植物耐逆性相關蛋白GmSIK2及其編碼基因與應用的製作方法

2023-05-20 07:43:26

專利名稱：：植物耐逆性相關蛋白GmSIK2及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種植物耐逆性相關蛋白及其編碼基因與應用，特別涉及一種來源於大豆的耐逆性相關受體類蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
：環境中物理化學因素的變化，例如乾旱、鹽鹼、冷害、凍害、水澇等脅迫因素對植物的生長發育有重要的影響，嚴重時會造成農作物大規模減產，培育耐逆性提高的作物是種植業的主要目標之一。培育耐逆性提高的作物的方法包括傳統育種和分子遺傳育種。目前，分子遺傳育種已經成為科技工作者所關注的領域之一。在非生物逆境脅迫下，高等植物細胞內存在多種途徑感受和應答外界環境中物化參數的變化，將胞外信號變為胞內信號，經過一系列磷酸化級聯反應將信號傳遞到細胞核，利用轉錄因子調控相關的功能基因，可以影響逆境應答基因的表達，提高植物的耐逆性。植物耐非生物脅迫相關基因已有很多報導，包括效應分子基因和調控基因。效應分子基因包括膽鹼單氧化物酶(CM0)基因、甜菜鹼醛脫氫酶(BADH)基因、脯氨酸合成酶基因族中的吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因、胚胎晚期豐富(LEA)蛋白基因、H+-ATPase基因、Na7H+反向轉運蛋白基因、水孔蛋白基因和與細胞周期相關的基因等。調控基因包括受體類激酶、轉錄因子和其它調控蛋白。水稻作為最重要的糧食作物之一，提高其耐逆性具有重要的理論及現實意義。轉基因水稻植株的成功(Rainerietal.，1990)和水稻基因組測序工作的完成為研究發現新的耐逆境基因提供了有利條件。
發明內容本發明的一個目的是提供一種植物耐逆性相關蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的耐逆性相關蛋白，名稱為GmSIK2(StressInducibleKinase2)，來源於大豆(67yc眾e鵬x(L.)Merr)，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列l所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。序列表中的序列1由897個胺基酸殘基組成，包含信號肽(自序列1的氨基末端第1至23位胺基酸殘基)、胞外LRR結構域(自序列1的氨基末端第435至479位胺基酸殘基)、跨膜區(自序列1的氨基末端第517至539位胺基酸殘基)和胞內激酶結構域(自序列1的氨基末端第590至859位胺基酸殘基)，具有受體類激酶結構的典型特徵。受體類激酶家族根據激酶結構域的進化關係可分為不同的亞家族，按照這種分類方法，GmSIK2屬於LRK-IOL亞家族，其胞外沒有已知的結構域。用GmSIK2激酶結構域胺基酸序列分別在NCBI資料庫中比對，發現了相似基因，GmSIK2蛋白激酶結構序列與水稻Lrl0(0s01g0117100)激酶結構區有58%的相似性。所述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指將序列l的全序列中任何位點的胺基酸進行取代和/或缺失和/或添加。為了使(a)中的GmSIK2便於純化，可在由序列表中序列l所示的胺基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標籤。tableseeoriginaldocumentpage4上述(b)中的GmSIK2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的GmSIK2的編碼基因可通過將序列表中序列2自5'端第1至2694位鹼基所示的DNA序列中缺失一個或幾個胺基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個鹼基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標籤的編碼序列得到。上述植物耐逆性相關蛋白的編碼基因也屬於本發明的保護範圍。所述植物耐逆性相關蛋白的編碼基因為如下l)或2)或3)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與l)或2)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA分子。上述嚴格條件可為在6XSSC，0.5y。SDS的溶液中，在65。C下雜交，然後用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。序列表中的序列2由2694個脫氧核糖核苷酸組成，自5，末端的第1至2694位脫氧核糖核苷酸為6k57Z的開放閱讀框(OpenReadingFrame,0RF)。6k57A2"的表達明顯受低溫、鹽、乾旱、脫落酸和水楊酸的誘導。含有6kS7A^基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系及重組菌均屬於本發明的保護範圍。可用現有的植物表達載體構建含有^A57X基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用於植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3'端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3'端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。使用6kS力B構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素標記物、卡那黴素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。所述重組表達載體具體可為將pBin438的5a/dH和《pM位點間的小片段取代為序列表中序列2自5'末端第1-2694位脫氧核苷酸得到的pBin438-ftaSTAZ本發明的另一個目的是提供一種培育耐逆植物的方法。本發明所提供的培育耐逆植物的方法，是將所述植物耐逆性相關蛋白的編碼基5因導入植物細胞中，得到耐逆植物；具體來說，可以將所述含有6^57Z基因的重組表達載體導入植物細胞中，得到耐逆植物。利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的水稻受體類蛋白GmSIK2的編碼基因導入植物細胞，可獲得對乾旱和鹽等非生物逆境脅迫耐受力增強的轉基因細胞系及轉基因植株。攜帶有編碼基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，並將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如百脈根、擬南芥、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。所述耐逆植物具體可為對非生物脅迫的耐逆植物，如對乾旱和/或鹽脅迫的耐逆植物。實驗證明，本發明的耐逆性相關蛋白及其編碼基因能顯著提高植株的耐鹽性和耐旱性。本發明的耐逆性相關蛋白及其編碼基因對培育耐逆植物品種，特別是培育耐非生物脅迫如耐乾旱和/或耐鹽植物品種，從而提高農作物產量具有重要意義。以下結合附圖及具體實施例進一步闡述本發明。以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。圖1為5'-RACE和3'-RACE獲得的片段的電泳結果。圖2為Cfe57Z基因在不同組織器官中的表達特徵。圖3為^AS7J^基因在不同逆境脅迫下的表達特徵。圖4為pBin438-Ck57A^示意圖。圖5為轉6kS7Z基因百脈根RT-PCR鑑定圖。圖6為高表達的轉6k57A^基因百脈根RT-PCR鑑定圖。圖7為轉6k57Z基因百脈根正常條件下的生長情況。圖8為轉ft/7577B基因百脈根鹽脅迫下的生長狀況和存活率。圖9為轉^A57Z基因百脈根乾旱脅迫下的生長狀況和存活率。圖10為轉6k57Z基因擬南芥RT-PCR鑑定圖。圖11為轉fiz57Z基因擬南芥鹽脅迫下的生長狀況和存活率。具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。實施例1、大豆耐逆性相關受體激酶基因fi7A57J2的篩選及其cDNA的克隆一、fiaS7"A^的篩選根據發明人測定的3萬條EST序列和GenBank下載的28萬多條序列一起進行EST聚類，得到56，147個單一基因(unigenes)，其中包括32，278個重疊群(Contigs)和23，869個單拷貝序列(singleton)(Tianetal.,2004)。在擬南芥已有的單一基因(unigenes)注釋的基礎上，對大豆的單一基因(unigenes)的功能進行分類注釋。根據已知的大豆受體類激酶序列與大豆單一基因(unigenes)進行比對，得到了486個大豆受體類激酶候選基因。選擇序列較完整的338個基因片段設計RT-PCR引物，分析它們在鹽、乾旱、冷和脫落酸處理等脅迫下的應答反應。篩選得到一種基因片段，其表達明顯受鹽脅迫的誘導。二、&57￡的獲得1、^57Zi"拼接序列S的獲得經EST拼接得到的基因片段長度為788bp，根據788bp序列設計用於5'-RACE和3'-RACE的基因嵌套特異引物如下用於5'-RACE基因特異引物引物1:5'-CCATAGCTTTCCGTTCAGGGTGATGTTG-3';引物2:5'—TGGGAGGTAAGGTAGAAGTCTCGGTCAT-3，。用於3'-RACE基因特異引物引物3:5'-GGAAGGTTCCCTATCATTAAGTGTGGGCC-3，；引物4:5'—GGGGCGTTGATTCTTCTAGTAGCCGTGGCA—3'。將大豆[67ycf/emax(L.)Merr]南農1138-2(南京農業大學國家大豆改良中心種質庫)種子置於培養皿中，培養室中生長2-3周，收集lg新鮮葉片，在液氮中研碎，懸於4mol/L硫氫酸胍中，用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入無水乙醇沉澱總RNA。將RNA用逆轉錄酶合成cDNA。採用RACE方法克隆基因片段的5，和3，端未知序列，具體操作依照SMARTRACE(CL0NTECH)試劑盒進行。圖1為5，-RACE禾B3，-RACEPCR擴增片段的電泳結果，其中，1:marker;2:5'-RACE擴增獲得的片段；3:3，-RACE擴增獲得的片段。5'-RACE得到約llOObp單一條帶，3'-1^〔￡得到約120(^的單一條帶。從膠中回收兩個片段，純化後連接到pGEM-TEasy載體進行測序。所測序列與已知序列進行拼接，獲得拼接序列S。在成熟mRNA3'端普遍存在PolyA尾巴，在拼接序列S的3，端有PolyA序列。7經SMART軟體分析，拼接序列S的5'端有信號肽。從NCBIBLAST分析進行驗證，拼接序列S為全長基因序列。全長基因序列由2904個脫氧核糖核苷酸組成，其中5'非編碼區由50個脫氧核糖核苷酸組成，3'非編碼區由160個脫氧核糖核苷酸組成，其開放閱讀框(ORF)為由2694個脫氧核糖核苷酸組成。2、6kSTA2"cDNA的克隆根據全長基因序列設計一對特異引物如下fiaOT肌5'-CGCGGATCCATGAGAATGTCGAGGAGTTTCC-3';^aS7A2FR:5'-CGCGTCGACCTACCTCGCCAGGGGCATGAATTC-3'。以大豆南農1138-2的cDNA為模板進行PCR擴增，對PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為2.7kb的條帶，與預期結果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收該片段。將該回收片段與pGEM-TEasy(Promega)連接，參照Cohen等的方法(ProcNatlAcadSci，69:2110)，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，根據pGEM-TEasy載體上的羧卞青黴素抗性標記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質粒。以該重組質粒載體上的T7和SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，測序結果表明擴增到的基因由2694個脫氧核糖核苷酸組成，其開放閱讀框(0RF)為序列表中序列2的自5'末端第1至2694位脫氧核糖核苷酸，編碼胺基酸序列是序列表中序列1的蛋白質。將序列1所示蛋白命名為GmSIK2，將序列2所示的基因命名為^A57J麼將含有序列2所示基因的pGEM-TEasy載體命名為pTE-6k57Z麼三、6kS7A^在不同組織器官中的表達特徵分別提取兩周齡大豆南農1138-2的幼苗的根、莖、葉和田間大豆南農1138-2的花和豆莢的RNA，用"Zwh'/7基因作為對照，RT-PCR分析fiaS7A^的表達量。"歷57Z基因在不同組織器官中的表達特徵見圖2。其中，1:根；2:莖；3:花；4:葉；5:豆莢。結果表明，6kS7Z在花和豆莢中表達較強，在葉、根和莖中表達較弱。實施例2、非生物脅迫和激素處理下大豆6kS7Z2基因的表達特徵將大豆南農1138-2[67/ci"e(L.)Merr]播種於裝滿蛭石的花盆中，生長2個星期(長出5-6片真葉)後取幼苗進行如下脅迫處理1)脫落酸(ABA)處理將根完全浸入100nMABA溶液中；2)水楊酸(SA)處理用2mM水楊酸噴灑幼苗的葉片；3)乾旱脅迫處理將大豆幼苗放置於室溫空氣中乾旱；4)低溫(4°C)脅迫處理將根完全浸入水溶液中，水溶液保持4"C;5)鹽脅迫處理將根完全浸入200mMNaCl溶液中。6)對照將根完全浸入水溶液，水溶液保持室溫。光照培養，分別在上述各種處理後O、1、3、6、12、24小時取樣，提取RNA，用^Zw7i/7基因作為對照，RT-PCR分析CkS7J2的表達量。^AS7A^基因在不同脅迫下的表達特徵見圖3。其中A:脫落酸處理；B:水楊酸(SA)處理；C:乾旱脅迫處理；D:低溫脅迫處理；E:鹽脅迫處理；F:對照。結果表明1)ABA處理6kS7J2的表達在l小時時即至峰值，然後下降；2)水楊酸處理^A57A^的表達3小時猛增到高峰，隨後緩慢下降；3)旱脅迫^ta57Z受誘導，先上升3小時達到高峰，維持到12小時，24小時下降但略高於0時；4)低溫脅迫6k57va的表達在12小時達到最大值，24小時有所降低；5)鹽脅迫6kS7J2的表達3小時達到最高，之後下降，12小時時的表達量與0時相似。實施例3、轉6kS7A^基因植株的獲得和耐逆性鑑定—、6kS7Z表達載體pBin438-6k57A7的構建用內切酶I和《p"I從pTE-fta57A^切下6k5"U基因，並將正向插入pBIN438載體上(李太元，田穎川，秦曉峰，等.高效抗蟲轉基因菸草的研究，中國科學(B輯)，1994，24(3):276-282.)，使目的基因在雙CAMV35S啟動子和Q序列引導下表達，將正確插入得到的重組質粒命名為pBIN438-6k57Z(見圖4)。二、轉^A57A^基因百脈根的獲得和耐逆性鑑定1、轉6kS7A^基因百脈根的獲得將pBIN438-6k57Z2用電轉化的方法轉入農桿菌GV3101菌株中。用含有pBIN438-6kSTA^的農桿菌轉化百脈根Leo(7o&sya"/a/^'c)。轉化方法為取生長狀態良好的無菌苗的莖節，用農桿菌侵染20-30min後，轉入誘導培養基，25'C暗培養3天。然後轉入含卡那黴素(50mg/mL)的MS篩選培養基培養30天，再更換到含卡那黴素(80rag/mL)的MS篩選培養基。篩選到的抗性植株經誘導生根，移到溫室，待到季節合適時移到農場。共獲得100株抗性株系。應用RT-PCR方法，初步鑑定出8個株系有6k57Z基因的表達，見圖5。製備轉pBin438的T。代轉空載體對照植株，方法同上。9選取上述8個轉基因株系中3個6k57X表達量較高的株系(43#株系、65共株系和72共株系)和轉空載體對照(CK)一起提取總RNA進行RT-PCR。所用的引物如下6kS7A2FL5'-CGCGGATCCATGAGAATGTCGAGGAGTTTCC-3';6kS7A2FR:5'-CGCGTCGACCTACCTCGCCAGGGGCATGAATTC-3'結果見圖6。結果表明，所選擇的3個轉基因株系中fi^7Z均有較高表達，轉空載體對照植株中fizA57A^沒有表達。2、轉ftaS7Z基因植株在正常條件下的生長情況大田生長的43tt株系、65tt株系、72tt株系和轉空載體對照的植株(CK)，取13-15cra長的新生側枝若干，放在瓶中水培養，七天後長出幼根。第8天植株的生長狀況見圖7，結果顯示，正常條件下，43tt株系、65ft株系、72財朱系轉基因植株與轉空載體對照植株生長狀況無明顯差異。3、轉fiaS7A^基因植株的耐逆性檢測以下分別檢測43ll株系、65tt株系、72ll株系轉基因植株和轉空載體對照植株(CK)在逆境脅迫下的生長狀況。1)耐鹽性試驗將大田生長的43tt株系、65#株系、72#株系轉基因植株和轉空載體對照植株，取13-15cm長的新生側枝若干，放在瓶中水培養，七天後長出幼根。分別將幼根移入lOOmMNaCl溶液，處理14天後，再置於正常條件下恢復生長3天，觀察表型並拍照，同時進行存活率統計。實驗共設三次重複，每個株系檢測10株，試驗數據為三次重複實驗的平均值土標準差。圖8中，A圖為鹽處理14天後植株的表型照片；B圖為恢復生長3天後植株的表型照片；C圖為植株的存活率比較。結果表明，轉空載體對照植株大部分葉片枯萎，頂端新生葉枯死，而轉基因植株中只有少部分側枝出現枯萎，大部分植株雖出現葉片增厚，葉子變黃，但植株仍在生長，表現出較好的耐鹽性。3個&A57J2轉基因株系存活率均在60。/a以上，明顯高於轉空載體對照植株。2)耐旱性鑑定用PEG水溶液來模擬土壤乾旱環境。PEG作為滲透調節物質，分子量大不會透過細胞壁對細胞，產生類似於土壤乾旱的脫水效應。將大田生長的43#株系、65tt10株系、72共株系轉基因植株和轉空載體對照植株，取13-15cm長的新生側枝若干，放在瓶中水培養，七天後長出幼根。分別將幼根浸入40y。PEG溶液中，l天后觀察並拍照。然後恢復澆水5天，觀察表型並拍照，同時進行存活率統計。實驗共設三次重複，每個株系檢測10株，試驗數據為三次重複實驗的平均值土標準差。圖9中，A圖為PEG處理1天後植株的表型照片；B圖為復水5天後植株的表型照片；C圖為植株的存活率比較。結果表明，PEG處理後，所有的材料葉片出現脫水打蔫，表型無明顯差異。復水後，80%的轉空載體對照植株葉片由於脫水導致乾枯，頂端不能繼續生長。在轉基因植株中，受PEG脫水而萎蔫的葉片大部分能重新吸收水分，恢復正常生長，存活率達到50%，而轉空載體對照植株的存活率僅為20%。三、Cm57A^過量表達的擬南芥的耐逆性1、轉基因擬南芥的獲得將pBin438-6k57A^用電擊法導入根癌農桿菌AGL1。PCR鑑定後，通過花浸泡的方法(Clough-SJ，Bent-AF.Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.Plant-Journal.1998，16:6，735-743)轉化哥倫比亞生態型擬南芥(Col-0)，收穫種子後，播於含卡那黴素(50mg/mL)的MS篩選培養基上，獲得T。代植株。待T。代植株長至4-6葉時移到蛭石上生長。得到了5株陽性植株。對陽性植株進行RT-PCR鑑定見圖10。圖10中，WT:野生型植株；2-6:陽性植株。其中2財直株和4財直株6k57J2表達量很高，經繁殖獲得純系後進行以下的耐逆性試驗。2、轉基因植株的耐逆性分別將2tt株系、4#株系轉基因植株和轉空載體對照植株(CK)的L代種子灑播種在NaCl濃度為lOOmM的MS培養基中，生長12天。實驗共設三次重複，每個株系檢測12個單株，試驗數據為三次重複實驗的平均值士標準差。圖11中，A圖為12天後植株的表型照片；B圖為植株發生葉片反巻的比例。結果表明，轉空載體對照植株80%葉片發生嚴重反巻，影響正常生長；轉基因植株40%出現了葉片的反巻，60%植株生長未受影響。序列表中國科學院遺傳與發育生物學研究所植物耐逆性相關蛋白GmSIK2及其編碼基因與應用CGGNARY81611〈160>2<210〉1<211〉2694<212〉薩大豆屬大豆(67yci"e麗(L.))13tg3gsatgtcgaggagtttcctagttgcttttctaggatttctagttcttgccgttctg60attcaagctcaggatcaatcaggattcatcagc3tsgcttgcggagctcctgcaggtgtg120aactttactgtgcggcaaacaggcttaaactat3C3tcagatgcaaatttcataaatact180ggtgtgagcaggac肌t8gtacctgaactc3gacatgagtttctaagaaacgtgtgg組240ctcagaagcttcccggaaggaaa犯ggaactgCt3CEl3犯taaacatcacaagaggctcc300aagtatctgatcggggcttcttttttgtacggaaattatgatggcttaaatatgttacca360肌gtttgatcttcttctcggggctaaccggtgggatacagtggacataaaaaatgcatcc420gttagccgacattttgagatccttcactggattacgtacatatctgtatg480gttg3C3C3ggccttgggacaccatttatatcagctataacgttgaggtctttgagaaat540gacatttatgEiaactgeiatttggatcattgtccgtcgggatttaggttca600a_eica_a^ggct3ca_ggt3Cg3cgatgatgtttatgatcgttactggagctatgacgaggca660gatacatggtatgacaatgtagataaatggaaacagct犯attttccgattgatgctgat720tctttagtgcCC肌CCgCC3gctgttgtcatgagcaccgcagttacacca780gcaaatgttagtgctccattggtaataagctggaagccEitatgatccaaaagagtcattc840tatgtttacatgcacttcacagagattcaagtgttagCEL8Lagaatcagacgagagagttc■12aacatcaccctgaacggaaagctatggtatgaaaatgagtctcctaggtaccacagtgtc960aatactatatatagcacttcaggcatcagtggga犯ttaattaatttttcatttgtgatg1020accgagacttctaccctacctcccatcatcaatgccattgaaatttacag3gtg3犯gag1080ttcccgcaacaagacacatacc^gga^gatgttgatgcgattacaaccatcaagtctgtt1140tatggggtgac鄉卿ttggc犯ggtgatccatgcagcccgaieLeLgactacttgtgggag1200ggtctgaattgtacgtatcccgtaattgactccccaagaatcataactttgaacttatct1260tC3agtgg3ttgtcagg犯agataggcccttcaattttaaatctcaccatgctggagaag1320ttggatttatcttgaacggtg肌gttcctgattttctgtc1380tacttgaagatcttgaacttgg3gaataataacctctccggttcaattccctcaacactt1440gttgaaaa3tCta￡lgg￡L￡Lggttccctatcatt犯gtgtgggccaaaatccatatctatgt1500gaatctggtcaatgcaatttcgagaagaaattgttacggcgcccatagta1560gcatcaattagtggggtgttgattcttcttgtagccgtggcaatattgtggacccttaaa1620Bggagaa^tca^aagaaaaatcaacagctUgatgg鯽tgaa/tgatgaaagtgagatc1680tcacgcctgcgatccacaaaaaa^gatgattcattagcgca^gtca^aa^acaaatatat1740tcatactctgacgtccttaaaatttcaatacaattattggtaaaggagga1800tttggaacagtttacctgggctatatcgatgacagtccagttgcagtgaaagtgctttctI860ccatcgtctgtaaatggctttcgacaatttc鄉c卿ggttaaacttctagtc8g3gtt1920catcacaaaaacttaacatcccttattggtt3ttgcaatg肌gg犯ccaataaggctctc1980atatatgagtatatggctaatgggaacttacaagaacatctctctggtaagcacagcaaa2040tcaacgttcttgagctgggaggacagacttCgtatagC8Lgtggatgcagccctaggattg2100gagtatctgcaaaatggttgcaagcctccaataatccacagagatgtaaaatctacaaac2160atcttgttgaatgaacacttccaagca^aattgtcagattttggtctatxcaaagctatc2220CC￡L3Ctg￡ltgggg肌tctcacgtgtcaactgtcgttgctggtactcctggttatctggEic2280cctcactgccacatatccagtagattaacacag肌a^gcgatgttcttagctttggagaa2340gttcttUggaaataatcacaaaccaaccagtaatggcaaggaatcaagaaaagggtcac2400ataagtgaaagggttagctccttgattgagsaaggagatatcagggccatagttgactca2460aggtt卿aggagattatgacattaactcagcttgg犯agccttagaaatagcaatggct2520tgtgtttctctaaatcccaacgaaaggccaggattgctattgaactaaag2580gagacattagcgatcgaaatagctcgagcaaaacattgtgatgccaatcccagatattta2640gttg3agcggttagcgtgaatgtggacaccgaattcatgcccctggcgaggta_g26942〈211〉897PRT大豆屬大豆(67ycj."e麗(L.))〈400〉2MetArgMetSerArgSerPheLeuValAlaPheLeuGlyPheLeuVal151015LeuAlaValLeulieGinAlaGinAspGinSerGlyPhelieSerlie202530AlaCysGlyAlaProAlaGlyValAsnPheThrValArgGinThrGly354045LeuAsnTyrThrSerAspAlaAsnPhelieAsnThrGlyValSerArg505560ThrlieValProGluLeuArgHisGluPheLeuArgAsnValTrpAsn65707580LeuArgSerPheProGluGlyLysArgAsnCysTyrLyslieAsnlie859095ThrArgGlySerLysTyrLeulieGlyAlaSerPheLeuTyrGlyAsn100105110TyrAspGlyLeuAsnMetLeuProLysPheAspLeuLeuLeuGlyAla115120125AsnArgTrpAspThrValAsplieLysAsnAlaSerValSerArgHis130135140PheGlulielieTyrValProSerLeuAspTyrValHislieCysMet145150155160ValAspThrGlyLeuGlyThrProPhelieSerAlalieThrLeuArg165170175SerLeuArgAsnAsplieTyrGluThrGluPheGlySerLeuGinThr14180TyrlieArgArg195AspValTyrAsp210AspAsnValAsp225SerLeuValGinAspLeuGlyArgTyrLysSer200Ser185AsnTyrLysAspTrp215LysGinLeuAsnGlyGluTrp230HisTyrGinProTyrAla220ProArg205Asp190TyrThrAspAspTrpTyrAsn245AlaAsnValSerPhe235AlaValValMetAlaValThrPro260ProLysGluSerPro250ProLeuVallieProTyrAsp275VaJLeuAlaLysAla265TyrValTyrMetlieAspAlaAsp240SerThr255TrpLyslieGin290AsnGlyLysl>euTrp305AsnThrlieTyrPhe280GinThrArgGluAsn295GluAsnGluSerHis285AsnTyr310ThrSerGlyliePhe300ArgTyrHisSer270PheThrGlulieThrLeuSer325ThrGluThrSerPro315GlyLysLeulieSerPheValMet340TyrArgValLysSer330LeuProProlielieGlulie355ValAspAlalieGlyA印370GlyAsp385GlyLeuGlu360ThrThr345PheProGinGinSerVal320AsnPhe335AsnAlalie350ThrTyrGinTrpGinGlyAsnThr375ProCysSerProCysThr405SerAsp390TyrProVallielieLysSerVal380AspAsp365TyrGlyValThrTyrProArgLeuAsnLeuSerSerSerGlyLeuSerGlyLyslieGlyAsp410GlyLys395SerLeulieProTrpGlu400lieThr415Serlie420ThrMetLeuGluLeuAsnLeu435GluValProAsp425LeuAspLeuSerAsnGly450LeuAsnLeuGluAsn465ValGluLysSerLys485GluLys440LeuSerGinLeuAsn470GluPhe455AsnLeuSerGly430AsnAsnSerLeu445TyrLeuLyslieGin460lieProSerSerGlyGinProTyrLeuCys500ThrAlaProlieGlySerLeuGlySer475LeuSerValGlySer490AsnPheGluLysAsnlieVal515ValAlaValAlaCys505AlaSerlieSerLeuLeu530LysGluLysSerThr545SerArgLeuArgVal520CeuTrpThrLeuLys510ValThrLeu■GinAsn495GinLysLeulieLysGinlieTyr580lieSer565SerAla550Thrlie535LeuMetGluValGly525ArgArgLysSerLys540AspGluSerAsnThrlie595AspTyrGlyLysSerProValLysSerGlyLysAspAsn555SerLeuAlaGinAspAsp570LeuLyslieThrVal585PheGlyThrValGlulie560ValLys575AsnPhelieAsp610AsnGlyPheArgGin625HisHisLysAsnGly600ValLysValLeuAsn590LeuGlyTyrAla615GinAlaGluValTyr605ProSerSerValLeu645liePhe630ThrSerLeulieArgVal640AsnGluGlyThr655AsnLysAlaLeulieTyrGluTyrMetAlaAsnGlyAsnLeuGinGluGly650AlaLys635TyrSer620LeuLeuValCysGlyHisLeuSer675Arg660GlyLysHisSer665SerThrPheLeuArgLeu690AsnGlyCysLysPro705lieLeuLeuAsnlieAlaValAsp695lieLys680AlaAlaLeuGlySerLysAlaGlyAlalie740ProGlyThr755GinLysSerLeuThr770lielieThrAsnGin785lieSerGluArglieValAspSer820GluArgPro850lieGlulieAlaArg865ValGluAlaValSer885Pro710HisPheGinAlaGlu725ProThrAspGlylieHisArgAsp715LeuLeu700ValSerSer685GluLysAspGlu745ProLys730SerHisValSer670TrpTyrSerPheHisTyrLeuAsp760AspValLeuSerPhe775ValMetAlaArgCysGlyHislie765ValPro790SerSerLeulieGlu780GinGluLysGluAspLeuGinThrAsn720GlyLeu735ThrValVal750SerSerArgI>euLeuGluVal805ArgLeuGluGlyAsn795LysGlyAsplieGlu810TyrAsplieAsnLysAlaLeu835lieMetSerGlyAsp825CysValSerLeuGlyHis■ArgAla815AlaTrplieAlaMetAla840AlalieGluLeuSer830ProAsnGlulie855LysAsn845GluThrLeuAlaHisAla870ValAsnValCysAspAspThr890Lys860AsnProArgAla875GluPheMetProTyrLeu880LeuAla895Arg1權利要求1、一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。2、權利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據權利要求2所述的基因，其特徵在於所述蛋白的編碼基因為如下l)或2)的DNA分子1)其編碼序列是序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與l)或2)限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA分子。4、含有權利要求2或3所述基因的重組表達載體或表達盒。5、根據權利要求4所述的重組表達載體，其特徵在於所述重組表達載體為pBin438-6kSTU;所述pBin438-6k5TA2"是將pBin438的^yrfl1和yf/wl位點間的小片段取代為序列表中序列2自5'末端第卜2694位脫氧核苷酸得到的。6、含有權利要求2或3所述基因的轉基因細胞系或重組菌。7、一種培育耐逆植物的方法，是將權利要求2或3所述基因導入植物細胞中，得到耐逆植物。8、根據權利要求7所述的方法，其特徵在於權利要求2或3所述基因通過權利要求5或6所述的重組表達載體導入植物細胞中。9、根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於所述耐逆植物是耐乾旱和/或耐鹽植物。10、根據權利要求7至9中任一所述的方法，其特徵在於所述植物為百脈根或擬南芥。全文摘要本發明公開了植物耐逆性相關蛋白GmSIK2及其編碼基因與應用，本發明提供的GmSIK2蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中序列1所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。本發明還提供了所述蛋白的編碼基因以及含有該蛋白編碼基因的重組表達載體。將所述蛋白導入植物細胞，可以得到耐逆性增強的轉基因植株。本發明的蛋白及其編碼基因對培育耐逆植物品種，特別是培育耐非生物脅迫如耐乾旱和/或耐鹽植物品種，從而提高農作物產量具有重要意義。文檔編號C07K14/415GK101659699SQ20081011882公開日2010年3月3日申請日期2008年8月25日優先權日2008年8月25日發明者何鍶潔,鵬劉,張萬科,張勁松,陳受宜申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所