一種體外血型血清學實驗檢定方法
2023-05-19 16:24:41 3
專利名稱：一種體外血型血清學實驗檢定方法
技術領域：
本發明涉及體外血型血清學檢定方法，特別是提供一種以木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液、酶抑制劑-64試劑溶液為介質的體外血型血清學實驗檢定方法。
背景技術：
在常規體外血型血清學—蛋白酶實驗檢定方法中，由於使用的巰基蛋白酶試劑缺乏完整的質量檢定標準，以及傳統的木瓜酶、菠蘿酶一步法、二步法實驗技術，存在對紅細胞的過度水解、對血型抗體的水解—降解作用，是造成蛋白酶檢定實驗出現「假陽性」、「假陰性」實驗檢定結果的本質性原因。
發明內容
本發明的目的是提供一種準確的體外血型血清學檢定方法。
本發明所提供的檢測體外血型血清學的方法，包括如下步驟1)將木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液與紅細胞懸液混合均勻，在水浴場、微波場、或自動溫控振蕩儀中孵育；所述木瓜凝乳蛋白酶製劑含有木瓜凝乳蛋白酶，L-半胱氨酸和普魯蘭；2)加入酶抑制劑-64試劑溶液，分別加入受檢物，陽性對照物和陰性對照物，混合均勻，在水浴箱、微波場或自動溫控振蕩儀中孵育；所述酶抑制劑-64含有反式-環氧琥珀醯-L-亮氨醯氨基(4-胍基)丁烷、甘露醇、海藻糖和普魯蘭；3)120×g離心1分鐘，記錄檢測結果。
為了使檢測的效果更好，所述木瓜凝乳蛋白酶製劑中還含有甘露醇、海藻糖和維生素C鹽；所述木瓜凝乳蛋白酶製劑中每200000PU單位的木瓜凝乳蛋白酶中甘露醇、海藻糖和維生素C鹽的含量分別為0.2-0.3mol、0.01-0.02mol和0.01-0.02mol；所述酶抑制劑-64中每40000TU單位的反式-環氧琥珀醯-L-亮氨醯氨基(4-胍基)丁烷中甘露醇、海藻糖和普魯蘭的含量分別為0.2-0.3mol、0.01-0.02mol和0.05-0.1mol。木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液具有的活力效價為1/10分鐘10-16PU/50μl、或者是10分鐘100-160PU/50μl；酶抑制劑-64試劑溶液具有的活性效價為1/10分鐘20-32TU/50μl、或者是10分鐘200-320TU/50μ1。
所述的水浴孵育為在37-39℃水浴孵育5-10分鐘；所述的微波孵育為在設定功率300-360W、輸出功率30％的微波場中孵育200-300秒鐘；所述的自動溫控振蕩儀孵育為在37-39℃、300-500r/min、1-3Level自動溫控振蕩儀孵育5-10分種。通過熱效應，完成木瓜凝乳蛋白酶對紅細胞膜的水解修飾作用，形成血型抗原對血型抗體的吸附—凝集條件。
檢定實驗使用的紅細胞試劑是ABO以外血型抗體篩檢紅細胞懸液，紅細胞ABO以外血型譜細胞懸液，A型紅細胞懸液，B型紅細胞懸液，受血者紅細胞懸液，供血者紅細胞懸液，患者紅細胞懸液。上述紅細胞試劑的紅細胞濃度為2-4％。
檢定實驗使用的標本物是患者(或受血者)血清樣本，供血者血清樣本，患者、供血者IgG抗-A、抗-B實驗檢定用血清樣本溶液，紅細胞放散液；以及人源型ABO-IgG-抗-A、抗-B，Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、Kell-抗-K、抗-k、kiad-抗-JKa、抗-JKb、Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b、P-抗-P1抗體血清。
在檢定實驗中，如採用U型多孔板為實驗容器，可以採用掃描酶標儀—血型判讀系統自動讀取、記錄實驗結果；用試管為實驗容器，採用人工讀取、記錄實驗結果。
本發明所提供的實驗檢定方法，用於人類血樣本的ABO-IgG-抗-A、抗-B，Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、Kell-抗-K、抗-k、kiad-抗-JKa、抗-JKb、Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b、P-抗-P1等血型抗體與相應紅細胞血型抗原的檢定，如臨床血樣本的抗體篩檢，抗體特異性鑑定，抗體效價滴定，IgG抗A、抗-B檢定，輸血相容性試驗等。
本發明克服了傳統的蛋白酶實驗檢定的技術缺限，提高了實驗檢定的安全性與靈敏度，具體表現在1、使用專用型活力效價為10-16PU/50μl或100-160PU/50μl的木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液，在規定的實驗溫度-時間條件下，對紅細胞膜進行有效的水解修飾，裸露血型抗原受體，使之具備與相應的血型抗體直接形成可視性免疫凝集的能力。
2、在木瓜凝乳蛋白酶完成對紅細胞膜的水解修飾作用後，使用專用型活性效價為20-32TU/50μl或200-320TU/50μl的酶抑制劑-64試劑溶液，快速抑制木瓜凝乳蛋白酶活力。防止活性酶對紅細胞的過度性水解效應—產生「假陽性」實驗結果，以及活性酶對血型抗體的水解效應—產生「假陰性」實驗結果。顯著提高檢定實驗的安全性與靈敏度，從根本上消除蛋白酶試劑在體外血型血清學中「試劑型」實驗檢定事故的發生。
3、所使用的木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液、酶抑制劑-64試劑溶液，不含有蛋白質沉澱劑，紅細胞凝集素。杜絕「試劑性——假陽性」檢定實驗結果的產生。
4、微波是一種超短波，在微波的熱效應、化學效應、生物學效應的作用下，木瓜凝乳蛋白酶對紅細胞水解修飾速率加快，酶抑制劑-64與生物巰基形成複合物的速率加快，是顯著降低實驗耗時，保持實驗檢定安全性與靈敏度的重要實驗方法。
5、本發明的核心技術是利用木瓜凝乳蛋白酶對紅細胞進行有效地水解修飾，酶抑制劑-64使完成對紅細胞水解修飾作用後的木瓜凝乳蛋白酶快速失去活力效價，可近一步拓展為對紅細胞試劑的酶化預處理，製備3％酶化A型、B型紅細胞試劑，3％酶化ABO以外血型抗體篩檢紅細胞懸液，以適應血液中心批量化開展非鹽水介質血型抗體的篩檢、鑑定實驗。
具體實施例方式
實驗材料1、細胞材料3％受檢紅細胞懸液，3％受血者紅細胞懸液，3％供血者紅細胞懸液，3％Rho(D)陽性紅細胞懸液，3％Rho(D)陰性紅細胞懸液，3％A型紅細胞懸液，3％B型紅細胞懸液，3％篩檢紅細胞懸液，3％血型譜細胞懸液。
上述細胞材料中3％受檢紅細胞懸液，3％受血者紅細胞懸液，3％供血者紅細胞懸液取自醫院血庫血樣本。其它細胞試劑產自Immucor。
2、血清材料患者、供血者血清標本，紅細胞放散液，患者、供血者IgG抗-A、抗-B實驗檢定用血清樣本溶液；人源型ABO-IgG-抗-A、抗-B，Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、Kell-抗-K、抗-k、kiad-抗-JKa、抗-JKb、Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b、P-抗-P1等抗體血清標本，以及AB血清標本。
上述血清材料中患者血清樣本，供血者血清樣本，患者、受血者IgG抗-A、抗-B實驗檢定用血清樣本溶液，紅細胞放散液等，取自醫院血庫血樣本。其它血清材料產自Immucor。
實施例1、木瓜凝乳蛋白酶的提取與製備取1000g的番木瓜果漿冰凍物，用微波加熱融化，加入1000ml 0.02mol/L磷酸鹽緩衝液(pH5.5)，在勻漿器中勻漿。
加入1％殼聚糖溶液100ml，勻漿攪拌，室溫靜置2小時後過濾，去除沉澱，保留濾液。
向濾液中加入硫酸銨至35％飽和度，室溫靜置60分鐘，在2-8℃、10000×g離心20分鐘，去除沉澱；向離心上清液中加入硫酸銨至50％飽和度，室溫靜置60分鐘，在2-8℃、10000×g離心20分鐘，去除沉澱；在上清液中加入過量酒石酸溶液，調節pH至＜2.5，室溫靜置60分鐘。10000×g離心20分鐘，棄去沉澱物；最後再向上清液中加入硫酸銨至70％飽和度，室溫靜置60分鐘，10000×g離心20分鐘，收集沉澱物。
將沉澱物用200ml純水溶解，然後用截留分子量為1萬的聚碸中空纖維超濾膜超濾，在超濾過程中分次加入2-8℃水，在0.1兆帕的條件下循環超濾1h，得到超濾濃縮液。
向上述溶液中加入100ml 0.2mol/L磷酸鈉緩衝液(pH5.5)，混勻。用該磷酸鉀緩衝液預先平衡纖維素CM-C92色譜柱，然後以5ml/min的速度，將溶液上柱，以0.7mol/L磷酸鈉緩衝液(pH5.5)為洗脫液，收集木瓜凝乳蛋白酶洗脫液，用截留分子量為1萬的聚碸中空纖維超濾膜濃縮洗脫液。
向濃縮液加入普魯蘭0.1mmol、L-半胱氨酸0.025mol，冷凍乾燥得到木瓜凝乳蛋白酶乾燥物20g。
實施例2、木瓜凝乳蛋白酶試劑盒的製備1、木瓜凝乳蛋白酶製劑普魯蘭0.05mmol甘露醇0.3mol海藻糖0.02mol抗壞血酸鈉0.02molL-半胱氨酸0.05mol木瓜凝乳蛋白酶200000PU定量稱取上述溶質，溶解於純水中，稀釋至1000ml定容，用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，然後按每瓶2000PU規格分裝至潔淨西林瓶。用冷凍乾燥機迅速降溫至-40℃，維持4小時；然後啟動乾燥程序，以每小時升溫5℃速率減壓乾燥，將被凍結產品升溫33℃維持3小時，停止減壓，對成品進行密封包裝，得到成品木瓜凝乳蛋白酶製劑。
2、木瓜凝乳蛋白酶溶劑磷酸二氫鉀 0.064mol磷酸氫二鈉 0.003mol用純水溶解上述溶質，調解pH至5.5，稀釋至1000ml定容，用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，然後按每瓶10ml規格分裝至至聚乙烯瓶內，密封。
使用前用木瓜凝乳蛋白酶溶劑溶解木瓜凝乳蛋白酶製劑，形成木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液，用2％偶蛋化白蛋白—磷酸鹽溶液檢測木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液的活力效價。
依照體外血型血清學實驗檢定靈敏度的評價標準，每50μl的木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液應具有的活力效價按照下述的標識方法I為10-16PU；按照下述的標識方法II為100-160PU。
活力效價標識方法IPU＝每50μl試劑溶液1/10分鐘所具有的活力效價。
活力效價標識方法IIPU＝每50μl試劑溶液10分鐘所具有的活力效價。
3、酶抑制劑-64製劑反式-環氧琥珀醯-L-亮氨醯氨基(4-胍基)丁烷 400000TU普魯蘭0.05mmol甘露醇 0.3mol海藻糖 0.02mol定量稱取上述溶質，溶解於純水中，稀釋至1000ml定容，用0.2μm微孔濾膜過濾除菌。然後按每瓶4000TU規格分裝至潔淨西林瓶。用冷凍乾燥機迅速降溫至-40℃，維持4小時；然後啟動乾燥乾燥程序，以每小時升溫5℃速率減壓乾燥，將被凍結產品升溫33℃維持3小時，停止減壓，對成品進行密封包裝，得到酶抑制劑-64製劑。
4、酶抑制劑-64溶劑磷酸二氫鉀0.027mol磷酸氫二鈉0.040mol用純水溶解上述溶質，調解pH至7.0，稀釋至1000ml定容，用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，然後按每瓶10ml規格分裝至聚乙烯瓶內，密封。
使用前用酶抑制劑-64溶劑溶解酶抑制劑-64製劑，形成酶抑制劑-64試劑溶液。
用2％偶蛋化白蛋白—磷酸鹽溶液、30PU/150μl/min或300PU/150μl活力效價的木瓜凝乳蛋白酶試劑，檢測酶抑制劑-64試劑溶液活性效價。
依照體外血型血清學實驗檢定安全性的評價標準，每50μl的酶抑制劑-64試劑溶液應具有的活性效價按照標識方法I為20-32TU；按照標識方法II為200-320TU。
活性效價標識方法ITU＝每50μl試劑溶液1/10分鐘所具有的活性效價。
活性效價標識方法IITU＝每50μl試劑溶液10分鐘所具有的活性效價。
實施例3製備酶化試劑紅細胞1)將3％紅細胞懸液、木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液置水浴預熱至37±0.5℃。
2)將等體積的3％試劑紅細胞懸液，木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液，混合均勻，形成實驗體系，移入37±0.5℃水浴孵育5分鐘。
3)向實驗體系加入0.5體積的酶抑制劑-64試劑溶液，混合均勻，室溫放置3分鐘。
4)將實驗系統移入離心機，120×g離心1分鐘；1000×g離心30秒鐘，用生理鹽水洗滌、製備壓積紅細胞。
5)取壓積紅細胞，用生理鹽水製備3％紅細胞懸液。
6)上述試劑紅細胞可以是A型、B型、O型紅細胞，篩檢紅細胞，紅細胞血型譜細胞。
用上述方法製備的酶化紅細胞，可常規用於非鹽水介質血型抗體檢定實驗，顯著提高工作效率。
實施例4對被抗體包被的紅細胞的清洗在特殊的病理條件下，患者自身抗體與其紅細胞具有較常的親合力，用常規放散法無法解離被吸附的抗體，從而影響紅細胞血型的鑑定。採用下述方法可以使患者的紅達到理想的清洗效果，順利進行紅細胞血型的鑑定。
1)將被處理的1體積紅細胞用生理鹽水製備3％紅細胞懸液，與1體積的木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液分別預熱至37±0.5℃。
2)將上述紅細胞懸液、木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液混合均勻，移入37±0.5℃水浴孵育5分鐘。
3)加入1體積的酶抑制劑-64試劑溶液，混合均勻，室溫放置3分鐘。
4)將實驗系統移入離心機，120×g離心1分鐘；1000×g離心30秒鐘。用生理鹽水洗滌3次，製備3％紅細胞懸液，進行紅細胞血型鑑定。
用上述方法，與常規放散法為對比實驗，對100例自身免疫性溶血性貧血患者的紅細胞進行清洗試驗。成功率為100％，未出現「假陽性」結果。
實施例5 血型抗體篩檢一、試管—水浴方法1、取5支試管，標記陽性對照、陰性對照、受檢1、受檢2、受檢3。
2、向陽性對照加入3％Rho(D)陽性紅細胞懸液50μl；向陰性對照加入3％Rho(D)陽性紅細胞懸液50μl；向受檢1加入3％I號篩檢紅細胞懸液50μl，向受檢2加入3％II號篩檢紅細胞懸液50μl，向受檢3加入3％III號篩檢紅細胞懸液50μl；向全部試管各加入木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液50μl，混合均勻。
3、將試管移入37±0.5℃水浴孵育5分鐘。向全部試管各加入酶抑制劑-64試劑溶液50μl；向陽性對照管加入IgG抗-D血清50μl；向陰性對照管加入AB血清50μl；向受檢管1-受檢管3各加入血清標本50μl，或紅細胞放散液100μl，混合均勻。
4、將試管移入37±0.5℃水浴場孵育7分鐘。
5、將試管移入離心機，120×g離心1分鐘。
6、輕輕搖動試管，懸浮紅細胞，肉眼觀察實驗檢定結果。
7、陽性對照產生紅細胞凝集，陰性對照不產生紅細胞凝集，實驗結果成立。受檢管出現紅細胞凝集為實驗檢定陽性結果，受檢管未出現紅細胞凝集為實檢定陰性結果。
採用間接抗人球蛋白血型抗體篩檢實驗方法與本發明的實驗方法為平行試驗，在對2000例獻血者的血清樣本中一致篩檢出4例陽性血樣，無「假陰性」、「假陽性」實驗結果。
對4例陽性血樣，採用室溫鹽水、37℃鹽水、間接抗人球蛋白等血型抗體特異性鑑定實驗方法，以及實施例6所述的血型抗體特異性鑑定實驗方法，進行抗體特異性鑑定。鑑定結果一致證實，3例為IgG抗-D、1例為抗-Lea。
二、試管—微波方法1、同水浴方法中的第1步。
2、同水浴方法中的第2步。
3、將試管移入微波場，在功率強度360W，功率輸出率30％的條件下，輻射孵育200秒鐘。
4、同水浴方法中的第4步。
5、將試管移入微波場，在功率強度360W，功率輸出率30％的條件下，輻射孵育300秒鐘。
6、同水浴方法中的第6步。
7、同水浴方法中的第7步。
採用上述的試管—水浴抗體篩檢實驗方法、間接抗人球蛋白血型抗體篩檢實驗方法與本發明的實驗方法為平行試驗，在對2000例獻血者的血清樣本中一致篩檢出出4例陽性血樣，無「假陰性」、「假陽性」實驗結果。
對4例陽性血樣，採用室溫鹽水、37℃鹽水、間接抗人球蛋白等血型抗體特異性鑑定實驗方法，以及實施例6所述的血型抗體特異性鑑定實驗方法，進行抗體特異性鑑定。鑑定結果一致證實，3例為IgG抗-D、1例為抗-Lea。
三、U型多孔板—自動溫控震蕩儀器方法1、取U型多孔板，標記陽性對照孔、陰性對照孔、受檢孔1、受檢孔2、受檢孔3。
2、向陽性對照孔加入3％Rho(D)陽性紅細胞懸液50μl；向陰性對照孔加入3％Rho(D)陽性紅細胞懸液50μl；向受檢孔1加入3％I號篩檢紅細胞懸液50μl，向受檢孔2加入3％II號篩檢紅細胞懸液50μl，向受檢3孔加入3％III號篩檢紅細胞懸液50μl；向各實驗孔加入木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液50μl，混合均勻。
3、將實驗多孔板移入自動溫控振蕩儀內，在37℃、300r/min、1Level條件下孵育7分鐘。
4、向每一實驗孔加入酶抑制劑-64試劑溶液50μl，向陽性對照孔加入IgG抗-D血清50μl；向陰性對照孔加入AB血清50μl；向受檢孔1-受檢孔3各加入受檢血清50μl，或紅細胞放散液100μl，混合均勻。
5、將實驗多孔板移入自動溫控振蕩儀內，在37℃、300r/min、1Level條件下孵育7分鐘。
6、將實驗系統移入離心機，120×g離心1分鐘。
7、將實驗系統移入自動溫控振蕩儀內，在1000r/min、2Level、1分鐘工作條件下懸浮紅細胞。
8、用掃描酶標儀—自動血型判讀系統讀取、記錄實驗結果。
9、陽性對照孔產生紅細胞凝集，陰性對照孔不產生紅細胞凝集，實驗結果成立。受檢孔出現紅細胞凝集為實驗檢定陽性結果，受檢孔未出現紅細胞凝集為實檢定陰性結果。
採用間接抗人球蛋白血型抗體篩檢實驗方法與本發明的U型多孔板—自動溫控震蕩儀器血型抗體篩檢實驗方法為平行試驗，在對2000例獻血者的血清樣本中一致篩檢出4例陽性血樣，無「假陰性」、「假陽性」實驗結果。
對4例陽性血樣，採用室溫鹽水、37℃鹽水、間接抗人球蛋白等血型抗體特異性鑑定實驗方法，以及實施例6所述的血型抗體特異性鑑定實驗方法，進行抗體特異性鑑定。鑑定結果一致證實，3例為IgG抗-D、1例為抗-Lea。
四、U型多孔板—微波—自動溫控震蕩儀器方法1、同U型多孔板—自動溫控震蕩儀器方法中的第1步。
2、同U型多孔板—自動溫控震蕩儀器方法中的第2步。
3、將實驗U型多孔板移入微波場，在功率強度360W，功率輸出率30％的條件下，輻射孵育200秒鐘。
4、同U型多孔板—自動溫控震蕩儀器方法中的第4步。
5、將實驗U型多孔板移入微波場，在功率強度360W，功率輸出率30％的條件下，輻射孵育200秒鐘。
6、同U型多孔板—自動溫控震蕩儀器方法中的第6步。。
7、同U型多孔板—自動溫控震蕩儀器方法中的第7步。。
8、同U型多孔板—自動溫控震蕩儀器方法中的第8步。
9、同U型多孔板—自動溫控震蕩儀器方法中的第9步。
採用上述的U型多孔板—自動溫控震蕩儀器血型抗體篩檢實驗方法、間接抗人球蛋白血型抗體篩檢實驗方法與本發明的實驗方法為平行試驗，在對2000例獻血者的血清樣本中一致篩檢出出4例陽性血樣，無「假陰性」、「假陽性」實驗結果。
對4例陽性血樣，採用室溫鹽水、37℃鹽水、間接抗人球蛋白等血型抗體特異性鑑定實驗方法，以及實施例6所述的血型抗體特異性鑑定實驗方法，進行抗體特異性鑑定。鑑定結果一致證實，3例為IgG抗-D、1例為抗-Lea。
實施例6 血型抗體特異性鑑定實驗(試管—水浴方法)1、取試管，標記I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI，依次置試管架排列。
2、向上述試管加入與其標記相符合的3％血型譜細胞懸液50μl，木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液50μl，混合均勻。
3、將試管移入37±0.5℃水浴孵育5分鐘。
4、向全部試管各加入酶抑制劑-64試劑溶液50μl；向全部試管各加入血清標本50μl，或紅細胞放散液100μl，混合均勻。
5、將試管移入37±0.5℃水浴孵育7分鐘。
6、將試管移入離心機，120×g離心1分鐘。
7、輕輕搖動試管，懸浮紅細胞，肉眼觀察實驗鑑定結果。依據受檢血清在不同血型譜細胞產生的凝集與否，判定受檢血清的血型抗體特異性。
經採用室溫鹽水實驗、37鹽水實驗、間接抗人球蛋白實驗等血型抗體特異性鑑定實驗方法與本發明的實驗方法作為平行試驗，對產自Immucor的人源型Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、Kell-抗-K、抗-k、kiad-抗-JKa、抗-JKb、Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b、P-抗-P1等血型抗體血清，以及臨床樣本血清進行抗體特異性鑑定。實驗結果表明，本實驗方法對上述血型抗體的實驗鑑定準確率為100％。
實施例7血型抗體效價滴定實驗(試管—水浴方法)1、取10支試管，標記1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512；向1/2-1/512各加入生理鹽水100μl；向1/1加入被滴定的血型抗體血清200μl。
2、用加樣器自1/1吸取血清100μl，注入1/2，用加樣器反覆吸注，混合均勻。如此所示方法製備血型抗體血清倍比稀釋液。
3、取11支試管，標記1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、陰性對照。向上述試管各加入與被滴定的血型抗體相匹配的純合子血型抗原陽性3％紅細胞懸液50μl，木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液50μl，混合均勻。
4、將試管移入37±0.5℃水浴孵育5分鐘。
5、向全部試管各加入酶抑制劑-64試劑溶液50μl；向血型抗體效價滴定試管加入與其標記相符合的血型抗體血清倍比稀釋液100μl；向陰性對照加入AB血清50μl，混合均勻。
6、將試管移入37±0.5℃水浴孵育7分鐘。
7、將試管移入離心機，120×g離心1分鐘。
8、輕輕搖動試管，懸浮紅細胞，肉眼觀察滴定實驗結果。陰性對照無紅細胞凝集，實驗結果成立。以最高稀釋倍數的血型抗體血清對紅細胞產生的最小凝集強度(1+)的倒數為為被滴定的抗體的效價。
經採用間接抗人球蛋白血型抗體效價滴定實驗方法與本發明的實驗方法作為平行試驗，對產自Immucor的人源型Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e，Kell-抗-K、抗-k，kiad-抗-JKa、抗-JKb，Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b，P-抗-P1等血型抗體血清以及臨床血清樣本進行抗體效價滴定。實驗結果表明，本發明的實驗方法與間接抗人球蛋白抗體效價滴定實驗方法相比，平均靈敏度高出2-3個數量級。
實施例8 IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗一、試管—水浴方法1、取血清，加入等量PBS-2me溶液，37±0.5℃保溫1小時，製備IgG抗-A、抗-B實驗檢定用血清樣本溶液。
取IgG抗-A、抗-B實驗檢定用血清樣本溶液、或紅細胞放散液，用倍比稀釋方法製備1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512倍比稀釋液，作為受檢標本倍比稀釋液。
2、取24支試管，標記A1/1、A1/2、A1/4、A1/8、A1/16、A1/32、A1/64、A1/128、A1/256、A1/512作為受檢A，A陽性對照、A陰性對照；B1/1、B1/2、B1/4、B1/8、B1/16、B1/32、B1/64、B1/128、B256、B1/512作為受檢B，B陽性對照、B陰性對照，依次置試管架排列。
3、向A1/1-A陰性對照加入3％A型紅細胞懸液50μl；向B1/1-B陰性對照加入3％B型紅細胞懸液50μl；向每支試管加入木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液50μl，混合均勻。
4、將試管移入37±0.5℃水浴孵育5分鐘。
5、向全部試管各加入酶抑制劑-64試劑溶液50μl；向A1/1-A1/512加入1/1-1/512加入與其標記數碼相符合的受檢標本倍比稀釋液100μl，向A陽性對照加入IgG抗-A血清50μl，向A陰性對照加入AB血清50μl；向B1/1-B1/512加入加入與其標記數碼相符合的1/1-1/512受檢標本倍比稀釋液100μl，向B陽性對照加入IgG抗-B血清50μl，向B陰性對照加入AB血清50μl，混合均勻。
6、將試管移入37±0.5℃水浴場孵育7分鐘。
7、將試管移入離心機，120×g離心1分鐘。
8、輕輕搖動試管，懸浮紅細胞，肉眼觀察實驗檢定結果。
9、陽性對照產生紅細胞凝集，陰性對照不產生紅細胞凝集，實驗結果成立。受檢A出現紅細胞凝集為實驗檢定陽性結果，受檢A未出現紅細胞凝集為實檢定陰性結果；受檢B出現紅細胞凝集為實驗檢定陽性結果，受檢A未出現紅細胞凝集為實檢定陰性結果。以最高稀釋倍數的受檢標本對紅細胞產生的最小凝集強度(1+)的倒數為被滴定的抗體的效價。
採用間接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗方法與本發明的檢定實驗方法為平行試驗，對2000例O型血獻血者的血清樣本中一致檢定出612例IgG抗-A、1106例IgG抗-B，無「假陰性」、「假陽性」實驗結果。
本發明的IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗的結果顯示的612例抗-A、1106例IgG抗-B的效價較間接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗的結果高出2-3個數量級。
二、試管—微波方法1、同試管-水浴方法的步驟1。
2、同試管-水浴方法的步驟2。
3、同試管-水浴方法的步驟3。
4、將試管移入微波場，在功率強度360W，功率輸出率30％的條件下，輻射孵育200秒鐘。
5、同試管-水浴方法的步驟5。
6、將試管移入微波場，在功率強度360W，功率輸出率30％的條件下，輻射孵育300秒鐘。
7、同試管-水浴方法的步驟7。
8、同試管-水浴方法的步驟8。
9、同試管-水浴方法的步驟9。
採用上述的試管—水浴IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗方法、間接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗方法、與本發明的IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗方法為平行試驗，對2000例O型血獻血者的血清樣本中一致檢定出612例IgG抗-A、1106例IgG抗-B，無「假陰性」、「假陽性」實驗結果。
本發明的IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗的結果顯示的612例抗-A、1106例IgG抗-B的效價較間接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗的結果高出2-3個數量級。與上述的試管—水浴IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗的結果無明顯差異。
三、U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法1、同試管-水浴方法的步驟1。
2、取多孔板，標記A1/1、A1/2、A1/4、A1/8、A1/16、A1/32、A1/64、A1/128、A1/256、A1/512作為受檢A，A陽性對照、A陰性對照；B1/1、B1/2、B1/4、B1/8、B1/16、B1/32、B1/64、B1/128、B256、B1/512作為受檢B，B陽性對照、B陰性對照。
3、向A1/1-A陰性對照各加入3％A型紅細胞懸液50μl；向B1/1-B陰性對照加入3％B型紅細胞懸液50μl；向每1實驗孔加入木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液50μl，混合均勻。
4、將實驗多孔板移入自動溫控振蕩儀內，在37℃、300r/min、1Level條件下孵育7分鐘。
5、向每1實驗孔加入酶抑制劑-64試劑溶劑50μl，向A1/1-A1/512加入1/1-1/512加入與其標記數碼相符合的受檢標本倍比稀釋液100μl，或紅細胞放散液100μl，向A陽性對照加入IgG抗-A血清50μl，向A陰性對照加入AB血清50μl；向B1/1-B1/512加入與其標記數碼相符合的受檢標本倍比稀釋液100μl，或紅細胞放散液100μl，向B陽性對照加入IgG抗-B血清50μl，向B陰性對照加入AB血清50μl，混合均勻。
6、將實驗多孔板移入自動溫控振蕩儀內，在37℃、300r/min、1Level條件下孵育7分鐘。
7、將實驗多孔板移入離心機，120×g離心1分鐘。
8、用掃描酶標儀—自動血型判讀系統讀取、記錄實驗結果。
9、陽性對照產生紅細胞凝集，陰性對照不產生紅細胞凝集，實驗結果成立。受檢A出現紅細胞凝集為實驗檢定陽性結果，受檢A未出現紅細胞凝集為陰性實驗檢定結果；受檢B出現紅細胞凝集為陽性實驗檢定結果，受檢B未出現紅細胞凝集為陰性實驗檢定結果。陽性實驗檢定結果，以最高稀釋倍數的受檢標本倍比稀釋液對紅細胞產生的最小凝集強度(1+)的倒數為抗體的效價。
採用間接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗方法與本發明的IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗方法為平行試驗，在對2000例O型血獻血者的血清樣本中一致檢定出612例IgG抗-A、1106例IgG抗-B，無「假陰性」、「假陽性」實驗結果。
本發明的IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗的結果顯示的612例抗-A、1106例IgG抗-B的效價較間接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗的結果高出2-3個數量級。
四、U型多孔板—微波—自動溫控震蕩儀方法1、同U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法中的步驟1。
2、同U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法中的步驟2。
3、同U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法中的步驟3。
4、將實驗多孔板移入微波場，在功率強度360W，功率輸出率30％的條件下，輻射孵育200秒鐘。
5、同U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法中的步驟5。
6、將實驗多孔板移入微波場，在功率強度360W，功率輸出率30％的條件下，輻射孵育300秒鐘。
7、同U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法中的步驟7。
8、同U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法中的步驟8。
9、同U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法中的步驟9。
採用上述的U型多孔板—自動溫控震蕩儀IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗方法、間接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗方法、與本發明的IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗方法為平行試驗，在對2000例O型血獻血者的血清樣本中一致檢定出612例IgG抗-A、1106例IgG抗-B，無「假陰性」、「假陽性」實驗結果。
本發明的IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗的結果顯示的612例抗-A、1106例IgG抗-B的效價較間接抗人球蛋白IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗的結果高出2-3個數量級。與U型多孔板—微波—自動溫控震蕩儀方法IgG抗-A、抗-B血型抗體檢定實驗所得實驗結果無明顯差異。
實施例9 輸血相容性實驗一、試管—水浴方法1、取4支試管，標記主側、次側、陽性對照、陰性對照。向主側加入3％供血者紅細胞懸液50μl，向次側加入3％受血者紅細胞懸液50μl；陽性對照、陰性對照各加入3％Rho(D)陽性紅細胞懸液50μl，向全部試管各加入木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液50μl，混合均勻。
2、將試管移入37±0.5℃水浴孵育5分鐘。
3、向全部試管各加入酶抑制劑-64試劑溶液50μl；向主側加入受血者血清50μl；向次側加入供血者血清50μl，向陽性對照加入IgG抗-D血清50μl；向陰性對照加入AB血清50μl混合均勻。
4、將試管移入37±0.5℃水浴孵育7分鐘。
5、將試管移入離心機，120×g離心1分鐘。
6、輕輕搖動試管，懸浮紅細胞，肉眼觀察實驗結果。陽性對照產生紅細胞凝集，陰性對照不產生紅細胞凝集，實驗結果成立。主側、次側無紅細胞凝集與溶血為陰性實驗結果，主側、或次側出現紅細胞凝集與溶血為陽性實驗結果。
採用間接抗人球蛋白輸血相容性實驗方法、與本發明的實驗方法為平行試驗，在對1150例輸血相容性實驗中一致檢定出2例陽性標本，無「假陰性」、「假陽性」實驗結果。
對上述陽性標本採用採用室溫鹽水、37℃鹽水、間接抗人球蛋白等血型抗體特異性鑑定實驗方法，以及實施例6所述的抗體特異性鑑定實驗方法，進行抗體特異性鑑定。同類實驗檢定結果一致確認，其中1例為IgG抗-E，1例為抗-K。
二、試管—微波方法1、同試管—水浴方法中的第1步。
2、將試管移入微波場，在功率強度360W，功率輸出率30％的條件下，輻射孵育200秒鐘。
3、同試管—水浴方法中的第3步。
4、將試管移入微波場，在功率強度360W，功率輸出率30％的條件下，輻射孵育300秒鐘。
5、同試管—水浴方法中的第5步。
6、同試管—水浴方法中的第6步。。
採用間接抗人球蛋白輸血相容性實驗方法、上述的試管—水浴輸血相容性實驗方法、與本發明實驗方法為平行試驗，在對1150例輸血相容性實驗中一致檢定出2例陽性標本，無「假陰性」、「假陽性」實驗結果。
對上述陽性標本採用採用室溫鹽水、37℃鹽水、間接抗人球蛋白等血型抗體特異性鑑定實驗方法，以及實施例6所述的抗體特異性鑑定實驗方法，進行抗體特異性鑑定。同類實驗檢定結果一致確認，其中1例為IgG抗-E，1例為抗-K。
三、U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法1、取U多孔板，標記主側孔、次側孔、陽性對照孔、陰性對照孔。向主側孔加入3％供血者紅細胞懸液50μl，向次側孔加入3％受血者紅細胞懸液50μl；向陽性對照孔、陰性對照孔各加入3％Rho(D)陽性紅細胞懸液50μl，向全部實驗孔各加入木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液50μl，混合均勻。
2、將U實驗多孔板移入自動溫控振蕩儀內，在37℃、300r/min、1Level條件下孵育7分鐘。
3、向全部實驗孔各加入酶抑制劑-64試劑溶液50μl；向主側孔加入受血者血清50μl；向次側孔加入供血者血清50μl，向陽性對照孔加入IgG抗-D血清50μl；向陰性對照加孔入AB血清50μl混合均勻。
4、將U實驗多孔板移入自動溫控振蕩儀內，在38±0.5℃、300r/min、1Level條件下孵育7分鐘。
5、將實驗多孔板移入離心機，120×g離心1分鐘。
6、將實驗多孔板入自動溫控振蕩儀內，在1000r/min、2Level、1分鐘工作條件下懸浮紅細胞。
7、用掃描酶標儀—自動血型判讀系統讀取、記錄實驗結果。
8、陽性對照孔產生紅細胞凝集，陰性對照孔未產生紅細胞凝集，實驗結果成立。主側孔、次側孔出現紅細胞凝集為陽性實驗結果，主側孔、次側孔未出現紅細胞凝集為陰性實驗結果。
採用間接抗人球蛋白輸血相容性實驗方法、與本發明的輸血相容性實驗方法為平行試驗，在對1150例輸血相容性實驗中一致檢定出2例陽性標本，無「假陰性」、「假陽性」實驗結果。
對上述陽性標本採用採用室溫鹽水、37℃鹽水、間接抗人球蛋白等血型抗體特異性鑑定實驗方法，以及實施例6所述的抗體特異性鑑定實驗方法，進行抗體特異性鑑定。實驗檢定結果一致確認，其中1例為IgG抗-E，1例為抗-K。
四、U型多孔板—微波—自動溫控震蕩儀方法1、U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法中的第1步。
2、將U型實驗多孔板移入微波場，在功率強度360W，功率輸出率30％的條件下，輻射孵育200秒鐘。
3、U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法的第3步。
4、將U型實驗多孔板移入微波場，在功率強度360W，功率輸出率30％的條件下，輻射孵育300秒鐘。
5、U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法中的第5步。
6.U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法中的第6步。
7、U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法中的第7步。
8、U型多孔板—自動溫控震蕩儀方法中的第8步。
採用間接抗人球蛋白輸血相容性實驗方法、U型多孔板—自動溫控震蕩儀輸血相容性實驗方法、與本發明的實驗方法為平行試驗，在對1150例輸血相容性實驗中一致檢定出2例陽性標本，無「假陰性」、「假陽性」實驗結果。
對上述陽性標本採用採用室溫鹽水、37℃鹽水、間接抗人球蛋白等血型抗體特異性鑑定實驗方法，以及實施例6所述的抗體特異性鑑定實驗方法，進行抗體特異性鑑定。實驗檢定結果一致確認，其中1例為IgG抗-E，1例為抗-K。
實施例10低pH免疫球蛋白注射液的IgG-抗-A、抗-B檢定實驗本實驗對由藥品供應商提供的低pH免疫球蛋白注射液進行免疫性抗-A、抗-B進行檢定，提供了一種快速、安全的藥品檢驗方法。
1、受檢物溶液製備吸取10ml原液，用5％磷酸氫二鈉溶液調節pH至7.0，用生理鹽水溶液稀釋至20ml，製成受檢標本溶液。取受檢標本溶液，用倍比稀釋方法製備1/1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512受檢標本溶液倍比稀釋液。
2、取24支試管，標記A1/1、A1/2、A1/4、A1/8、A1/16、A1/32、A1/64、A1/128、A1/256、A1/512作為受檢A，A陽性對照、A陰性對照；B1/1、B1/2、B1/4、B1/8、B1/16、B1/32、B1/64、B1/128、B256、B1/512作為受檢B，B陽性對照、B陰性對照，依次置試管架排列。
3、向A1/1-A陰性對照加入3％A型紅細胞懸液50μl；向B1/1-B陰性對照加入3％B型紅細胞懸液50μl；向每支試管加入木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液50μl，混合均勻。
4、將試管移入37±0.5℃水浴孵育5分鐘。
5、向全部試管各加入酶抑制劑-64試劑溶液50μl，向A1/1-A1/512加入與其標記數碼相符合的受檢標本倍比稀釋液200μl，向A陽性對照加入IgG-抗-A血清50μl，向A陰性對照加入AB血清50μl；向B1/1-B1/512加入與其標記數碼相符合的1/1-1/512受檢標本倍比稀釋液100μl，向B陽性對照加入IgG-抗-B血清50μl，向B陰性對照加入AB血清50μl，混合均勻。
6、將試管移入37±0.5℃水浴場孵育7分鐘。
7、將試管移入離心機，120×g離心1分鐘。
8、輕輕搖動試管，懸浮紅細胞，肉眼觀察實驗檢定結果。
9、陽性對照產生紅細胞凝集，陰性對照不產生紅細胞凝集，實驗結果成立。受檢A出現紅細胞凝集為實驗檢定陽性結果，受檢A未出現紅細胞凝集為實檢定陰性結果；受檢B出現紅細胞凝集為實驗檢定陽性結果，受檢B未出現紅細胞凝集為實檢定陰性結果。以最高稀釋倍數的受檢標本對紅細胞產生的最小凝集強度(1+)的倒數為被滴定的抗體的效價。
經與間接抗人球蛋白檢定實驗結果相比較，本發明實驗檢定方法準確率為100％，實驗檢定靈敏度高於間接抗人球蛋白檢定實驗1-2個數量級。
權利要求
1.一種檢測體外血型血清學的方法，包括如下步驟1)將木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液與紅細胞懸液混合均勻，在水浴場、微波場、或自動溫控振蕩儀中孵育；所述木瓜凝乳蛋白酶製劑含有木瓜凝乳蛋白酶，L-半胱氨酸和普魯蘭；2)加入酶抑制劑-64試劑溶液，然後分別加入受檢物，陽性對照物和陰性對照物，混合均勻，在水浴箱、微波場或自動溫控振蕩儀中孵育；所述酶抑制劑-64含有反式-環氧琥珀醯-L-亮氨醯氨基(4-胍基)丁烷、甘露醇、海藻糖和普魯蘭；3)120×g離心1分鐘，記錄檢測結果。
2.根據權利要求1所述的檢測體外血型血清學實驗方法，其特徵在於所述木瓜凝乳蛋白酶製劑中還含有甘露醇、海藻糖和維生素C鹽；所述木瓜凝乳蛋白酶製劑中每200000PU單位的木瓜凝乳蛋白酶中甘露醇、海藻糖和維生素C鹽的含量分別為0.2-0.3mol、0.01-0.02mol和0.01-0.02mol。
3.根據權利要求1所述的檢測體外血型血清學實驗方法，其特徵在於所述酶抑制劑-64中每40000TU單位的反式-環氧琥珀醯-L-亮氨醯氨基(4-胍基)丁烷中甘露醇、海藻糖和普魯蘭的含量分別為0.2-0.3mol、0.01-0.02mol和0.05-0.1mol。
4.根據權利要求1或2或3所述的檢測體外血型血清學實驗方法，其特徵在於所述水浴場孵育為在37-39℃水浴箱中保溫5-10分鐘；所述微波場孵育為在設定功率300-360W、輸出功率30％微波場中保溫200-300秒鐘；所述自動溫控振蕩儀孵育為在37-39℃、300-500r/min、2-3級自動溫控振蕩儀中保溫5-10分種。
5.根據權利要求1或2或3所述的檢測體外血型血清學實驗方法，其特徵在於所述紅細胞的濃度為2-4％。
6.根據權利要求1或2或3所述的檢測體外血型血清學實驗方法，其特徵在於所述受檢物為患者血清樣本，獻血者血清樣本，患者、獻血者IgG-抗-A、抗-B實驗檢定用血清樣本溶液，紅細胞放散液；以及人源型ABO-IgG-抗-A、抗-B，Rh-抗-D、抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、Kell-抗-K、抗-k、kiad-抗-JKa、抗-JKb、Lewis-抗-Lea、抗-Leb、抗-Lea+b、P-抗-P1抗體血清。
7.根據權利要求1或2或3所述的檢測體外血型血清學實驗方法，其特徵在於所述檢定實驗使用的紅細胞試劑是ABO以外血型抗體篩檢紅細胞懸液，紅細胞ABO以外血型譜細胞懸液；A型紅細胞懸液或B型紅細胞懸液。
8.根據權利要求1所述的檢測體外血型血清學實驗方法，其特徵在於所述檢測記錄實驗結果，當用U型多孔板為實驗容器時，採用掃描酶標儀—血型判讀系統自動讀取、記錄實驗結果；當用試管為實驗容器時，採用人工讀取、記錄實驗結果。
9.根據權利要求1所述的檢測體外血型血清學實驗方法，其特徵在於木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液具有的活力效價為1/10分鐘10-16PU/50μl、或者是10分鐘100-160PU/50μl。
10.根據權利要求1所述的檢測體外血型血清學實驗方法，其特徵在於酶抑制劑-64試劑溶液具有的活性效價為1/10分鐘20-32TU/50μl、或者是10分鐘200-320TU/50μl。
全文摘要
本發明公開了一種體外紅細胞的血型血清學實驗檢定方法，該方法包括如下步驟1)將木瓜凝乳蛋白酶試劑溶液與紅細胞懸液混合均勻，在水浴場、微波場、或自動溫控振蕩儀中孵育；所述木瓜凝乳蛋白酶製劑含有木瓜凝乳蛋白酶，L－半胱氨酸和普魯蘭；2)加入酶抑制劑－64試劑溶液，分別加入受檢物，陽性對照物和陰性對照物，混合均勻，在水浴箱、微波場或自動溫控振蕩儀中孵育；所述酶抑制劑－64含有反式－環氧琥珀醯－L－亮氨醯氨基(4－胍基)丁烷、甘露醇、海藻糖和普魯蘭；3)120×g離心1分鐘，記錄檢測結果。本發明所提供的檢測方法，具有較強的特異性，較高的實驗安全性與實驗檢定靈敏度，可用於血型抗體與相應紅細胞血型抗原的檢定，如抗體篩檢，抗體特異性鑑定，抗體效價滴定，輸血相容性試驗等。
文檔編號G01N33/536GK1584595SQ20041004610
公開日2005年2月23日 申請日期2004年5月31日 優先權日2004年5月31日
發明者盧世昌, 劉俊鳳 申請人:廣州偉仕科技有限公司