；
4、調整後的牛肉膏蛋白腖培養基:蛋白腖4g、牛肉膏2 g、氯化鈉5 g、蒸餾水500 mlρΗ=7.4。
[0014]操作流程
培養基中標準參考吸光度曲線製作:(8.5-a)ml去離子水，0.1 ml不含釩培養基，a ml(0.4<a<l.6)釩標準液，0.2 ml濃硫酸，0.2 ml濃磷酸，I ml磷鎢酸應用液。搖勻靜置顯色0.5~1 h (顯色及沉澱)取上清液過0.22 μ m水系濾膜。在40(T600 nm範圍內做吸光度曲線作為參考曲線(如圖1)。五價釩在420 nm記錄吸光度值並繪製標準曲線I,得到吸光度係數A1 (0.0319為實例中測試結果，見圖4，下同);四價釩在510 nm和420 nm記錄吸光度值並繪製標準曲線II和III分別得到吸光度係數A2 (0.0131)和^ (0.0107)，圖4為一例。
[0015]樣品測定:無菌培養基中含有已知濃度的四價鑰;或五價鑰;(400~1600 mg.!/1),無菌操作接入已知菌種，培養一段時間。取樣品0.lml，加入到8.5 ml去離子水中，然後加入0.2 ml濃硫酸，0.2 ml濃磷酸，I ml磷鎢酸應用液。搖勻靜置顯色0.5^1 h(顯色及沉澱)，取上清液過0.22 μπι水系濾膜。在40(T600 nm範圍內做吸光度曲線，並記錄510 nm和420 nm處的吸光度值，分別記做E1和E2。[0016]結果比較與計算
定性分析:將樣品吸光度曲線與標準吸光度曲線參考曲線形狀和位置比較做出定性結論(具體見圖3說明)
定量分析:樣品中四價釩的含量=E1A2
樣品中五價鑰;的含量=(E2-E1^a3A2) /A1 定量方法準確性評估
為評估方法的可靠性，將配置好的已知濃度的樣品當做未知樣品測定，通過測定吸光度進行計算得到計算值，將計算值與真值(添加量)比較的到較滿意的回收率，方法準確度較高。其中回收率(％)=計算值/添加量*100。
【權利要求】
1.一種原位同時測定培養基中四價、五價釩的方法，主要是通過培養基配方改進，顯色反應體系建立，測定波長選擇，實現了培養基中四價、五價釩的原位同時測定，方法的特徵在於培養基調整，顯色體系條件設定及波長的選擇。
2.根據權利要求1所述的一種原位同時測定培養基中四價、五價釩的方法，其特徵是對牛肉膏蛋白腖培養基組成進行改進，將牛肉膏和蛋白腖的比例降低10%~30%，使其幹擾降低。
3.根據權利要求1所述的一種原位同時測定培養基中四價、五價釩的方法，其特徵是用同等濃度的培養基作為背景溶劑，配置四價和五價釩標準樣品。
4.根據權利要求1所述的一種原位同時測定培養基中四價、五價釩的方法，其特徵是顯色反應體系為:依次向試管中添加8.5 ml去離子水、0.1 ml培養基(樣品)、0.2 ml濃硫酸、0.2 ml濃磷酸、1 ml磷鎢酸，混合均勻室溫靜置0.5-1 h ;取上清液過0.22 μ m水系濾膜測定。
5.根據權利要求1所述的一種原位同時測定培養基中四價、五價釩的方法，其特徵是使用分光光度檢測濾液，測試並繪製400-600 nm範圍內的吸光度曲線，作為定性分析數據依據；記錄波長為510 nm和420 nm處的吸光度值，作為定量計算依據。
【文檔編號】G01N21/31GK103512853SQ201310428377
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月18日 優先權日:2013年9月18日
【發明者】楊傑, 楊金燕, 李廷強, 王斌 申請人:四川大學, 浙江大學