一種新的生活汙水高效脫氮菌及其應用的製作方法
2023-05-19 16:02:27 2
本發明屬於生物環保技術領域，具體涉及一種新的生活汙水高效脫氮菌及其應用。
背景技術：
中國目前有行政村60多萬個，村莊人口有7.6億，其中96％村莊缺乏汙水處理系統。農村汙水基數大，但受農村經濟發展水平和生產、生活方式等發展水平影響，不同地區農村的汙水排放特徵差別很大。目前城鎮汙水處理廠採用的技術和運行模式不適合用於農村分散型汙水的處理。隨著國家對農村開發力度加大，諸如農家樂、村辦企業和養殖企業等不斷增多，農村汙水類型不斷增加，汙水中含鹽量、氮磷等含量不斷升高，加之化肥和農藥的使用，這增加了汙水治理難度。汙水無序排放造成地表水、地下水的汙染，水庫、池塘和河道等水體變黑，富營養化嚴重，惡臭汙染大氣，嚴重影響居住環境和身心健康。加之，農村地區經濟較為落後，高耗能、較高費用的技術很難推廣應用。當前，必需尋找一種成本較低、無二次汙染、應用範圍廣和適應性強的技術，且適合在中國農村地區推廣應用。微生物脫氮法與物理、化學法相比較,以它高效率、低成本、無二次汙染等不可比擬的優點已被人們所認可。本發明新型高效脫氮菌可直接應用於農村生活汙水治理中，具有較好的脫氮效果。通過投加該菌，可有效提高對農村生活汙水中氮的去除效率。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種新的生活汙水高效脫氮菌及其應用。所述生活汙水高效脫氮菌是從天津生活汙水中分離篩選得到的，該菌可以應用在汙水處理中，特別是農村生活汙水處理中。
本發明提供的生活汙水高效脫氮菌，該菌分類命名為：假單胞菌pseudomonassp.，為新種，於2016年12月15日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc；地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為：cgmccno.13454。
優選地，所述生活汙水高效脫氮菌菌株的16srdna序列如seqidno:1所示，其長度為1498bp。
優選地，所述生活汙水高效脫氮菌菌株具有以下表型特徵：在30～37℃下，瓊脂培養基上培養24～72h後，菌落白色，半透明，圓形，表現光滑，邊緣整齊；菌體短杆狀，0.4×0.8μm～2.0μm，單個或成對排列，革蘭氏陰性；其生長的溫度為15～42℃，nacl濃度為0％～4％，ph為6～11。
優選地，所述生活汙水高效脫氮菌菌株與序列相似的模式菌株進行dan-dna雜交，同源性低於40％。
具體地，所述序列相似的模式菌株為：pseudomonasalcaliphilaal15-21t、pseudomonastoyotomiensisht-3t和pseudomonaschengduensismbrt。
優選地，所述生活汙水高效脫氮菌具有硝化反硝化功能。
所述生活汙水高效脫氮菌菌株經鑑定為假單胞菌屬新種，故分類命名為：假單胞菌pseudomonassp.。
優選地，所述生活汙水高效脫氮菌去除氨氮效果為起始氨氮濃度小於500mg/l。
更優選地，所述生活汙水高效脫氮菌去除氨氮效果為起始氨氮濃度小於100mg/l。此時，脫氮率可達到95％以上。
本發明提供上述脫氮菌在生活汙水淨化中的應用。
特別地，所述汙水為農村生活汙水。
本發明的生活汙水高效脫氮菌為篩選自農村生活汙水中的土著微生物，將其用於含鹽量高的農村生活汙水中，其經濟效益可觀，將會大大節約汙水處理成本，也不需要考慮菌種的安全性，適合在我國聚集地較為分散的農村地區使用。本發明生活汙水高效脫氮菌具有良好的脫氮效果，通過投加該菌，可有效提高土著微生物對農村生活汙水中氮的去除效率。本發明新型高效脫氮菌可直接應用於農村生活汙水治理中，具有較好的脫氮效果。通過投加該菌，可有效提高對農村生活汙水中氮的去除效率。
保藏說明
菌種名稱：生活汙水高效脫氮菌
分類命名：假單胞菌pseudomonassp.
菌株編號：68
保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
保藏機構簡稱：cgmcc
地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號
保藏日期：2016年12月15日
保藏中心登記入冊編號：cgmccno.13454
附圖說明
圖1為本發明生活汙水高效脫氮菌菌株菌體形態電鏡照片。
圖2為本發明生活汙水高效脫氮菌菌株菌落形態照片。
圖3為本發明生活汙水高效脫氮菌菌株與相關種的16srdna序列發育樹。
圖4為本發明生活汙水高效脫氮菌菌株脫氮效果。
具體實施方式
實施例1本發明生活汙水高效脫氮菌菌株的分離鑑定：
(1)培養基：
①硝化脫氮培養基：硫酸銨0.48g，琥珀酸4.71g，微量元素溶液50ml，溶解後用蒸餾水定容至1l，ph控制在7.0～7.2。(固體培養基，加入2％瓊脂)
所述微量元素溶液：k2hpo4·3h2o6.5g，mgso4·7h2o2.5g，nacl2.5g，feso4·7h2o0.05g，mnso4·h2o0.04g，溶解後用蒸餾水定容至1l；
②反硝化脫氮培養基：好氧反硝化培養基：kno30.36g，na2hpo4·7h2o7.9g，kh2po41.5g，mgso4·7h2o0.1g，琥珀酸鈉2.81g，微量元素溶液2ml，溶解後用蒸餾水定容至1l，ph7.0～7.5。微量元素溶液：edta50.0g，znso42.2g，cacl25.5g，mncl2·4h2o5.06g，feso4·7h2o5.0g，cuso4·5h2o1.57g，cocl2·6h2o1.61g，溶解後用蒸餾水定容至1l，ph7.0。
(2)硝化菌株的分離篩選
用無菌移液管取10ml天津生活汙水，置於容量為250ml的三角瓶(其中含有100ml無菌脫氮培養基)中，搖床富集培養，培養條件為30℃，轉速160rpm，每一代培養三天。採用二苯胺試劑檢測氨氧化菌的存在。
採用極限稀釋的方法將含有硝酸菌的培養液進行平板塗布，37℃恆溫培養箱中培養48h後，選取單一菌落進行多次平板分區劃線。在顯微鏡下觀察無雜菌時，菌株純化結束。
將純化好的10％的菌株接種於100ml新鮮液體硝化培養基中，30℃、120rpm搖床培養48h後，測定氨氮去除率，選取氨氮去除率高於85％的菌株作為選到的硝化脫氮菌。
(3)反硝化菌株的篩選
將10％的接種量接種於100ml新鮮液體反硝化培養基中，30℃、120rpm搖床培養48h後，測定硝酸鹽氮去除率，選取去除率高於90％的菌株作為選到的反硝化脫氮菌。
圖1為本發明生活汙水高效脫氮菌菌株菌體形態電鏡照片。圖2為本發明生活汙水高效脫氮菌菌株菌落形態照片。由圖1和圖2可見，所述菌株具有以下表型特徵：在30～37℃下，瓊脂培養基上培養24～72h後，菌落白色，半透明，圓形，表現光滑，邊緣整齊；菌體短杆狀，0.4×0.8μm～2.0μm，單個或成對排列，革蘭氏陰性；其生長的溫度為15～42℃，nacl濃度為0％～4％，ph為6～11。
(4)16srdna序列分析與系統發育分析
通過16srdna的pcr擴增與測序，得到16srdna基因序列長度為1498bp(參見seqidno:1)。提交genbank進行比對，發現本發明生活汙水高效脫氮菌屬於假單胞菌(pseudomonassp.)。採用mega5.0軟體，鄰位連接法顯示該菌株與相關種的16srdna序列發育樹，進行1000次的相似度重複計算，圖3中發育樹節點只顯示bootstrap值大於50％數值(參見圖3。圖3為本發明菌株與相關種的16srdna序列發育樹)。
(5)微生物菌種dan-dna雜交
本發明生活汙水高效脫氮菌與序列相似的模式菌株進行dan-dna雜交，同源性低於40％。具體地，本發明生活汙水高效脫氮菌與pseudomonasalcaliphilaal15-21t的雜交同源性為35.4％，本發明生活汙水高效脫氮菌與pseudomonastoyotomiensisht-3t的雜交同源性為33.3％，本發明生活汙水高效脫氮菌與pseudomonaschengduensismbrt的雜交同源性35.4％。
實施例2脫氮效果實驗
將本發明生活汙水高效脫氮菌菌株接種於100ml不同氮含量的脫氮培養基中，起始氨氮濃度分別為50mg/l，未接菌種的培養基為空白對照，37℃，轉速為160rpm，搖床培養箱培養30h。取培養液分別在10000rpm下離心6分鐘，經過0.45μm的濾膜過濾，測定培養液中的氨氮(ammonianitrogen)、硝氮(nitratenitrogen)、亞硝酸鹽氮(nitritenitrogen)、以及總氮(totalnitrogen)的含量。具體測定結果見圖4。圖4為本發明生活汙水高效脫氮菌菌株脫氮效果。
由圖4可以看出，起始氨氮濃度為50mg/l,去除率可以達到100％。且亞硝酸氮累計均較少，說明本發明菌株具有較好的硝化反硝化功能。起始氨氮濃度小於500mg/l的範圍均可發揮脫氮功能，且起始氨氮濃度小於100mg/l時，效果最佳。
實施例3農村生活汙水降解實驗
將本發明生活汙水高效脫氮菌菌液直接投加到格柵過濾後的的實際農村生活汙水中，接種量為10％體積。培養溫度為30℃，攪拌速度為180rpm。結果：處理3天後，水體中總氮的去除率可達到80％。
sequencelisting
農業部環境保護科研監測所
一種新的生活汙水高效脫氮菌及其應用
y161366-oi
1
patentinversion3.5
1
1498
dna
假單胞菌（pseudomonassp.）
1
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