產甘油假絲酵母NAD⁺依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因及其克隆的製作方法

2023-05-19 18:10:21 1

專利名稱：產甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因及其克隆的製作方法
產甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因及其克隆技術領域產甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因及其克隆，涉及微生物 學，基因工程和分子生物學等領域，特別涉及一種耐高滲產甘油假絲酵母中甘 油合成途徑的關鍵酶編碼基因NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因及其克隆。
背景技術：
當細胞處於高滲透壓環境中時，為了保持胞內的水分和小分子物質向環境 中外洩，就需要通過自身合成一些生物相容性物質來提高胞內的滲透壓來平衡 胞內和胞外的壓力差，從而起到保護和防禦細胞的作用。對於酵母細胞而言， 在滲透壓脅迫作用時產生的生物相容性物質主要是甘油，還有少量的其他多元 醇。NAD+依賴性3-磷酸甘油脫氫酶是釀酒酵母細胞以葡萄糖為碳源合成甘油過 程的限速酶，編碼該酶的基因存在兩個異構形式:G^D7和GPD2，前者受滲透 壓誘導表達，而後者在厭氧環境中起著平衡氧化還原力的作用。G屍D7基因的表 達水平是受到促有絲分裂源蛋白激酶(MAPK)介導的高滲壓甘油應答途徑 (HOG)調控的。但是對於沒有經過人工誘變或分子改造的釀酒酵母，其甘油 合成能力有限，通常為每升發酵液中含有幾克到十幾克甘油。產甘油假絲酵母(C朋cfe/ag/ycm'"oge朋W WL2002-5-59，是從自然界中分離 出來的一種優良的能夠耐高滲壓的甘油生產菌株，它能在25X葡萄糖或5XNaCl 的高滲透壓培養基上正常生長繁殖，在實驗室規模發酵中，甘油產量可達到 12%，即使在工業化規模中，甘油產量也可達到10%，這是用釀酒酵母甘油代謝 理論難以解釋的。目前，該酵母已經應用於甘油發酵的工業化生產，然而與釀 酒酵母相比，其相關的分子知識和遺傳背景非常缺乏。該產甘油假絲酵母 (Ca"&<iag/jcen'"oge"&^ WL2002-5-59巳在中國專利CN1070235C中公開，公告 日2001年8月29日。產甘油假絲酵母(C. g/yceW"oge"^) WL2002-5-59甘油合成的關鍵酶基因 NAD、甘油3-磷酸脫氫酶基因克隆有以下幾點重要作用1、 為從分子水平上深入研究Caws^fag/少cen'woge"a5高產甘油的代謝機制奠 定了基礎。2、 為試圖通過分子改造進一步提高OzW油g^^"o^"^的發酵特性提供 了可能性。3、 為研究不同酵母屬種的高滲壓信號轉導途徑之間的差異提供了材料。4、 為微生物和真核生物的抗逆性改良研究特別是抗高滲透壓研究提供了更加豐富的優良候選基因。 發明內容甘油3-磷酸脫氫酶是假絲酵母(C朋^fog/少cer/wogew^) WL2002-5-59高產 甘油中的限速酶，本發明的目的在於提供一種新的產甘油假絲酵母甘油3-磷酸 脫氫酶基因及其編碼序列。在本發明中，術語"甘油3-磷酸脫氫酶"、"胞漿NAD+-依賴的甘油3-磷 酸脫氫酶"、"3-磷酸甘油脫氫酶"或/和"GPD"可互換使用，都指具有產甘 油假絲酵母甘油3-磷酸脫氫酶胺基酸序列(SEQIDN0.2)蛋白或多肽。甘油3-磷酸脫氫酶脫氫酶催化的反應如下sn-Glycerol 3-phosphate+NAD+ _ Glycerol 3-phosphate+NADH一方面，本發明提供一種包含編碼甘油3-磷酸脫氫酶基因的DNA片段。 更具體的說，本發明提供包含調控序列，如啟動子和終止子，以及甘油3-磷酸脫氫酶基因的開放閱讀框的DNA分子。本發明提供編碼Om^/a g/ycm'woge"" WL2002-5-59的甘油3-磷酸脫氫酶 基因的DNA片段。所述DNA是指含有側翼5、-和3'-非翻譯區中的短片段之間 的開放閱讀框的DNA或包含有調控序列如在C^2^Wa g/ycer&oge"" WL2002-5-59表達甘油3-磷酸脫氫酶基因所必需的啟動子和終止子的基因組 DNA。相應地，本發明涉及含有選自下述組的核酸分子的多核苷酸a) 編碼SEQIDNO.2的胺基酸序列的多肽的多核苷酸，b) 與編碼含有SEQ ID N0.2的胺基酸序列的多肽至少70%同源性的胺基酸 序列的多肽的多核苷酸，c) 與a)或b)的多核苷酸互補的多核苷酸，d) 與a)中經過一個或多個鹼基的取代、缺失或添加的有義突變。 在本發明的另一方面，提供了一種編碼的多肽，所述多肽具有與SEQ IDNO.2所示胺基酸序列至少70y。同源性的序列或其片段。更佳的，所述多肽是含 有SEQ ID N0.2所示胺基酸序列的多肽。 本發明的技術方案一種產甘油假絲酵母(g/ycen'w ge"" ) WL2002-5-59中分離的多核 苷酸，其核苷酸序列為SEQIDNO.l。如上所述的多核苷酸的2082bj>~3249bp的核苷酸序列，編碼基因產甘油假 絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶，其胺基酸序列為SEQ ID N0.2。其2082bp—3249bp的核苷酸序列，經過一個或多個鹼基的取代、缺失、置 換、倒位或添加的有義突變。所述的多核苷酸含有SEQ IDNO.l中自起始密碼子ATG上遊向前的 l-2081bp核苷酸序列。所述產甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因的克隆(1) 簡併引物PCR擴增產甘油假絲酵母WL2002-5-59的甘油3-磷酸脫氫 酶基因片段以GeneBank公布的其他物種的甘油3-磷酸脫氫酶的基因序列為基礎，通過 序列比對分析，設計簡併引物CD-U: 5'-TBRTBGGITCHGGYAAITGGG-3'， CD-R: 5'-RGCVAIVAYRTTYTTYARIGC-3';通過PCR技術，以WL2002-5-59基因組DNA為模板，以CD-U， CD-R為 引物擴增獲得0.63kb的核苷酸片段，經過TA克隆，測序；(2) 反向引物PCR擴增WL2002-5-59的甘油3-磷酸脫氫酶基因的全長序列根據簡併引物PCR獲得的DNA序列結果，設計一對反向引物 Cgl-F: 5'-C CTTATTTCCGTGTTCGTGTTATTAGTG-3'， Cgl-R: 5'-CGCCTTCAATCAATTC TTCATAGAC-3';提取WL2002-5-59基因組DNA，分別用萬"wH I 、戶W I 、 1酶切後用 酚、氯仿純化，再用T4DNA連接酶進行自身連接環化，用乙醇沉澱後作模板進 行PCR擴增分別獲得6.7kb 、 2.5kb、 2.3kb的DNA片段，經TA克隆挑選陽性 轉化子，序列測定拼接後獲得全長的產甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫 酶編碼基因及其側翼調控序列。本發明的有益效果本發明採用簡併引物PCR和反向PCR法從產甘油假絲 酵母WL2002-5-59的染色體基因組中克隆出甘油合成的限速酶基因產甘油假 絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因(CgG屍Z))及其側翼的調控序列。該 基因全長4900bp，在2082bp處具有起始密碼子ATG， 3246bp處具有終止密碼 子TAA。該序列無內含子，具有1167bp完整的開放閱讀框，編碼388個胺基酸。 所述基因的胺基酸序列與釀酒酵母(5Wcc/zaram;;cas ce^v^'ae)基因G屍D1同源 性高達60%，與安格斯畢赤酵母(屍/cWaa"g^to)基因同源性高達70%。 該基因的克隆擴大了微生物抗滲透壓脅迫研究的基因資源，也為產甘油假絲酵 母高產甘油的分子機理研究奠定了基礎。CgG戶Z)基因的克隆為運用基因工程技 術改善微生物及其它高等真核生物的抗逆性改良研究提供了更加豐富的優良候 選基因。


圖1、簡併引物PCR擴增甘油3-磷酸脫氫酶基因0.63kb片段。Lane 1 DNA Marker: DL2000; Lane 2 and Lane 3簡併引物PCR產物。圖2、反向PCR擴增甘油3-磷酸脫氫酶基因及其側翼序列。
Lane 1, DNA Marker: JDNA/揚dlII; Lane 2,以BamH I酶切基因組DNA的反向PCR產物； Lane 3,以屍W I酶切基因組DNA的反向PCR產物； Lane 4，以1酶切基因組DNA的反向PCR產物； Lane 5 ， DNA Marker: DL2000 。
具體實施方式
下面通過具體的實施例進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明。實施例1:簡併引物PCR擴增Ca"&A g/少cehwoge"" WL2002-5-59的甘油 3-磷酸脫氫酶基因片段1. 簡併引物的設計搜索GeneBank公布的相關酵母和其他真核生物的甘油3-磷酸脫氫酶基因 的序列，通過胺基酸序列的比對分析，找到兩個保守區域對應的胺基酸序列為 VVGSGNWGT和GALKNVVA，根據這兩個保守區域設計一對簡併引物CD-U: 5'-TBRTBGGITCHGGYAAITGGG-3'，CD-R: 5'畫RGCVAIVAYRTTYTTY認GC-3'。其中I指次黃嘌呤鹼基；R指A或G; Y指C或T; H指A、 C或T; V指A、 C或G; B指C、 G或T。2. C朋^ia g(ycenVwge"es WL2002-5-59基因組DNA的提取 產甘油假絲酵母WL2002-5-59染色體DNA製備按參考文獻[酵母遺傳學技術手冊]進行。將提取的DNA用DU640核酸蛋白分析儀進行測定，根據A260/A28 的比值判斷所提取的DNA純度，利用260nm下的OD值計算所提取的DNA濃 度，同時，通過瓊脂糖凝膠電泳判定模板的質量。3. PCR擴增反應體系50 ML，包含5 10x Hot Start TaqTM Buffer (Mg2+ plus,大連寶生 物公司)，化L 2.5mM DNTPs， l^L l.OOmM簡併引物CD-U和CD-R, IjiL C. g/_ycm'wogewas WL2002-5-59基因組DNA作為模板，加入1.25 U Hot Start Taq，(大連寶生物公司)，最後用水補足體積50 nL。 PCR擴增條件95°C變性 4分鐘，隨後94'C 50秒、56°C 90s、 72°C 2分鐘進行32個循環，最後以 72。C延伸15鍾。電泳檢測PCR產物，獲得片段長度約為0.63kb的核酸分子， 膠回收後按pGEM-T-Easy (Promega)試劑盒操作說明進行TA克隆，測序結果獲 得一個631 bp的序列。將該序列及其編碼蛋白質序列用Blast程序在GeneBank (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發現它與 安格斯畢赤酵母的甘油3-磷酸脫氫酶基因有較高的同源性，證實了簡併引物的
正確性。實施例2:反向引物PCR擴增甘油3-磷酸脫氫酶基因的全長序列1、 反向PCR引物的設計根據簡併引物PCR擴增獲得的序列結果，設計一對反向PCR引物 CgI畫R: 5'畫CGCCTTCAATCAATTCTTCATAGAC-3'用於PCR擴增。2、 PCR模板的製備按上述方法提取C. g(ycen'wogew^ WL2002-5-59的基因組DNA，分別用限 制酶萬"mH I ,戶W I和1各酶切5jig基因組DNA，瓊脂糖電泳檢査酶切效果。 用l: 1的酚和氯仿等體積抽提酶切產物，然後用2.5倍體積的無水乙醇沉澱， 最後溶於50)iL超純水中。在200pL連接體系中，加入O.l昭酶切後的DNA ， 20pL的連接緩衝液和10UT4DNA連接酶，用水補足體積，16匸過夜。連接 產物用無水乙醇沉澱後，溶於25(iL無菌超純水中，用於下一步反向PCR擴增。3、 反向PCR擴增反向PCR擴增體系50 ^L: 50 ng自環化的基因組DNA作為模板，5 pL 10xLA TaqTM Buffer (大連寶生物公司)，8|iL 2.5mM的DNTPs,上下遊引物各 lpL和1.25 ULATaqW(大連寶生物公司)，用無菌水補足體積50 ^。 PCR擴增 條件如下95°C變性4分鐘，隨後94°C 50秒、60°C 3分鐘、68°C 3.5 分鐘進行35個循環，最後以72 i:延伸IO分鐘。電泳檢測擴增產物，用B謹H I酶切後自環化的基因組DNA作為模板獲得6.7kb的DNA片段，用i3" I酶 切後自環化的基因組DNA作為模板獲得2.5kb的DNA片段，用1酶切後自 環化的基因組DNA作為模板獲得2.3kb的DNA片段，分別膠回收6.7kb、 2.5kb 和2.3kb後，按pGEM-T-Easy (Promega)試劑盒操作說明進行TA克隆，通過藍 白鑑定挑取陽性克隆測序。測序結果經拼接後獲得全長的C. g/少cen'"oge"^甘油 3-磷酸脫氫酶基因序列和側翼序列。實施例3: C. gfycen'MogMM甘油3-磷酸脫氫酶基因序列信息和同源性分析本發明產甘油假絲酵母甘油3-磷酸脫氫酶基因的核苷酸序列全長4900bp， 詳細序列見SEQIDNO.l，其中開放閱讀框於2082-3246位核苷酸，編碼388個 胺基酸，並且內部編碼框內不含有內含子。將產甘油假絲酵母甘油3-磷酸脫氫酶基因序列及其編碼蛋白用BSLAT程序translations+PDB+SwissProt +PIR資料庫進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果 發現在胺基酸水平上，它與安格斯畢赤酵母的甘油3-磷酸脫氫酶基因有70%的 同源性，與釀酒酵母的甘油3-磷酸脫氫酶基因有60%的同源性。由此可見，產
甘油假絲酵母甘油3-磷酸脫氫酶基因與其它酵母的甘油3-磷酸脫氫酶基因在蛋 白質水平上存在較高的同源性，屬於同一家族蛋白。實施例4:產甘油假絲酵母甘油3-磷酸脫氫酶蛋白的結構和功能將產甘油假絲酵母甘油3-磷酸脫氫酶蛋白的胺基酸在blocks資料庫 (http:/www.blocks.fhcrc.org)中檢索結構域，發現在該胺基酸序列中存在甘油 3-磷酸脫氫酶蛋白功能模塊，因此可以預見其具有甘油3-磷酸脫氫酶蛋白的相應 功能。用在線預測軟體(http:/www.psortnibb.ac.jp)進行蛋白的亞細胞定位分析 發現，產甘油假絲酵母甘油3-磷酸脫氫酶蛋白是位於細胞的胞漿中，這進一步 驗證了所克隆的基因是屬於胞漿NAD+-依賴的甘油3-磷酸脫氫酶。SEQ ID NO.lCtgCagELgtCat ttaaaaaa caacaatgcc agtcccatct cacaggccac acactgtact ttagacgtga agattgcgcagtggtgggtc ggtgaagtgt 鄉ga犯ggc aaatg鄉gggatggttatc caccattatt ttcgccataa gccgcggtta cttttttttc catttccgga cagtctgtac tctccggagt 卿ggtagcg caggLgtcca/t tccgtaaaat atggtt犯ac tggcaatctc ggccacatgc 犯a^cttggc ttggcaaatt ttg犯ggcgt agtggcgttt ttggcaa鄉 gtttatttta tctcaaatac gattatctac cagaagacta gtacaattgc atgttaatattctacgtttt ccactacagt gtcg犯3犯c ggc卿caag aggaagtSLgt ctccaacaag aggatctgtt a"gcg鄉g3t agtgcagggt 3ttcta^g8g aagaaggtaa3C3gtg3gtggggatggtgt agaaactttg actattattaa>C8LgeLgSLCCggg卿ggctg cgcagcacac ctctttttct acaacaatag atgcacgttt ccaggtctcgttgaaaacct ggcgt犯tat 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125Gin Leu Lys Gly Lys 140Leu Lys Gly Leu Asp 155Thr Val lie Thr Glu 170Gly Ala Asn Leu Ala 185Thr Thr Val Ala Tyr 200Lys Asp lie Asp His 215Tyr Phe Arg Val Arg 230Ala Gly Ala Leu Lys 245Glu Arg Leu Ser Thr 10Asp Ser Thr Ser Leu 25Lys Val Thr Val Val 40Lys Val lie Ala Glu 55Arg Asp Val Asn Met 70Lys Leu Thr Glu lie 85Leu Pro Gly lie Lys 100lie Val Glu Ala Cys 115Pro His Gin Phe Leu 130Val Asn Pro Lys Ala 145Val Asn Pro Asn Gly 160Glu Leu Gly lie Tyr 175Pro Glu Val Ala Gin 190Thr lie Pro Asp Asp 205Gin lie Leu Lys Ser 220Val lie Ser Asp Val 235Asn Val Val Ala Met 250lie Ala Ser Thr lie 15Gin Pro Glu Asp Tyr 30Gly Ser Gly Asn Trp 45Asn Thr Val Glu Arg 60Trp Val Tyr Glu Glu 75lie Asn Thr Arg His 90Leu Pro Val Asn Val 105Ala Gly Ser Asp Leu 120Pro Arg lie Leu Ser 135Arg Ala lie Ser Cys 150Cys Lys Leu Leu Phe 165Cys Gly Ala Leu Ser 180Cys Lys Trp Ser Glu 195Phe Arg Gly Lys Gly 210Leu Phe His Arg Pro 225Ala Gly lie Ser lie 240Ala Ala Gly Phe Val 255Glu Gly Leu Gly Trp 260lie Gly Leu Val Glu 275Gly Cys His Ala Ala 290Asp Leu lie Thr Thr 305Arg Tyr Met Ala Gin 320Lys Leu Leu Asn Gly 335Glu Val Tyr Glu Phe 350Pro Leu Phe Thr Thr 365lie Glu Lys Leu Pro 380Gly Asp Asn Ala Lys 265Thr lie Gin Phe Ala 280Thr Phe Thr His Glu 295Cys Ala Gly Gly Arg 310His Ser Val Ser Ala 325Gin Ser Cys Gin Gly 340Leu Ser Asn Met Gly 355Thr Tyr Arg lie lie 370Glu Cys Leu Glu Pro 385Ala Ala Val Met Arg 270Lys Thr Phe Phe Asp 285Ser Ala Gly Val Ala 300Asn Val Arg Val Gly 315Thr Glu Ala Glu Glu 330lie His Thr Thr Arg 345Arg Thr Asp Glu Phe 360Tyr Glu Asn Phe Pro 375Val Glu Asp 388
權利要求
1、一種產甘油假絲酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5-59中分離的多核苷酸，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。
2、 如權利要求1所述的多核苷酸的2082b^3249bp核苷酸序列，編碼基 因產甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶，其胺基酸序列為SEQ ID N0.2。
3、 根據權利要求l所述的一種分離的多核苷酸SEQIDNO.l，其特徵是其 2082bp~3249bp核苷酸序列，經過一個或多個鹼基的取代、缺失、置換、倒位 或添加的有義突變。
4、 根據權利要求l所述的一種分離的多核苷酸SEQIDNO.l，其特徵是所 述的多核苷酸含有SEQ ID NO.l中自起始密碼子ATG上遊向前的l-2081bp核苷 酸序列。
5、 如權利要求2所述產甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因的 克隆，其特徵是(1) 簡併引物PCR擴增產甘油假絲酵母WL2002-5-59的甘油3-磷酸脫氫 酶基因片段以GeneBank公布的其他物種的甘油3-磷酸脫氫酶的基因序列為基礎，通過 序列比對分析，設計簡併引物CD畫U: 5 '網TBRTBGGITCHGGYAAITGGG國3 '， CD畫R: 5 '-RGCVAIVAY R TTYTTYARIGC-3';通過PCR技術，以WL2002-5-59基因組DNA為模板，以CD-U， CD-R為 引物擴增獲得0.63kb的核苷酸片段，經過TA克隆，測序；(2) 反向引物PCR擴增WL2002-5-59的甘油3-磷酸脫氫酶基因的全長序列根據簡併引物PCR獲得的DNA序列結果，設計一對反向引物 Cgl-F: 5'-C CTTATTTCCGTGTTCGTGTTATTAGTG-3'， CgI畫R: 5'畫CGCCTTCAATCAATTC TTCATAGAC-3';提取WL2002-5-59基因組DNA，分別用BawH I 、 A〉 I 、 &/I酶切後用 酚、氯仿純化，再用T4DNA連接酶進行自身連接環化，用乙醇沉澱後作模板進 行PCR擴增分別獲得6.7kb 、 2.5kb、 2.3kb的DNA片段，經TA克隆挑選陽性 轉化子，序列測定拼接後獲得全長的產甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫 酶編碼基因及其側翼調控序列。
全文摘要
產甘油假絲酵母NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因及其克隆，屬於微生物分子生物學領域。本發明涉及一種新的基因序列SEQID NO.1，採用簡併引物PCR和反向PCR法從產甘油假絲酵母WL2002-5-59的基因組DNA中克隆出甘油合成的限速酶NAD+依賴-甘油3-磷酸脫氫酶基因及其側翼的調控序列。該基因全長4900bp，在2082bp處具有起始密碼子ATG，3246bp處具有終止密碼子TAA。該序列無內含子，具有1167bp完整的開放閱讀框，編碼388個胺基酸。其與釀酒酵母GPD1基因同源性高達60％，與安格斯畢赤酵母GPD基因同源性高達70％。該基因的克隆擴大了微生物抗滲透壓脅迫研究的基因資源，也為產甘油假絲酵母高產甘油的分子機理研究奠定了基礎。
文檔編號C12N15/53GK101157931SQ200710131859
公開日2008年4月9日 申請日期2007年9月6日 優先權日2007年9月6日
發明者方慧英, 微 沈, 王正祥, 諸葛健, 陳獻忠, 饒志明 申請人:江南大學