一種人牙髓幹細胞培養基及人牙髓幹細胞的製備方法與流程
2023-05-19 16:16:21 2
本發明涉及幹細胞製備技術領域，具體涉及一種人牙髓幹細胞培養基及人牙髓幹細胞的製備方法。
背景技術：
幹細胞是具有自我複製和多向分化能力的細胞，可以不斷地自我更新，並在特定條件下分化成為一種或多種構成人體組織或器官的細胞，可使組織恢復再生能力，修復其功能。研究者在脫落乳牙的牙髓組織中發現一種新的成體幹細胞，將其命名為乳牙牙髓幹細胞，至今已有較多實驗證明乳牙牙髓幹細胞具有高度自我更新、克隆形成以及成骨分化的能力。
乳牙牙髓幹細胞具有以下優勢：1)取材方便，多取自自然脫落和拔除的滯留牙，對供者正常牙傷害較少；2)不受倫理限制，可進行自體移植治療，最大限度降低免疫排斥和交叉感染的風險；3)具有較強的增殖能力和多向分化潛能。但牙髓中幹細胞含量較低，必須在體外進行擴增，以獲得足夠的細胞數量來滿足應用需求。目前牙髓幹細胞培養體系主要採用含動物源胎牛血清的培養基，動物源胎牛血清在一定程度上有可能引起人體免疫排斥反應，增加了牙髓幹細胞臨床應用的風險。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種人牙髓幹細胞培養基及人牙髓幹細胞的製備方法。本發明提供的培養基製備得到的牙髓幹細胞產量高、無人體免疫排斥反應，為臨床牙的修復與再生提供可靠的種子細胞。
本發明提供了一種人牙髓幹細胞培養基，所述人牙髓幹細胞培養基以α-mem培養基為基礎，包含體積百分含量為5％～10％的人ab血清、100μm抗壞血酸、2mml-穀氨醯胺、100u/ml青黴素鈉和100mg/ml鏈黴素。
本發明還提供了基於上述技術方案所述培養基的人牙髓幹細胞的製備方法，包括以下步驟：
1)將牙齒原料置於含有青黴素鈉和硫酸鏈黴素的0.9％氯化鈉溶液中進行清洗和消毒，得到消毒後的牙齒，所述牙齒原料為脫落的乳牙或智齒；
2)從步驟1)所述消毒後的牙齒中取出牙髓組織，置於無血清培養基中，將牙髓組織剪成組織塊；
3)取步驟2)得到的組織塊置於人牙髓幹細胞培養基中進行培養，覆蓋蓋玻片；
4)在培養第4～6d時，更換培養基；在培養第10～12d時，半量換培養基；培養第15～18d時，細胞匯合率達到70～80％，進行傳代培養，得到牙髓幹細胞。
優選的是，所述牙齒原料為5～12歲兒童脫落的乳牙或18～29歲成人脫落的智齒。
優選的是，所述步驟1)的牙齒原料在清洗和消毒前將牙齒置於牙齒保存液中保存，保存的溫度為2～8℃。
優選的是，所述牙齒保存液以dmem培養基為基礎，包括100u/ml青黴素鈉和100mg/ml硫酸鏈黴素。
優選的是，所述步驟1)中青黴素鈉在0.9％氯化鈉溶液中的濃度為100u/ml，硫酸鏈黴素的在0.9％氯化鈉溶液中的濃度為100mg/ml。
優選的是，所述步驟2)牙髓組織剪成1mm3的組織塊；每8～10塊組織塊置於3～5ml人牙髓幹細胞培養基中。
優選的是，所述步驟3)的培養在37℃、5％co2，飽和溼度條件下進行。
優選的是，培養液完全充盈於蓋玻片與組織塊之間。
優選的是，所述步驟4)培養第4～6d時有細胞長出時，去掉蓋玻片。
本發明提供了一種人牙髓幹細胞培養基。本發明培養基中含有100u/ml的青黴素和100mg/ml的硫酸鏈黴素，對牙髓組織和細胞的損傷小，組織成活率高；本發明的人牙髓幹細胞培養基中採用的人ab血清能夠避免動物源血清等異源性汙染，解決免疫排斥反應；100μm抗壞血酸，能促進牙髓幹細胞外基質的形成，有利於牙髓幹細胞的生長，培養的牙髓幹細胞數量更多，活性更高，培養第10天細胞數量可達3.9×105，而常規培養體系培養的牙髓幹細胞數量僅為2.2×105。實驗結果表明，通過流式細胞術檢測，本發明培養基培養的牙髓幹細胞純度高，牙髓幹細胞表面標誌cd73、cd90、cd105陽性表達率98％以上，陰性指標表達率低於2％。
附圖說明
圖1為本發明實施例3提供的流式細胞術檢測牙髓幹細胞表型結果圖。
具體實施方式
本發明提供了一種人牙髓幹細胞培養基，所述人牙髓幹細胞培養基以α-mem培養基為基礎，包含體積百分含量為5％～10％的人ab血清、100μm抗壞血酸、2mml-穀氨醯胺、100u/ml青黴素鈉和100mg/ml鏈黴素。
在本發明中，所述人牙髓幹細胞培養基優選包括10％的人ab血清。本發明的人牙髓幹細胞培養基相比常規培養體系(含10％胎牛血清的α-mem培養基)，採用人ab血清，能夠避免動物源血清等異源性汙染；本發明的人牙髓幹細胞培養基含有100μm的抗壞血酸，能促進牙髓幹細胞外基質的形成，有利於牙髓幹細胞的生長，培養的牙髓幹細胞數量更多，活性更高，培養第10天細胞數量可達3.9×105，而常規培養體系培養的牙髓幹細胞數量僅為2.2×105。本發明所述人牙髓幹細胞培養基只添加100u/ml青黴素和100mg/ml鏈黴素兩種抗生素，整個過程不採用75％酒精、甲硝唑、兩性黴素等消毒試劑，本發明這兩種抗生素的使用能夠減少上述試劑對牙髓組織和細胞的損傷，提高組織成活率。
本發明還提供了基於上述技術方案所述培養基的人牙髓幹細胞的製備方法，包括以下步驟：
1)將牙齒原料置於含有青黴素鈉和硫酸鏈黴素的0.9％氯化鈉溶液中進行清洗和消毒，得到消毒後的牙齒，所述牙齒原料為脫落的乳牙或智齒；
2)從步驟1)所述消毒後的牙齒中取出牙髓組織，置於無血清培養基中，將牙髓組織剪成組織塊；
3)取步驟2)得到的組織塊置於人牙髓幹細胞培養基中進行培養，覆蓋蓋玻片；
4)在培養第4～6d時，更換培養基；在培養第10～12d時，半量換培養基；培養第15～18d時，細胞匯合率達到70～80％，進行傳代培養，得到牙髓幹細胞。
本發明將牙齒原料置於含有青黴素鈉和硫酸鏈黴素的0.9％氯化鈉溶液中進行清洗和消毒，得到消毒後的牙齒，所述牙齒原料為脫落的乳牙或智齒。在本發明中，所述牙齒原料優選為5～12歲兒童脫落的乳牙或18～29歲成人脫落的智齒。在本發明中，所述牙齒原料優選組織完整，無齲、無牙髓病和牙周病等。本發明在獲得牙齒後，優選用生理鹽水對牙齒表面進行處理。對牙齒表面進行處理後，本發明優選將牙齒原料置於牙齒保存液中進行保存，所述保存的溫度為2～8℃，更優選為4℃。本發明對所述保存的裝置沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的恆溫保存裝置即可，如恆溫冰箱或恆溫保存箱。在本發明中，所述牙齒保存液以dmem培養基為基礎，包括100u/ml青黴素鈉和100mg/ml硫酸鏈黴素。在本發明中，所述青黴素鈉在0.9％氯化鈉溶液中的濃度優選為100u/ml，硫酸鏈黴素的在0.9％氯化鈉溶液中的濃度優選為100mg/ml。在本發明中，所述清洗和消毒的時間優選為2～3min，所述清洗和消毒的作用為去除牙周軟組織和血汙。在本發明中，所述消毒的次數優選為1～3次，更優選為2次。
得到消毒後的牙齒後，從所述消毒後的牙齒中取出牙髓組織，置於無血清培養基中，將牙髓組織剪成組織塊。在本發明中，所述步驟3)取出牙髓組織的方法包括以下步驟：將牙齒固定，去除牙釉質和牙本質，從牙髓腔中取出牙髓組織。在本發明，所述消毒後的牙齒優選採用無菌紗布進行包裹固定。本發明對去除牙釉質和牙本質的具體方法沒有特殊的限定，具體的，本發明優選採取臺虎鉗將牙齒的牙釉質和牙本質鉗開，鉗開後，打開無菌紗布，優選採用滅菌的鑷子從牙髓腔中取出牙髓組織。本發明的牙髓組織提取方法能夠將牙齒內部結構全部展開，將牙齒內部的牙齦組織全部取出，相比於常規牙髓針提取法，獲得的牙髓組織更多更完整，能夠提高後期細胞培養的成功率。
本發明優選將取出後的牙髓組織裝入無血清培養基中進行保存。本發明對所述無血清培養基沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的無血清培養基的常規市售產品即可。如：α-mem培養基。發明將牙髓組織剪成1.0mm3的組織塊，取剪碎後的組織塊直接進行培養，與傳統的酶消化法相比，操作簡單，成本低廉，汙染小，無雜質引入，能夠更好地保持細胞活力。而常規酶消化法技術繁瑣、成本昂貴，同時還存在對細胞的機械損傷和化學損傷，造成細胞培養周期很長，或者細胞培養失敗。
得到組織塊後，取步驟2)得到的組織塊置於人牙髓幹細胞培養基中進行培養，覆蓋蓋玻片。在本發明中，所述人牙髓幹細胞培養基的體積為3～5ml。每3～5ml的人牙髓幹細胞培養基中，優選放置8～10塊組織塊進行培養，在本發明中，所述組織塊的大小為1mm3，本發明優選採用無菌眼科剪對其進行剪塊。本發明在牙髓組織剪塊後採用蓋玻片對組織塊進行壓貼，由於牙髓組織塊比較小，本發明方法能夠更好地保證牙髓組織塊貼壁，相比於傳統的組織貼壁法，本發明的方法能夠進一步保證組織更好貼壁，避免組織塊漂浮，培養失敗，本發明的方法能夠完全保證組織塊貼附，加速牙髓幹細胞的萌出和生長，牙髓幹細胞在培養第4～6天就有大量萌出，比常規的組織塊培養法提前2～3天。
具體的，本發明在牙髓幹細胞的培養過程中，優選選取培養皿進行培養，在培養皿中，滴加1滴培養基後，將牙科探針取組織塊移入培養液滴中，每滴培養液加入8～10塊組織塊。本發明在培養液中加入組織塊後，優選在培養液上覆蓋蓋玻片，輕輕加壓，固定組織塊。在本發明中，培養液完全充盈於蓋玻片與組織塊之間，避免氣泡產生。在本發明中，所述牙髓幹細胞的培養優選在37℃、5％co2，飽和溼度條件下進行。
在本發明中，牙齒保存液、牙齒清洗和消毒液中只添加100u/ml青黴素和100mg/ml鏈黴素兩種抗生素，整個過程不採用75％酒精、甲硝唑、兩性黴素等消毒試劑，本發明這兩種抗生素的使用能夠減少上述試劑對牙髓組織和細胞的損傷，提高組織成活率。
本發明在在培養第4～6d時，更換培養基；在培養第10～12d時，半量換培養基；培養第15～18d時，細胞匯合率達到70～80％，進行傳代培養，得到牙髓幹細胞。在本發明中，所述培養第4～6d時有細胞長出時，去掉蓋玻片。本發明所述傳代培養的條件沒有特殊的限定，採用本領域技術人員熟知的牙髓細胞常規傳代培養方法即可。
本發明還提供了上述技術方案所述製備方法得到的牙髓幹細胞在牙齒的修復和再生中的應用。
下面結合具體實施例對本發明所述的一種人牙髓幹細胞培養基及人牙髓幹細胞的製備方法做進一步詳細的介紹，本發明的技術方案包括但不限於以下實施例。
實施例1
在生物安全櫃中放置2個10cm無菌培養皿，加入40ml含雙抗(青黴素鈉(100u/ml)，硫酸鏈黴素(100mg/ml))的0.9％氯化鈉注射液。用無菌鑷子取出採集瓶中的牙齒，放入到裝有雙抗和0.9％氯化鈉注射液的培養皿中清洗和消毒2min，充分去除牙周軟組織和血液，將消毒後的牙齒放入第二個培養皿中再消毒一次。
將清洗後的牙齒放在無菌紗布上，然後用紗布包裹牙齒，用臺虎鉗將牙齒的牙釉質和牙本質鉗開，將無菌紗布打開，用鑷子從牙髓腔內找出牙髓組織，將其裝入含無血清培養基的ep管中。
在無血清培養基充分浸潤條件下，用無菌眼科剪將牙髓組織剪成約1.0mm3大小的組織塊。在直徑6cm的培養皿的底壁滴加1滴培養基，培養體系為含5％人ab血清，100μm抗壞血酸，2mml-穀氨醯胺，100u/ml青黴素，100mg/ml鏈黴素的α-mem培養基。用牙科探針將組織碎塊移入培養皿中的培養液滴中，使每滴培養液內含8小塊組織。加入培養液放入培養箱中，於37℃、5％co2飽和溼度條件下培養。
在培養的第5天，更換培養基，當有細胞長出時，去掉蓋玻片，在培養10天時培養基進行半量換液，培養至16天時，細胞匯合率達到72％時，進行傳代培養。
結果：培養第10天可獲得牙髓幹細胞數量為2.6×105。流式細胞術檢測結果顯示牙髓幹細胞表面標誌cd73、cd90、cd105陽性表達率95％以上，陰性指標表達率低於5％。
實施例2
在生物安全櫃中放置2個10cm無菌培養皿，加入40ml含雙抗(青黴素鈉(100u/ml)，硫酸鏈黴素(100mg/ml))的0.9％氯化鈉注射液。用無菌鑷子取出採集瓶中的牙齒，放入到裝有雙抗和0.9％氯化鈉注射液的培養皿中清洗和消毒3min，充分去除牙周軟組織和血液，將消毒後的牙齒放入第二個培養皿中再消毒一次。
將清洗後的牙齒放在無菌紗布上，然後用紗布包裹牙齒，用臺虎鉗將牙齒的牙釉質和牙本質鉗開，將無菌紗布打開，用鑷子從牙髓腔內找出牙髓組織，將其裝入含無血清培養基的ep管中。
在無血清培養基充分浸潤條件下，用無菌眼科剪將牙髓組織剪成約1.0mm3大小的組織塊。在直徑6cm的培養皿的底壁滴加1滴培養基，培養體系為含8％人ab血清，100μm抗壞血酸，2mml-穀氨醯胺，100u/ml青黴素，100mg/ml鏈黴素的α-mem培養基。用牙科探針將組織碎塊移入培養皿中的培養液滴中，使每滴培養液內約含10小塊組織。加入培養液放入培養箱中，於37℃、5％co2飽和溼度條件下培養。
在培養的第6天，更換培養基，當有細胞長出時，去掉蓋玻片，在培養11天時培養基進行半量換液，培養至16天時，細胞匯合率達到80％時，進行傳代培養。
結果：培養第10天可獲得牙髓幹細胞數量為3.1×105。流式細胞術檢測結果顯示牙髓幹細胞表面標誌cd73、cd90、cd105陽性表達率97％以上，陰性指標表達率低於3％。
實施例3
在生物安全櫃中放置2個10cm無菌培養皿，加入40ml含雙抗(青黴素鈉(100u/ml)，硫酸鏈黴素(100mg/ml))的0.9％氯化鈉注射液。用無菌鑷子取出採集瓶中的牙齒，放入到裝有雙抗和0.9％氯化鈉注射液的培養皿中清洗和消毒2min，充分去除牙周軟組織和血液，將消毒後的牙齒放入第二個培養皿中再消毒一次。
將清洗後的牙齒放在無菌紗布上，然後用紗布包裹牙齒，用臺虎鉗將牙齒的牙釉質和牙本質鉗開，將無菌紗布打開，用鑷子從牙髓腔內找出牙髓組織，將其裝入含無血清培養基的ep管中。
在無血清培養基充分浸潤條件下，用無菌眼科剪將牙髓組織剪成約1.0mm3大小的組織塊。在直徑6cm的培養皿的底壁滴加1滴培養基，培養體系為含10％人ab血清，100μm抗壞血酸，2mml-穀氨醯胺，100u/ml青黴素，100mg/ml鏈黴素的α-mem培養基。用牙科探針將組織碎塊移入培養皿中的培養液滴中，使每滴培養液內約含9小塊組織。將消毒後的蓋玻片緩慢覆蓋於組織塊上，輕輕加壓，以固定組織塊，依次將剩餘組織塊進行同樣操作。加入培養液放入培養箱中，於37℃、5％co2飽和溼度條件下培養。覆蓋時應注意使培養液完全充盈於蓋玻片與組織塊之間，切勿產生氣泡。
在培養的第5天，更換培養基，當有細胞長出時，去掉蓋玻片，在培養10天時培養基進行半量換液，培養至15天時，細胞匯合率達到70％時，進行傳代培養。
結果：培養第10天可獲得牙髓幹細胞數量為3.9×105。流式細胞術檢測牙髓幹細胞表型結果如圖1所示。流式細胞術檢測結果顯示牙髓幹細胞表面標誌cd73、cd90、cd105陽性表達率98％以上，陰性指標表達率低於2％。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。