人α2幹擾素與人血清白蛋白的融合蛋白的製備方法及產品的製作方法

2023-05-19 18:15:51

專利名稱：人α2幹擾素與人血清白蛋白的融合蛋白的製備方法及產品的製作方法
技術領域：
人α2幹擾素與人血清白蛋白的融合蛋白的製備方法及產品，屬於長效融合蛋白藥物技術領域。
背景技術：
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血漿中的主要蛋白成分，在血漿中的濃度為40mg/ml(Phillip P.Minghettis et al.，THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY，1986 2616747-6757)，它除了具有維持血漿滲透壓功能外，還能結合內源性和/或外源性配體，包括激素、有毒代謝產物、藥物等。通過結合這些配體，HSA可以調節激素活性、內源性和外源性物質的毒性和藥物的利用度(Ji-Sook Ha et al.，Biochimica et Biophysica Acta，20031640119-128)。David S.Park等構建的Half HSA(截取HSA的前297胺基酸殘基)具有野生型HSA相應區類似的二級結構，同時保留了野生型HSA結合甲狀腺素和甲狀腺素類似物的能力(David S.Park et al.，IUBMB Life，1999 48169-174)。細胞中剛翻譯出來的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein結構，它包括18個胺基酸殘基的信號肽和6個胺基酸殘基前肽的原肽。信號肽和前肽在轉運和分泌的過程中被切除，成熟的HSA由585個胺基酸殘基組成，含有17對二硫鍵，分子量約為66.5KDa。通常情況下，HSA為非糖基化蛋白，然而有的突變體中也存在N-連接糖基化(見Uniprot中的protein ALBU_HUMAN)。Peters的觀點認為進化出大分子蛋白的優點是減小其在內循環時經腎排洩(Peters T.Jr.，Adv.Protein Chem.，198537161-245)。HSA的分子量相對較大，在正常情況下，不易被腎小球濾過，其血漿半衰期在20天左右。
人幹擾素(Interferon，IFN)分為I型和II型兩類，I型幹擾素主要包括IFNα、IFN β，兩者共用同一個受體，且對熱和pH的耐受能力較強。II幹擾素包括IFN γ。IFN α是有由白細胞產生，包括至少25種以上的亞型，這些亞型具有相似的結構特點分子量均在16～27.6kDa之間，等電點約5～7，胺基酸殘基數165和166，有兩對二硫鍵(C1-C98，C29-C138或C1-C99，C29-C139)，二硫鍵對IFN α蛋白的正確摺疊和生物學活性十分重要，只有少數幾個IFN α亞型有糖基化。本發明所涉及的IFN α2，為IFN α家族中的成員，它存在三形式，即IFN α2a、IFN α2b和IFN α2c，因為它們具有優越的抗病毒、抗腫瘤和調節機體免疫功能而被廣泛地應用於治療病毒性疾病和腫瘤。臨床上常用的IFNα2a和IFN α2b，由於分子量較小，易被腎小球濾過，從而導致它的血漿清除率高、體內半衰期短(皮下給藥或肌肉注射的半衰期一般在8小時左右)，生物利用度低。為了達到治療效果，一般需要頻繁大劑量用藥，如隔日一次，每次8×106IU，而慢性病毒性肝炎周期較長(一般在六個月以上)，頻繁大劑量用藥不僅增加了病人的痛苦和治療費用，而且容易產生毒副作用。為了克服上述缺點，可以對幹擾素加以修飾，以延長其半衰期。主要方法有劑型改造、利用化學手段修飾(如用PEG，葡聚糖修飾)、利用基因工程手段，將其與其它大分子蛋白融合。Tse Wen Chang等利用幹擾素與人免疫球蛋白IgG的Fc融合以達到延長半衰期的目的(Tse Wen Chang et al.，美國專利US5908626，1999-01-01)。由於人IgG存在同種異型，在用藥者體內可能產生相應的抗體而降低該融合蛋白的療效，本發明擬將α2幹擾素與人血清白蛋白融合。

發明內容
本發明的目的是提供一種人α2幹擾素與人血清白蛋白的融合蛋白的製備方法及產品。本發明的融合蛋白在保持了人α2幹擾素的生理特性的基礎上延長其在體內的半衰期，在藥學領域有良好的應用前景。
本發明的技術方案人α2幹擾素與人血清白蛋白的融合蛋白的製備是IFNα2 cDNA通過RT-PCR從經新城雞瘟病毒誘導的人淋巴細胞RNA中直接擴增得到；HSA cDNA通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得；獲得的IFN α2cDNA和HSAcDNA分別插入到克隆載體中，測序。利用重疊PCR技術，連接IFN α2cDNA和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的HSA-IFN α2cDNA融合基因插入到克隆載體中保存；利用畢赤酵母分泌型表達載體將HSA-IFN α2cDNA融合基因整合到宿主的染色體中進行表達。
IFNα2 cDNA的克隆，HSA cDNA的克隆，IFNα2 cDNA和HSA cDNA的連接，融合蛋白HSA-IFN α2的酵母表達系統構建和融合蛋白HSA-IFN α2的表達的步驟詳見實施例。
用上述方法製備的人α2幹擾素與人血清白蛋白的融合蛋白，包括與人α2幹擾素至少85％序列同源的第一區和與人血清白蛋白至少85％序列同源的第二區或人血清白蛋白的部分胺基酸序列第二區；所述與人α2幹擾素同源的第一區位於融合蛋白的N末端，所述與人血清白蛋白同源的第二區位於融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽；或所述與人血清白蛋白同源的第二區位於融合蛋白的N末端，所述與人α2幹擾素同源的第一區位於融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽。
優選的是所述融合蛋白包括與人α2幹擾素至少95％序列同源的第一區和與人血清白蛋白至少95％序列同源的第二區。
所述融合蛋白的第二區可以由人血清白蛋白部分結構域組成、經結構域重排後的人血清白蛋白組成，包括其所有HSA天然存在的多態型外，還包括HSA的部分片段，如EP322094中所述名為HSA(1-n)，n為369-419。
所述融合蛋白包括與人α2幹擾素胺基酸殘基序列相同的第一區和與人血清白蛋白胺基酸殘基序列相同的第二區，或上述二區的功能等同物。
所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別胺基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
宿主表達系統是細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞、植物細胞表達系統。優選的宿主表達系統是酵母。優選的酵母是畢赤酵母。優選的畢赤酵母是畢赤酵母KM71。
IFN α2 cDNA可以通過RT-PCR從經新城雞瘟病毒誘導的人淋巴細胞RNA中直接擴增得到。HSA cDNA可以通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得。IFN α2cDNA和HSA cDNA也可以通過人工合成的方法獲得。該法可以人為地選擇宿主偏好的密碼子，以使目的基因高效表達。獲得的IFN α2 cDNA和HSA cDNA分別插入到克隆載體中，測序。利用重疊PCR技術，連接IFN α2cDNA和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的IFN α2cDNA和HSA cDNA融合基因插入到克隆載體中保存。
IFN α2cDNA和HSA cDNA融合基因可以在多個系統中表達，如細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞、植物細胞，及生物體(如脊椎動物、昆蟲等)等。在這些表達系統中目的基因被整合到宿主的染色體中或插入到質粒中。本發明優選的是酵母表達系統，該系統除了具備原核表達系統的易操作、生長迅速、營養要求簡單、易工業放大的特點外，還具有真核細胞的蛋白後修飾系統，有利於大量生產高質量的重組蛋白。更優選的是畢氏酵母表達系統，和釀酒酵母表達系統相比，畢氏酵母表達系統在蛋白分泌和糖基化方面具有明顯的優勢。畢氏酵母自身分泌地蛋白少，十分有利於純化；糖基化程度低，避免了釀酒酵母超糖基化帶來的免疫源性問題。
畢氏酵母表達系統分泌型表達載體主要有pPIc9，pPIc9k，pHIL-S1，pPIcZa，pYAM75P6；胞內型表達載體主要有pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa等，優選的是畢赤酵母分泌型表達載體pPIC9K，它是酵母整合載體，帶有His缺陷型的選擇性標記基因HIS4、AOX1啟動子、MFα分泌信號肽和G418抗性基因(可作為篩選重組子的標記)等元件。AOX1啟動子是一個強啟動子，可以高效的啟動目的基因的表達。在畢氏酵母裡共編碼兩種乙醇氧化酶，AOX1和AOX2，細胞中絕大多數乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供。在甲醇為唯一碳源培養的細胞中，該酶可佔細胞總蛋白的30％以上。AOX2與AOX1的同源性雖然高達97％，但酶活很低。當AOX1基因缺失，只存在AOX2時，大部分的乙醇氧化酶活力喪失，細胞利用甲醇能力降低，細胞在甲醇為唯一碳源的培養基上生長很慢。
帶有IFN α2 cDNA和HSA cDNA融合基因的表達載體可以通過轉化鋰鹽法、PEG法、原生質體法或電穿孔法轉化宿主細胞。成功轉化的細胞，即帶有本發明構建的DNA的細胞，可以通過本領域熟知的方法加以鑑定，如收集細胞，裂解後提取DNA，然後進行Southern雜交和PCR鑑定，也可在誘導表達後用HSA抗體和/或IFN α2a、IFN α2b、IFN α2c抗體檢測培養液上清。
本發明的有益效果利用重疊PCR技術，連接IFN α2 cDNA和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，以避免因連接肽加入而帶來的融合蛋白穩定性(避免針對連接肽的蛋白酶降解)和免疫原性方面的問題。
優選的酵母表達系統除了具備原核表達系統的易操作、生長迅速、營養要求簡單、易工業放大的特點外，還具有真核細胞的蛋白後修飾系統，有利於大量生產高質量的重組蛋白。更優選的是畢酵母表達系統，和釀酒酵母表達系統相比，畢赤酵母表達系統在蛋白分泌和糖基化方面具有明顯的優勢。畢赤酵母自身分泌地蛋白少，十分有利於純化；糖基化程度低，避免了釀酒酵母超糖基化帶來的免疫源性問題。
可以通過培養帶有本發明構建的DNA的宿主細胞，來生產本發明的融合蛋白。宿主細胞培養優選在生物反應器上進行，培養分兩個階段，第一階段主要用於宿主細胞生長，第二階段主要用於產物合成。可以用各種蛋白分離的方法自含有本發明DNA構建體的細胞培養物中分離、純化融合蛋白。如鹽析、沉澱、超濾、層析、製備電泳等技術及這些技術的組合。


1.pPIC9K-HSA-IFN α2構建2.融合蛋白HSA-IFN α2b的SDS-PAGE分析3.融合蛋白HSA-IFN α2b的HSA抗體檢測(Western blot)4.融合蛋白HSA-IFN α2b的抗病毒活性5.HSA-IFN α2b在小鼠體內代謝的藥時曲線具體實施方法實施例1IFN α2 cDNA的克隆取正常人外周血加淋巴細胞分離液，分離出人血白細胞，用含有5％胎牛血清的DMEM培養基稀釋至細胞濃度為5×107個/ml，加入新城雞瘟病毒到100血凝單位/ml，37℃，5％CO2，培養1小時，使病毒吸附在細胞上，1000×g離心棄上清，加入新鮮的有5％胎牛血清的DMEM培養基，37℃，5％CO2，培養18小時。用RNA提取試劑盒分離總RNA，後用一步法RT-PCR試劑盒(購自大連寶生物公司)，反轉錄為cDNA並從中擴增出IFN α2，所用的引物如下Pa2b15』-AGAGTCGACATGTGTGATCTGCCTCAA-3』Pa2b25』-GCCAAGCTTTCATTCCTTACTTCTTAAACT-3』一步法RT-PCR反應體系配製如下

在MJ Research公司的PTC-100TMPCR儀上，條件為50℃30min，94℃充分變性2分鐘，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環30次。
通瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現預期大小(約0.5kb)的條帶。用PCR片段膠回收試劑盒(購自北京博大泰克生物基因技術有限公司，下同)純化出0.5kb的目標片段。純化好的目標片段和載體pBlueScript II KS(+)，經SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收。取雙酶切後純化好的IFN α2cDNA 9μl，pBlueScript II KS(+)1μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μl T4連接酶，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物塗布於含有X-gal、IPTG和氨苄青黴素(100μg/ml)的LB瓊脂平板，37℃培養過夜。挑取白色菌落，接種於20ml氨苄青黴素(100μg/ml)的LB培養基中37℃培養過夜，用常規方法提取質粒。通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，並對SalI-HindIII區進行DNA測序。陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍於-80℃。重組質粒命名為pBlue-IFN α2，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-IFN α2。
實施例2HSA cDNA的克隆利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSA cDNA。所用的引物為HSA15』-AGAGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3』HSA25』-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3』PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的HSA1和HSA2的引物各3μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl(dNTP、10×pfu Buffer和pfu DNA聚合酶均購自上海生物工程技術服務公司，下同)，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補齊50μl。在MJResearch公司的PTC-100TMPCR儀上，PCR條件為95℃充分變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環30次。
通瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現預期大小(約1.8kb)的條帶。用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標片段。純化好的目標片段和載體pBlueScript II KS(+)，經SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收。取雙酶切後純化好的HSA cDNA 9μl，pBlueScript II KS(+)1μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μl T4連接酶，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物塗布於含有X-gal、IPTG和氨苄青黴素(100μg/ml)的LB瓊脂平板，37℃培養過夜。挑取白色菌落，接種於20ml氨苄青黴素(100μg/ml)的LB培養基中37℃培養過夜，用常規方法提取質粒。通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，並對SalI-HindIII區進行DNA測序。陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍於-80℃。重組質粒命名為pBlue-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HSA。
實施例3HSA cDNA和IFN α2 cDNA融合片段的克隆HSA cDNA的PCR擴增所用引物如下Pf15』-CCCTCCGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3』Pf25』-TGGGTTTGAGGCAGATCACATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3』PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的Pf3和Pf4的引物各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μ1，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1ng，加雙蒸水補齊50μl。在MJ Research公司的PTC-100TMPCR儀上，PCR條件為95℃充分變性5分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環30次。
IFN α2 cDNA的PCR擴增所用引物如下Pf35』-GTCAAGCTGCCTTAGGCTTATGTGATCTGCCTCAAACCCA-3』Pf45』-CATAAGGCGGCCGCTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTC-3』PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的Pf1和Pf2的引物各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-IFN α2 1ng，加雙蒸水補齊50μl。在MJ Research公司的PTC-100TMPCR儀上，PCR條件為95℃充分變性5分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環30次。
利用重疊PCR融合HSA和IFN α2 cDNA，具體方法如下將IFN α2的PCR反應產物和HSA的PCR反應產物分別稀釋40倍，再以1∶1比例混合後作為模板。於50μl的反應體系中加入2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加雙蒸水補齊45μl。在MJ Research公司的PTC-100TMPCR儀上，PCR條件為95℃充分變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘。循環10次後，向反應體系中加入10μmol/L的Pf1和Pf4的引物各2.5μl，繼續做30個循環。
通瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現預期大小(約2.2kb)的條帶。用PCR片段膠回收試劑盒純化出2.2kb的目標片段。純化好的目標片段HSA-IFN α2和載體pBlueScript II KS(+)，經EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收。取雙酶切後純化好的HSA-IFN α2片段9μl，pBlueScript IIKS(+)1μl，加入2μl 10×ligationbuffer，0.4μl T4連接酶，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應過夜。連接產物轉化大腸桿菌XL-1 blue感受態細胞，轉化物塗布於含有X-gal、IPTG和氨苄青黴素(100μg/ml)的LB瓊脂平板，37℃培養過夜。挑取白色菌落，接種於20ml氨苄青黴素(100μg/ml)的LB培養基中37℃培養過夜，用常規方法提取質粒。通過PCR，及EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，並對EcoRI-NotI區進行DNA測序。陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍於-80℃。重組質粒命名為pBlue-HSA-IFNα2，陽性重組子命名為XL-1/pBlue-HSA-IFN α2。
實施例4HSA-IFN α2酵母表達系統構建取一支凍存的XL-1/pBlue-HSA-IFN α2，20ml氨苄青黴素(100μg/ml)的LB培養基中37℃培養過夜，用常規方法提取質粒。質粒pBlue-HSA-IFN α2和酵母表達載體pPIC9K，經EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收。取雙酶切後純化好的pBlue-HSA-IFN α2片段5μl，pPIC9K 5μl，加入2μl 10×ligation buffer，0.4μl T4連接酶，加雙蒸水補齊20μl，15℃反應過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物塗布於含有氨苄青黴素(100μg/ml)的LB瓊脂平板，37℃培養過夜。挑取若干個菌落，接種於20ml氨苄青黴素(100μg/ml)的LB培養基中37℃培養過夜，用常規方法提取質粒。通過PCR，及EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆。陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍於-80℃。重組質粒命名為pPIC-HSA-IFN α2，陽性重組子命名為DH5α/pPIC-HSA-IFN α2。提取DH5α/pPIC-HSA-IFN α2中的質粒，經SalI酶切後，電擊轉化畢赤酵母KM71。轉化物塗布於含有1mol/L山梨醇的MD平板上，於30℃，培養6天。每塊平板上用2ml水洗滌，收集洗滌液。取部分收集到的洗滌液，分別塗布含有1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/mlG418的YPD平板，於30℃，培養3～6天。挑取在最高濃度G418的YPD平板上的長出菌落，接種於20mlMD培養基中，30℃培養24小時，用常規方法提取酵母基因組DNA，通過PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑑定重組子。陽性重組子命名為KM71/pPIC-HSA-IFN α2。
實施例5HSA-IFN α2融合蛋白的表達以HSA-IFN α2b融合蛋白為例，其表達、鑑定及藥效學分析將KM71/pPIC-HSA-IFN α2b接種至裝有100mlBMGY(100mM磷酸鉀，pH 6.0、1.34％無胺基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、1％甘油)500ml三角瓶中，300rpm，29℃培養至OD600為2～6，離心收集菌體。將收集到的菌體接種至裝有20mlBMMY(100mM磷酸鉀，pH 6.0、1.34％無胺基酸的酵母氮基、4×10-5％生物素、0.5％甲醇)的100ml三角瓶中，每24小時不加一次甲醇至終濃度0.5％，誘導7天。離心收集上清，過濾除菌，用細胞病變抑制法測定上清中的HSA-IFN α2活性。WISH細胞在培養基中呈單層，貼壁生長。每周2-3次，1∶2～1∶4消化傳代，於完全培養液中生長。WISH細胞用完全培養液於37℃、5％CO2條件下培養，棄去培養瓶中的培養液，用PBS洗2次後消化和收集細胞，用完全培養液配製成2.5×105～3.5×105個/ml的細胞懸液，接種於96孔細胞培養板中，每孔100μl。37℃、5％CO2條件下培養4～6小時。將配製完成的標準品溶液和供試品溶液移入接種WISH細胞的培養板，每孔加入100μl。37℃，5％CO2條件下培養18～24小時。取製備的96孔細胞培養板，棄去上清。將保存的水泡性口炎病毒(VSV，-70℃保存)用攻毒培養液稀釋至工作濃度，每孔100μl。37℃，5％CO2培養24小時，棄上清，每孔加入50μl染色液(50mg結晶紫溶於20ml無水乙醇)，室溫放置30分鐘後，用流水小心衝去染色液，並吸乾殘留水分，每孔加入100μl脫色液，混勻後在酶標儀上測定波長570nm的吸光度值。活性分析結果證明產物具有幹擾素的抗病毒活性，如圖4。Western雜交表明產物具有HSA的免疫源性。
HSA-IFN α2b融合蛋白藥代動力學分析溶液配製方法取125I-HSA-IFN α2b適量(約含74MBq)，用藥代動力學試驗用樣品針劑和50mmol/L pH7.2PBS含0.2％BSA緩衝液配製成200μg/ml(3.6681MBq/ml)，注射劑量為1.0ml/kg。大鼠48隻，稱重，隨機分為8組，每組6隻，雌雄各半，按200μg/kg 125I-HSA-IFN α2b皮下注射，各組分別於給藥後30分鐘、2、6、24、48，90、180和300小時放血處死血清取100μl，直接測定血清及各整臟器的放射性。並計折算出每克組織藥物的分布量(ng/g)。繪製藥時曲線，從圖5曲線中可以看出HSA-IFN α2在大鼠體內代謝半衰期約為48小時。
HSA-IFN α2a融合蛋白和HSA-IFN α2c融合蛋白的表達、藥效及藥代動力學分析，操作步驟同上述。
權利要求
1.人α2幹擾素與人血清白蛋白的融合蛋白的製備方法，其特徵是IFNα2cDNA通過RT-PCR從經新城雞瘟病毒誘導的人淋巴細胞RNA中直接擴增得到；HSAcDNA通過PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增獲得；獲得的IFNα2 cDNA和HSA cDNA分別插入到克隆載體中，測序；利用重疊PCR技術，連接IFNα2 cDNA和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的HSA-IFNα2 cDNA融合基因插入到克隆載體中保存；利用畢赤酵母分泌型表達載體將HSA-IFNα2 cDNA融合基因整合到宿主的染色體中進行表達；(1)IFNα2 cDNA的克隆取正常人外周血加淋巴細胞分離液，分離出人血白細胞，用含有5％胎牛血清的DMEM培養基稀釋至細胞濃度為5×107個/ml，加入新城雞瘟病毒到100血凝單位/ml，37℃，5％CO2，培養1小時，使病毒吸附在細胞上，1000×g離心棄上清，加入新鮮的有5％胎牛血清的DMEM培養基，37℃，5％CO2，培養18小時；用RNA提取試劑盒分離總RNA，用一步法RT-PCR試劑盒反轉錄為cDNA並從中擴增出IFNα2，所用的引物如下Pa2b15』-AGAGTCGACATGTGTGATCTGCCTCAA-3』Pa2b25』-GCCAAGCTTTCATTCCTTACTTCTTAAACT-3』一步法RT-PCR反應體系配製如下10×one step RNA PCR Buffer5μl25mM MgCl210μl10mM dNTP 5μlRNase inhibitor(40U/μl) 1μlAMV-optimized Taq 1μlAMV RTase XL(5U/μl) 1μl10μM Pa2b12μl10μM Pa2b22μl提取的總RNA1μlRNase Free H2O 22μl總體積 50μl反應條件為50℃30分鐘，94℃變性2分鐘，94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環30次；通瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶；用PCR片段膠回收試劑盒純化出0.5kb的目標片段；純化好的目標片段和載體pBlueScriptII KS(+)，經SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收；用T4連接酶連接兩雙酶切後純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物塗布於含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種於20ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，並對重組質粒SalI和HindIII酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍於-80℃；重組質粒命名為pBlue-IFNα2，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-IFNα2；(2)HSA cDNA的克隆利用PCR從人胎肝cDNA文庫中擴增出HSA cDNA，所用的引物為HSA15』-AGAGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3』HSA25』-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3』PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的HSA1和HSA2的引物各3μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 1μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文庫1μg，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，循環30次；通瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶，用PCR片段膠回收試劑盒純化出1.8kb的目標條帶，純化好的目標片段和載體pBlueScriptIIKS(+)分別經SalI和HindIII雙酶切；瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收，用T4連接酶連接兩雙酶切後純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物塗布於含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種於20ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及SalI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，並對重組質粒SalI和HindIII酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍於-80℃；重組質粒命名為pBlue-HSA，陽性重組子命名為DH5α/pBlue-HSA；(3)HSA cDNA和IFNα2 cDNA融合基因的克隆HSA cDNA的PCR擴增，所用引物如下Pf15』-CCCTCCGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3』Pf25』-TGGGTTTGAGGCAGATCACATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3』PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的Pf1和Pf2的引物各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-HSA 1ng，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環30次；IFNα2 cDNA的PCR擴增，所用引物如下Pf35』-GTCAAGCTGCCTTAGGCTTATGTGATCTGCCTCAAACCCA-3』Pf45』-CATAAGGCGGCCGCTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTC-3』PCR方法如下50μl的反應體系中加入10μmol/L的Pf3和Pf4的引物各2.5μl，2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，pBlue-IFN α21ng，加雙蒸水補齊50μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸90秒，94℃變性1分鐘，循環30次；利用重疊PCR融合HSA和IFNα2 cDNA將IFNα2的PCR擴增產物和HSA的PCR擴增產物分別稀釋40倍，再以1∶1比例混合後作為模板，於50μl的反應體系中加入2mmol/L的dNTP 5μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，混合好的模板1μl，加雙蒸水補齊45μl；PCR條件為95℃變性5分鐘，65℃退火1分鐘，72℃延伸4分鐘，94℃變性1分鐘，循環10次後，向反應體系中加入10μmol/L的Pf1和Pf4的引物各2.5μl，繼續做30次循環；通瓊脂糖凝膠電泳分析反應產物，在加樣泳道出現目標條帶；用PCR片段膠回收試劑盒純化出2.2kb的目標片段；純化好的目標片段HSA-IFNα2和載體pBlueScript II KS(+)，經EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收；用T4連接酶連接兩雙酶切後純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌XL-1 blue感受態細胞，轉化物塗布於含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取白色菌落，接種於20ml含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及EcoRI和NotIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，並對重組質粒EcoRI和NotIII酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍於-80℃；重組質粒命名為pBlue-HSA-IFNα2，陽性重組子命名為XL-1/pBlue-HSA-IFNα2；(4)HSA-IFNα2酵母表達系統構建取一支凍存的XL-l/pBlue-HSA-IFNα2，20ml含有100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；質粒pBlue-HSA-IFNα2和酵母表達載體pPIC9K，經EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化，用PCR片段膠回收試劑盒回收；用T4連接酶連接兩雙酶切後純化好的片段；連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化物塗布於含有100μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜；挑取若干個菌落，分別接種於20ml 100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中37℃培養過夜，提取質粒；通過PCR，及EcoRI和NotI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑑定陽性克隆，並對重組質粒EcoRI和NotI酶切位點間區域進行DNA測序；陽性重組子保存在含有20％甘油的LB中，凍於-80℃；重組質粒命名為pPIC-HSA-IFNα2，陽性重組子命名為DH5α/pPIC-HSA-IFNα2；提取DH5α/pPIC-HSA-IFNα2中的質粒，經SalI酶切後，電擊轉化畢赤酵母KM71；提取酵母基因組DNA，通過PCR，瓊脂糖凝膠電泳鑑定重組子；陽性重組子命名為KM71/pPIC-HSA-IFNα2；(5)HSA-IFNα2融合蛋白的表達將KM71/pPIC-HSA-IFNα2接種至裝有100ml BMGY的500ml三角瓶中，300rpm，29℃培養至A600nm為2～6，離心收集菌體；將收集到的菌體接種至裝有20mlBMMY的100ml三角瓶中，每24小時補加一次甲醇至終濃度0.5％，誘導7天；離心收集上清，過濾除菌，用細胞病變抑制法測定上清中的HSA-IFNα2活性；Western雜交檢測產物HSA的免疫源性。
2.用權利要求1所述方法製備的人α2幹擾素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特徵是包括與人α2幹擾素至少85％序列同源的第一區和與人血清白蛋白至少85％序列同源的第二區或人血清白蛋白的部分胺基酸序列第二區；所述與人α2幹擾素同源的第一區位於融合蛋白的N末端，所述與人血清白蛋白同源的第二區位於融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽；或所述與人血清白蛋白同源的第二區位於融合蛋白的N末端，所述與人α2幹擾素同源的第一區位於融合蛋白的C末端，中間不加任何連接肽。
3.根據權利要求2所述的人α2幹擾素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特徵在於所述融合蛋白包括與人α2幹擾素至少95％序列同源的第一區和與人血清白蛋白至少95％序列同源的第二區。
4.根據權利要求2所述的人α2幹擾素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特徵在於所述融合蛋白的第二區由人血清白蛋白部分結構域組成或經結構域重排後的人血清白蛋白組成。
5.根據權利要求2所述的人α2幹擾素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特徵在於所述融合蛋白包括與人α2幹擾素胺基酸殘基序列相同的第一區和與人血清白蛋白胺基酸殘基序列相同的第二區，或上述二區的功能等同物。
6.根據權利要求5所述的人α2幹擾素與人血清白蛋白的融合蛋白，其特徵在於所述功能等同物是在不改變所述融合蛋白特性的前提下，對融合蛋白個別胺基酸殘基的取代、缺失或加入得到的多肽。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵是宿主表達系統是細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞、植物細胞表達系統。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵是優選的宿主表達系統是酵母。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵是優選的酵母是畢赤酵母。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵是優選的畢赤酵母是畢赤酵母KM71。
全文摘要
人α2幹擾素與人血清白蛋白的融合蛋白的製備方法及產品，屬於長效融合蛋白藥物技術領域。本發明利用重疊PCR技術，連接IFNα2 cDNA和HSA cDNA，中間不加入任何連接肽，得到的HSA－IFNα2 cDNA融合基因被整合到宿主的染色體中進行表達；本發明的融合蛋白包括與人α2幹擾素至少85％序列同源的第一區和與人血清白蛋白至少85％序列同源的第二區，兩區直接連接，中間不加入任何連接肽，該融合蛋白可以在不改變融合蛋白特性的前提下，進行個別胺基酸殘基的取代、缺失或加入；宿主表達系統可以是細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞、植物細胞等。本發明的融合蛋白在保持了人α2幹擾素的生理特性的基礎上延長其在體內的半衰期，在藥學領域有良好的應用前景。
文檔編號C07K14/765GK1831124SQ20061003879
公開日2006年9月13日 申請日期2006年3月10日 優先權日2006年3月10日
發明者金堅, 雷楗勇, 楊健良, 張蓮芬, 竇文芳, 徐鈺, 李潔 申請人:江南大學