一種基於BMP7基因鑑定豬達100kg體重日齡和眼肌面積的方法與流程

2023-05-20 12:23:51 1

本發明屬於基因工程領域，具體涉及一種基於bmp7基因鑑定豬達100kg體重日齡和眼肌面積的方法。

背景技術：

豬為六畜之首，養豬業在世界尤其是中國國民經濟中佔有重要地位。豬肉在諸多肉類產品中的比重一直保持在三分之一左右，是人們比較喜愛的副食之一。人們的生活不斷改善，傳統的養殖技術已經不能滿足人們對豬肉的需求量。隨著現代育種技術的發展，豬的生產性能顯著提高，豬的健康養殖和育肥就顯得格外重要。

豬達100kg體重日齡是評估豬生長速度的重要指標，可以間接反映飼料利用率。大量數據表明豬達100kg體重日齡的縮短，生長速度越快，可以減少豬場的生產成本，豬場經濟效應會明顯提高。遺傳力是數量性狀的重要參數，根據遺傳力的大小，可以預測遺傳進展，個體育種值。因此，如何有效的提高豬生長速度，縮短達100kg體重日齡，並提前做出判斷，是每個豬場經營者及育種學家追求的目標。

豬背膘厚和眼肌面積與豬瘦肉率直接相關，是豬的遺傳育種和性能鑑定上的重要指標參數，豬的眼肌面積越大，瘦肉率越高。遺傳力是數量性狀的重要參數，根據遺傳力的大小，可以預測遺傳進展，個體育種值。因此，如何增加眼肌面積和提高瘦肉率，並提前做出判斷，是每個豬場經營者及育種學家追求的目標。

近十年來，分子生物技術的發展為豬的育種提供了一種基於dna變異的新型遺傳標記。特別是分子標記輔助選擇技術的出現，為顯著改善豬的這些數量性狀提供可能。

技術實現要素：

本發明的第一個目的是提供一種鑑定或輔助鑑定豬達100kg體重日齡和/或豬100kg體重眼肌面積性狀的方法。

本發明提供的鑑定或輔助鑑定豬達100kg體重日齡和/或豬100kg體重眼肌面積性狀的方法為如下(1)和/或(2)和/或(3)：

(1)是檢測豬個體的基因型是tt基因型還是cc基因型還是tc基因型，根據所述豬個體的基因型確定所述豬個體達100kg體重日齡大小：tc基因型的豬個體達100kg體重日齡多於cc基因型的豬個體，cc基因型的豬個體達100kg體重日齡多於tt基因型的豬個體；

(2)是檢測豬個體的基因型是tt基因型還是cc基因型還是tc基因型，根據所述豬個體的基因型確定所述豬個體達100kg體重眼肌面積大小：cc基因型的豬個 體達100kg體重眼肌面積多於tt基因型的豬個體，tt基因型的豬個體達100kg體重眼肌面積多於tc基因型的豬個體；

(3)是檢測豬個體的基因型是tt基因型還是cc基因型還是tc基因型，根據所述豬個體的基因型確定所述豬個體達100kg體重日齡大小：cc基因型的豬個體達100kg體重日齡多於tc基因型的豬個體，tc基因型的豬個體達100kg體重日齡多於tt基因型的豬個體；

所述1)和2)中，所述tt基因型為bmp7基因第四內含子第422位脫氧核糖核苷酸為t的純合體；所述cc基因型為bmp7基因第四內含子第422位脫氧核糖核苷酸為c的純合體；所述tc基因型為bmp7基因第四內含子第422位脫氧核糖核苷酸為t和c的雜合體；

所述3)中，所述tt基因型為bmp7基因第五內含子第241位脫氧核糖核苷酸為t的純合體；所述cc基因型為bmp7基因第五內含子第241位脫氧核糖核苷酸為c的純合體；所述tc基因型為bmp7基因第五內含子第241位脫氧核糖核苷酸為t和c的雜合體。

上述方法中，所述檢測豬個體的基因型是tt基因型還是cc基因型還是tc基因型的方法為如下a)或b)：

a)直接測序；

b)測序含有豬bmp7基因第四內含子的第422位脫氧核糖核苷酸的pcr擴增產物a或測序含有豬bmp7基因第五內含子的第241位脫氧核糖核苷酸的pcr擴增產物b；

所述pcr擴增產物a所用的引物為如下1)或2)：

1)由序列表中序列3所示的單鏈dna分子和序列表中序列4所示的單鏈dna分子組成的引物對a；

2)由序列a所示的單鏈dna分子和序列b所示的單鏈dna分子組成的引物對c；

所述序列a為將序列3刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列3具有相同功能的核苷酸；

所述序列b為將序列4刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列4具有相同功能的核苷酸；

所述pcr擴增產物b所用的引物為如下3)或4)：

3)由序列表中序列5所示的單鏈dna分子和序列表中序列6所示的單鏈dna分子組成的引物對b；

4)由序列c所示的單鏈dna分子和序列d所示的單鏈dna分子組成的引物對 d；

所述序列c為將序列5刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列5具有相同功能的核苷酸；

所述序列d為將序列6刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列6具有相同功能的核苷酸。

本發明的第二個目的是提供檢測豬個體的bmp7基因第四內含子的第422位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質或檢測豬個體的bmp7基因第五內含子的第241位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質的新用途。

本發明提供了檢測豬個體的bmp7基因第四內含子的第422位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質或檢測豬個體的bmp7基因第五內含子的第241位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質在鑑定或輔助鑑定豬達100kg體重日齡和/或豬100kg體重眼肌面積性狀中的應用。

本發明還提供了檢測豬個體的bmp7基因第四內含子的第422位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質或檢測豬個體的bmp7基因第五內含子的第241位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質在製備鑑定或輔助鑑定豬達100kg體重日齡和/或豬100kg體重眼肌面積性狀的產品中的應用。

本發明還提供了檢測豬個體的bmp7基因第四內含子的第422位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質或檢測豬個體的bmp7基因第五內含子的第241位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質在豬育種中的應用。

本發明還提供了檢測豬個體的bmp7基因第四內含子的第422位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質或檢測豬個體的bmp7基因第五內含子的第241位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質在製備豬育種的產品中的應用。

本發明還提供了檢測豬個體的bmp7基因第四內含子的第422位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質或檢測豬個體的bmp7基因第五內含子的第241位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質在選育生長速度快和/或豬達100kg體重日齡短和/或瘦肉率高和/或100kg體重眼肌面積大的種豬中的應用。

本發明還提供了檢測豬個體的bmp7基因第四內含子的第422位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質或檢測豬個體的bmp7基因第五內含子的第241位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質在製備選育生長速度快和/或豬達100kg體重日齡短和/或瘦肉率高和/或100kg體重眼肌面積大的種豬的產品中的應用。

本發明的第三個目的是提供一種鑑定或輔助鑑定豬達100kg體重日齡和/或豬100kg體重眼肌面積性狀的產品。

本發明提供的產品為檢測豬個體的bmp7基因第四內含子的第422位脫氧核糖核 苷酸的基因型的物質或檢測豬個體的bmp7基因第五內含子的第241位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質。

上述應用或上述產品中，所述檢測豬個體的bmp7基因第四內含子的第422位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質或檢測豬個體的bmp7基因第五內含子的第241位脫氧核糖核苷酸的基因型的物質為如下x1)-x6)：

x1)由序列表中序列3所示的單鏈dna分子和序列表中序列4所示的單鏈dna分子組成的引物對a；

x2)由序列表中序列5所示的單鏈dna分子和序列表中序列6所示的單鏈dna分子組成的引物對b；

x3)由序列a所示的單鏈dna分子和序列b所示的單鏈dna分子組成的引物對c；

所述序列a為將序列3刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列3具有相同功能的核苷酸；

所述序列b為將序列4刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列4具有相同功能的核苷酸；

x4)由序列c所示的單鏈dna分子和序列d所示的單鏈dna分子組成的引物對d；

所述序列c為將序列5刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列5具有相同功能的核苷酸；

所述序列d為將序列6刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列6具有相同功能的核苷酸；

x5)含有x1)所述引物對a或x2)所述引物對b或x3)所述引物對c或x4)所述引物對d的pcr試劑；

x6)含有x1)所述引物對a或x2)所述引物對b或x3)所述引物對c或x4)所述引物對d或x5)所述pcr試劑的試劑盒。

本發明的第四個目的是提供一種選育生長速度快和/或豬達100kg體重日齡短的種豬的方法。

本發明提供的選育生長速度快和/或豬達100kg體重日齡短的種豬的方法包括選擇tt基因型的豬進行育種；

所述tt基因型為bmp7基因第四內含子的第422位脫氧核糖核苷酸為t的純合體或bmp7基因第五內含子的第241位脫氧核糖核苷酸為t的純合體；

所述bmp7基因第四內含子的核苷酸序列如序列表中序列1所示；

所述bmp7基因第五內含子的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

本發明的第五個目的是提供一種選育瘦肉率高和/或100kg體重眼肌面積大的種豬的方法。

本發明提供的選育瘦肉率高和/或100kg體重眼肌面積大的種豬的方法包括選擇tc基因型的豬進行育種；

所述tc基因型為bmp7基因第四內含子的第422位脫氧核糖核苷酸為t和c的雜合體；

所述bmp7基因第四內含子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

上述方法或上述應用或上述產品中，所述bmp7基因第四內含子的第422位脫氧核糖核苷酸也即為豬bmp7基因組(nc_010459.4)第9136位核苷酸；所述bmp7基因第五內含子的第241位脫氧核糖核苷酸也即為豬bmp7基因組(nc_010459.4)第7679位核苷酸。

本發明發現了豬bmp7基因的第四內含子的t422c位點和t241c位點對豬達100kg體重日齡和眼肌面積有顯著影響，並基於該snp位點提供了一種鑑定或輔助鑑定豬達100kg體重日齡和眼肌面積的方法。通過試驗證明：本發明用bmp7基因第四內含子的第422位單核苷酸多態性和第五內含子的第241位單核苷酸多態性來鑑定豬達100kg體重日齡和眼肌面積的方法與豬達100kg體重日齡和眼肌面積的實際測定結果一致，對選擇優良豬種有重要意義。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實施例中的豬達100kg體重日齡為自豬出生日起至豬體重達到100kg的時間。

下述實施例中的豬100kg體重眼肌面積為豬體重達到100kg時的活體眼肌面積。

實施例1、一種基於bmp7基因鑑定豬達100kg體重日齡和眼肌面積的方法

一、豬bmp7基因的snp位點的篩選

1、豬耳組織樣品dna的提取

分別採集來自河北豬場的32頭長白豬的血液樣品，樣品採集後，保存於75％酒精中，並於-20℃保存。採用苯酚-氯仿抽提法提取血液樣品的基因組dna，具體步驟如下：

(1)耳組織樣的準備：剪取大小適中的耳組織樣，用生理鹽水衝洗掉表面的雜質和血汙，放於1.5ml離心管中，用眼科剪剪碎，並向其中加入500ul的組織裂解液(北京百泰科生物技術有限公司；產品編號：au19011)；

(2)根據所剪取的耳組織樣的大小，向離心管中加入15～25ul的蛋白酶k (sigma-aldrich；產品編號：sre0005)；

(3)放於水浴搖床上，55℃消化過夜，確保耳組織樣消化完全，得到消化徹底的耳組織；

(4)將上述消化徹底的耳組織樣於室溫放置，加入等體積的tris-飽和酚(江蘇寶萊生物科技有限公司)，翻覆顛倒混勻5min；

(5)14000rpm/min離心10min，離心管中會出現分層現象，上層為含有核酸的水相，下層為含有其他雜質的有機相。

(6)利用微量移液器小心吸取上層含核酸的水相，放置於一個新的1.5ml離心管中(為了避免吸起下層的有機相，最好用去除尖頭的藍槍頭)，棄下層有機相；

(7)重複步驟(4)～(6)；

(8)向含有水相的離心管中加入等體積的飽和酚：氯仿＝1：1，反覆顛倒混勻5min，14000rpm/min離心10min，然後吸取上層液體，放於一個新的1.5ml離心管中；

(9)重複步驟(8)；

(10)向其中加入飽和酚：氯仿：異戊醇的體積比為25：24：1，翻覆顛倒混勻，14000rpm/min離心10min；

(11)吸除上層液體，加入2倍體積的無水乙醇(事先放於-20℃冰箱內預冷)沉澱dna，此時會在離心管內出現絲狀或絮狀dna沉澱；

(12)用黃色槍頭小心的挑出絲狀或絮狀dna沉澱，放於一個新的1.5ml的ep管，向其中加入70％乙醇(-20℃預冷)500ul，洗滌dna沉澱，溫和顛倒30s，棄70％乙醇；

(13)重複步驟(12)；

(14)將含有dna沉澱的離心管放於室溫環境中，乾燥20～30min；

(15)加入60～80ul的te緩衝液或雙蒸水溶解dna沉澱(勿劇烈振蕩或離心)，將其保存於-20℃冰箱內。

2、目的片段的擴增及測序

(1)pcr擴增

以步驟1獲得的基因組dna為模板，分別採用引物對f1和r1及引物對f2和r2進行pcr擴增，得到pcr擴增產物。引物對f1和r1擴增得到bmp7基因第四內含子(序列1)，引物對f2和r2擴增得到bmp7基因第五內含子(序列2)。引物序列如下：

f1：5'-ggggtagacagggcagagcaa-3'(序列3)；

r1：5'-tggcaggtgagtggaggtgg-3'(序列4)；

f2：5'-gtggcgttcatgtacgagttgagtgg-3'(序列5)；

r2：5'-cacgaaaggctctgctgcctgttt-3'(序列6)。

pcr擴增體系：10×lapcrbuffer2ul，10mmdntpmix1.6ul，上下遊引物(10pmol/l)各1ul，lataqdna聚合酶(5u/ul)，基因組dna1ul，ddh2o13.2ul。

pcr反應程序：94℃預變性，5min；94℃變性，30s，58℃退火，30s，72℃延伸，30s，72℃延伸，10min。

(2)pcr產物的回收純化

利用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)，回收純化pcr產物，具體操作步驟按照該試劑盒所附帶的說明書。

(3)連接反應

將上述純化回收的pcr擴增產物與pmd18-t載體進行連接。連接反應體系為5μl：pcr回收產物2ul、pmd18-t載體0.5ul、solutioni2.5ul，4℃連接過夜，得到連接產物。

(4)轉化

將連接產物轉化大腸桿菌dh5α感受態細胞。具體操作步驟：從-80℃超低溫冰箱內取1支dh5α感受態細胞(100μl)，迅速放於冰上，使其融化；將連接產物(體積5ul)加入感受態細胞中，用移液器輕輕反覆吹打，使其混勻，放置於冰上，靜置30min；放置於42℃水浴中，熱擊90s，然後立即冰浴2～3min；向其中加入600μl的液體lb培養基(不含氨苄青黴素)；放置於37℃恆溫搖床中，以170～200r/min的轉速培養1h，使細菌復甦。

(5)陽性克隆鑑定

用移液器吸取50～100μl經過復甦的菌液，均勻塗布於含有氨苄青黴素的瓊脂平板上，待菌液完全被吸收後，放於37℃恆溫培養箱內30min，使菌液完全被吸收，然後將瓊脂平板倒置放於恆溫培養箱內，37℃培養過夜。

根據瓊脂平板上的菌落生長情況，進行挑菌。向1.5mlep管中加入1ml液體lb培養基，同時向每個ep管中加入2μl的氨苄青黴素，然後用10μl槍頭挑取瓊脂平板上的白色菌落(選擇形狀完整，呈圓點形的菌落)共20個，分別放於盛有1ml液體培養基的1.5mlep管中，放於37℃搖床內，以220r/min的轉速擴大培養3～4h，待ep管內出現渾濁現象或者白色絲狀沉澱時，採用採用引物對f1和r1及引物對f2和r2進行菌液pcr鑑定。

pcr反應體系如下：10×labuffer1ul，dntpmix(2.5mm)0.8ul，上下遊引物(pmol/l)各0.5ul，la聚合酶0.1ul，菌液0.5ul，ddh2o6.6ul，總體系為10ul。

pcr反應結束後，吸取1μlpcr產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝 膠成像儀拍照，初步確定陽性克隆。

(6)測序驗證

將經過pcr擴增初步鑑定為陽性克隆的菌液送交上海英濰捷基有限公司進行測序。

(7)snp位點(t422c、t241c)的獲得

根據上述多個測序結果，利用dnaman軟體進行比對，得到2個差異位點：t422c位點和t241c位點，t422c位點為豬bmp7基因第四內含子(序列1)的第422位核苷酸，也即為豬bmp7基因組(nc_010459.4)第9136位核苷酸；t241c位點為豬bmp7基因第五內含子(序列2)的第241位核苷酸，也即為豬bmp7基因組(nc_010459.4)第7679位核苷酸。

在豬bmp7基因第四內含子(序列1)的t422c位點的鹼基均為t的個體，該個體為純合型個體，將該個體的基因型命名為純合tt基因型；豬bmp7基因第四內含子(序列1)的t422c位點的鹼基均為c的個體，該個體為純合型個體，將該個體的基因型命名為純合cc基因型；豬bmp7基因第四內含子(序列1)的t422c位點的鹼基為t和c的個體，該個體為雜合型個體，將該個體的基因型命名為雜合tc基因型。

在豬bmp7基因第五內含子(序列2)的t241c位點的鹼基均為t的個體，該個體為純合型個體，將該個體的基因型命名為純合tt基因型；豬bmp7基因第五內含子(序列2)的t241c位點的鹼基均為c的個體，該個體為純合型個體，將該個體的基因型命名為純合cc基因型；豬bmp7基因第五內含子(序列2)的t241c位點的鹼基為t和c的個體，該個體為雜合型個體，將該個體的基因型命名為雜合tc基因型。

二、豬bmp7基因的t422c、t241c位點與豬達100kg體重日齡和眼肌面積的相關性分析

(一)豬bmp7基因的t422c位點與豬達100kg體重日齡和眼肌面積的相關性分析

為確定豬bmp7基因的t422c位點與豬達100kg體重日齡和眼肌面積是否相關，以河北豬場的382頭大白豬為實驗材料，按照上述步驟一中的方法確定每個豬個體的基因型為tt基因型、cc基因型還是tc基因型，並根據豬的基因型確定豬達100kg體重日齡和豬100kg眼肌面積：tc基因型的豬個體達100kg體重日齡多於cc基因型的豬個體，cc基因型的豬個體達100kg體重日齡多於tt基因型的豬個體；cc基因型的豬個體100kg體重眼肌面積多於tt基因型的豬個體，tt基因型的豬個體達100kg體重眼肌面積多於tc基因型的豬個體；

1、基因型

382頭豬個體的基因型檢測結果表明：13頭豬的基因型為tt基因型，121頭豬的基因型為tc基因型，248頭豬的基因型為cc基因型。豬bmp7基因在檢測豬群中的基因型頻率及等位基因頻率結果如表1所示：由表1可以看出：cc純合型和tc雜合型的基因型頻率高於tt純合型，c等位基因為優勢基因。

表1、豬bmp7基因在檢測豬群中的基因型頻率及等位基因頻率

2、豬基因型與豬達100kg體重日齡和眼肌面積的關聯性分析

利用spss20.0軟體對基因型和豬達100kg體重日齡和眼肌面積進行統計分析，並做樣本間多重比較。

結果如表2所示：snp(t422c)位點對豬達100kg體重日齡和眼肌面積有顯著影響，tt型達100kg日齡顯著低於tt型和cc型，且tc基因型的豬個體達100kg體重日齡多於cc基因型的豬個體，所以在實際的豬育種中，tt基因型豬具有更快的生長速度。cc基因型達100kg體重眼肌面積高於tc基因型和tt基因型，且tt基因型達100kg體重眼肌面積高於tc基因型。

表2、豬bmp7基因第四內含子的單核苷酸多態性與達100kg體重日齡和眼肌面積的關聯性分析

備註:表中用不同小寫字母表示差異顯著(p0.05)，數值用最小二乘均值±標準誤。

綜上所述，可以通過確定豬bmp7基因第四內含子的t422c位點的核苷酸來確定豬個體為tt基因型還是cc基因型還是tc基因型，從而輔助鑑定豬達100kg體重日齡和眼肌面積：tc基因型的豬個體達100kg體重日齡多於cc基因型的豬個體，cc基因型的豬個體達100kg體重日齡多於tt基因型的豬個體；cc基因型的豬個體100kg體重眼肌面積多於tt基因型的豬個體，tt基因型的豬個體達100kg體重眼肌面積多於tc基因型的豬個體；

tt基因型為豬bmp7基因第四內含子的第422位的核苷酸為t的純合體；

cc基因型為豬bmp7基因第四內含子的第422位的核苷酸為c的純合體；

tc基因型為豬bmp7基因第四內含子的第422位的核苷酸為t和c的雜合體；

所述bmp7基因第四內含子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

(二)豬bmp7基因的t241c位點與豬達100kg體重日齡的相關性分析

為確定豬bmp7基因的t241c位點與豬達100kg體重日齡是否相關，以河北豬場的295頭大白豬為實驗材料，按照上述步驟一中的方法確定每個豬個體的基因型為tt基因型、cc基因型還是tc基因型，並根據豬的基因型確定豬達100kg體重日齡和豬100kg眼肌面積：cc基因型的豬個體達100kg體重日齡多於tc基因型的豬個體，tc基因型的豬個體達100kg體重日齡多於tt基因型的豬個體；

1、基因型

295頭豬個體的基因型檢測結果表明：41頭豬的基因型為tt基因型，114頭豬的基因型為cc基因型，140頭豬的基因型為tc基因型。豬bmp7基因在檢測豬群中的基因型頻率及等位基因頻率結果如表3所示：由表3可以看出：tc雜合型和cc純合型的基因型頻率明顯高於tt純合型，c等位基因為優勢基因。

表3、豬bmp7基因在檢測豬群中的基因型頻率及等位基因頻率

2、豬基因型與豬達100kg體重日齡的關聯性分析

利用spss20.0軟體對基因型和豬達100kg體重日齡進行統計分析，並做樣本間多重比較。

結果如表4所示：snp(t241c)位點對豬達100kg體重日齡有顯著影響，tt型達100kg日齡顯著低於tc型和cc型，且tt型達100kg日齡低於tc型，tc型達100kg日齡低於cc型，所以在實際的豬育種中，tt基因型豬具有更快的生長速度。

表4、豬bmp7基因第五內含子的單核苷酸多態性與達100kg體重日齡關聯性分析

備註:表中用不同小寫字母表示差異顯著(p0.05)，數值用最小二乘均值±標準誤。

綜上所述，可以通過確定豬bmp7基因第五內含子的t241c位點的核苷酸來確定豬個體為tt基因型還是cc基因型還是tc基因型，從而輔助鑑定豬達100kg體重日 齡：cc基因型的豬個體達100kg體重日齡多於tc基因型的豬個體，tc基因型的豬個體達100kg體重日齡多於tt基因型的豬個體；

tt基因型為豬bmp7基因第五內含子的第241位的核苷酸為t的純合體；

cc基因型為豬bmp7基因第五內含子的第241位的核苷酸為c的純合體；

tc基因型為豬bmp7基因第五內含子的第241位的核苷酸為t和c的雜合體。

所述bmp7基因第五內含子的核苷酸序列如序列表中序列2所示。