一種福建山櫻花體細胞胚胎發生方法
2023-05-20 11:25:51
專利名稱：一種福建山櫻花體細胞胚胎發生方法
技術領域：
本發明屬於植物培育技術，涉及一種福建山櫻花體細胞胚胎發生方法。
背景技術：
福建山櫻花、Cerasus campanulata Maxim.)隸屬於薔薇科(Rosaceae)李亞科 (Prunusoidea)櫻屬(Cerasus)，又名緋寒櫻、福建櫻、山櫻桃、鐘花櫻、結櫻桃等，落葉喬木，高達15m;樹皮灰褐色或黑褐色，粗糙不開裂，質地堅韌、橫向剝落。葉紙質，卵形，橢圓狀卵形或卵狀矩圓形，長壙9cm，寬2. 5^3. 5cm，先端漸尖，基部近圓形或微帶心形，邊緣有銳而細的單或微重鋸齒。有一對紅色腺體，單葉螺旋狀互生，重鋸齒緣(雙重鋸齒緣)，揉碎具有杏仁味；託葉線形，細裂狀。每年冬末春初開花，先花後葉，花呈下垂性開展，腋出，單生或3飛朵形成傘房花序，花梗細長，有腺毛，花萼鐘形，花瓣桃紅色、緋紅色或暗紅色，先端呈凹形，半開狀，雄蕊多數。通常11月能見花蕾，冬末初春開花，盛花期1月下旬至2月下旬。花後結卵形至橢圓形核果，至4飛月間果實成熟，果長約1.5cm，成熟時深紅色，果小但可食，內藏一粒種子；福建山櫻花在土質疏鬆的紅壤、黃壤中生長良好，在乾旱瘠薄的荒山生長不良，可在低海拔地區種植，並有很強的適應性和較強的抗汙染性。性喜光照充足和溫暖的環境，較耐高溫和陰涼，可在低海拔地區種植，最適生育溫度15 28°C，並有很強的適應性和較強的抗汙染性能力。福建山櫻花早春開花，適宜種植與中國式庭院的水池邊、假山旁或院落中，亦可布置與公園中。福建山櫻花生長緩慢，其木材可用於室內裝修和器械用具等用材，該樹種，花色粉紅，尚美觀，可做庭園樹種栽培。其果實成熟時，果皮鮮紅色，既美觀， 亦可食用。福建山櫻花的花果還具有一定的食用價值，花朵曬乾後可代替茶葉使用，也可做成糕點或經鹽漬後當成油炸物或湯類的配料。花瓣加入麵包中還可增加美觀及風味；浸泡於紹興酒中，飲來分外香醇。果實可洗淨後生食，也可用糖醃漬後食用，或製成果醬或蜜餞。開展福建山櫻花新品種選育研究，對豐富我國的觀賞花木資源，改善生態環境具有重要的意義。但福建山櫻花現存林分極為稀少、種實成熟時極易爆裂，種子的採收貯存與發芽極為困難，傳統育種方法中，不論是利用無性系改良方法進行品種改良，還是進行有性雜交育種，或是把有性育種和無性利用二者有機地結合起來，都不易取得大的突破，且通常需要耗費十多年乃至數十年的時間，育種效率有待提高。隨著植物組織和細胞培養技術的不斷完善，在理論研究和生產實踐的應用上都已取得一些重大成果。據不完全統計，全世界約有1000多種高等植物作過離體培養的研究， 其中絕大多數可通過體細胞胚發生途徑形成再生植株。而且愈來愈多的研究表明，植物體細胞在離體培養中，通過體細胞胚胎發生途徑形成再生植株已是極其普遍的現象，並認為該發生途徑是植物體細胞在離體培養條件下的一個基本發育途徑。這也就是說，植物的體細胞可能具有潛在的，像有性過程產生合子胚一樣的全能性。為提高育種效率近年來利用組織培養的技術對福建山櫻花的研究較多，2002年王光萍最先利用福建山櫻花的嫩枝進行叢生芽誘導和叢生芽生根，為福建山櫻花的組織培養摸索了條件。2006年呂月良對福建山櫻花不定芽誘導和植株再生規模化繁殖試驗，試管苗
3移栽成活率較高，各項指標已達到快繁育苗的要求，為工廠化作業提供了條件。2006年黃宇翔等也對福建山櫻花組培快繁進行研究，並探索了如何縮短組培快繁的時間。2008年鄒娜，徐楠等對福建山櫻花試管苗生根條件的優化，以提高試管苗移栽成活率。對於福建山櫻花的器官發生的研究已經比較系統，而這些研究目前還不能夠實現快速培育福建山櫻花來滿足使用要求。在2010年的《福建山櫻花不定芽繁殖及體細胞胚胎發生研究》研究生碩士學位論文中，賈利娜對福建山櫻花體細胞胚胎發生進行了探索性試驗，採用福建山櫻花的葉片、 葉柄、枝條、花瓣、花託和花柄為外植體進行誘導，只有葉片、葉柄、花瓣、花柄有類似胚的發育，類似胚的結構只長出根便發育停止，最終未發育成體胚及體胚苗，枝條和花託的愈傷組織也沒有分化。
發明內容
發明目的針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種周期短、繁殖率高、成本低廉的福建山櫻花體細胞胚胎發生方法。技術方案為了實現上述發明目的，本發明採用的技術方案為一種福建山櫻花體細胞胚胎發生方法，包括以下步驟
(1)春季採集福建山櫻花的未成熟果實，先用流水衝洗2h，然後在無菌條件下切開種皮，取出兩片子葉和未成熟胚接到誘導培養基，控溫23°C，培養半個月，得胚性愈傷組織； 其中，誘導培養基採用MS培養基，在其中附加l.(T4.0mg/L 2，4_D、0. 2 1. Omg/L 6-苄胺基嘌呤(BA)、500mg/L水解酪蛋白、lOmg/L維生素C、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，pH5. 8 ；
(2)將步驟(1)的胚性愈傷組織轉入增殖培養基，控溫23°C，暗培養至產生球形胚狀體；其中，增殖培養基採用MS或1/2MS培養基，在其中附加0. 5^1. Omg/L 2，4_D、 0. 2 0. 5mg/L BA、500mg/L 水解酪蛋白、lOmg/L 維生素 C、30g/L 蔗糖和 6g/L 瓊脂，ρΗ5· 8 ；
(3)將步驟(2)的球形胚狀體轉入培育培養基，控溫22 27光照12h d — S光照度為1200 Ix,光培養至長出幼苗；其中，培育培養基採用MS基本培養基，在其中附加1 Omg/L維生素C、蔗糖30g/L和瓊脂6g/L，ρΗ5· 8 ；
(4)將步驟(3)的幼苗轉入生長培養基，培養至長成完整小苗；其中，生長培養基採用 MS培養基，在其中附加10mg/L維生素C、蔗糖20g/L和瓊脂6g/L，pH5. 8。步驟(1)中，誘導培養基中的2，4-D的濃度優選為2. 0 3. Omg/L。有益效果與現有技術中的體細胞發生方法相比，本發明的福建山櫻花體細胞胚胎發生方法具有的突出優勢為首次採用福建山櫻花的未成熟果實，取其未成熟胚為外植體進行誘導，增殖且得到體胚苗和結構完整的再生植株，是一種周期短、繁殖率高、成苗快、 結構完整、遺傳相對性穩定成本低廉的方法，突破了福建山櫻花現存林分極為稀少、種實成熟時極易爆裂，種子的採收貯存與發芽極為困難，傳統育種方法困難且育種效率低，無法滿足園林綠化及生產的需要的現狀。
圖1是2，4-D濃度與胚性愈傷組織誘導率的關係曲線。圖中的縱坐標為誘導率 (%)，橫坐標為2，4-D的濃度，單位為mg/L ；
4圖2是外植體接種到誘導培養基上的圖3左圖是外植體在誘導培養基上直接體細胞胚胎發生圖4右圖是外植體在誘導培養基上胚根伸長生長圖5左圖是外植體在誘導培養基上膨大生長且邊緣有愈傷組織長出的圖6右圖是外植體在誘導培養基上誘導出的胚性愈傷組織圖7是愈傷組織增殖階段的愈傷組織圖8和圖9均為胚性愈傷組織在增殖階段產生的胚狀體；
圖10是將胚狀體轉到培育培養基上光下培養圖11是體胚苗生長培養基上的圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步的解釋。以下實施例所使用的材料和培養基配方如下
材料選擇長勢良好、抗性強的優良母株，開花授粉、坐果後採集其未成熟果實為材
料；
誘導培養基在MS或B5培養基中附加廣4mg/L 2，4_D、0. 2 lmg/L BA、500mg/L水解酪蛋白、10mg/L的維生素C、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，pH5. 8 ；
增殖培養基在MS或1/2MS培養基中附加0. 5 1.0mg/L 2，4_D、0. 2 0. 5mg/L ΒΑ、 500mg/L水解酪蛋白、lOmg/L維生素C、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，pH5. 8 ；
培育培養基在MS培養基中附加:10mg/L維生素C、蔗糖30g/L和瓊脂6g/L，ρΗ5· 8 ； 生長培養基在MS培養基中附加10mg/L維生素C、蔗糖20g/L和瓊脂6g/L，pH5. 8 ； 其中，MS、B5以及1/2MS培養基均為業內標準配方。實施例1胚性愈傷組織的誘導
採用未成熟胚進行胚性愈傷組織的誘導。春季採集未成熟果實先用流水衝洗2h，然後在超淨臺上用酒精滅菌30s，用滅過菌的蒸餾水衝洗乾淨再用0. 1%的升汞或84消毒液處理Γ20π η，蒸餾水衝洗乾淨，未成熟果實在超淨工作檯內用解剖刀切開種皮，取出兩片子葉和未成熟胚接到誘導培養基上，如圖2所示，將接種好的材料置於23°C的培養箱中進行暗培養。未成熟胚接到誘導培養基上後約半個月後開始啟動，如圖3、圖4、圖5和圖6中所示，有的直接體細胞胚胎發生，有的紅色的胚根開始伸長，有的則在子葉子葉膨大邊緣有白色突起，有的在刀口邊緣長出白色、淡黃色或黃綠色愈傷組織。如圖1所示，各種濃度的2，4-D均能誘導愈傷組織產生，濃度低的2，4_D利於福建山櫻花直接體細胞胚胎發生，濃度為2. (Γ3. Omg/L的2，4-D特別利於胚性愈傷組織的產生。實施例2胚性愈傷組織增殖階段
胚性愈傷組織增殖階段，採用增殖培養基，增殖培養基繼續使用MS基本培養基，置於 23°C的培養箱中進行暗培養，如圖7所示。胚狀體的發生，在胚性愈傷組織增殖培養基上， 繼代幾次後，如圖8和圖9所示，黃綠色愈傷上有白色的，球形的胚狀體產生。實施例3胚狀體的發育和成熟
胚狀體的發育和成熟，球形胚形成以後，轉入培育培養基進行光下培養，光照ll'h.d S光照度為1200 lx，室溫為22 27°C。如圖10所示，幼苗在MS培養基上發育成小植株，轉入生長培養基，繼續培養，長成完整小苗，如圖11所示。 本發明的福建山櫻花體細胞胚胎發生技術為福建山櫻花的大規模無性繁殖育苗提供一種周期短、繁殖率高、成本低廉的方法，有效解決了福建山櫻花現存林分極為稀少、 種子成熟時極易爆裂、種子的採收貯存與發芽極為困難、傳統育種方法困難、且育種效率低，無法滿足園林綠化及生產需要問題。
權利要求
1.一種福建山櫻花體細胞胚胎發生方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)春季採集福建山櫻花的未成熟果實，先用流水衝洗2h，然後在無菌條件下切開種皮，取出兩片子葉和未成熟胚接到誘導培養基，控溫23°C，培養半個月，得胚性愈傷組織；其中，誘導培養基採用MS培養基，在其中附加1. 0 4· Omg/L 2，4_D、0. 2 1. Omg/L ΒΑ、 500mg/L水解酪蛋白、lOmg/L維生素C、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，pH5. 8 ；(2)將步驟(1)的胚性愈傷組織轉入增殖培養基，控溫23°C，暗培養至產生胚狀體；其中，增殖培養基採用MS或1/2MS培養基，在其中附加0. 5 1. Omg/L 2，4_D、0. 2 0. 5mg/L BA、500mg/L水解酪蛋白、lOmg/L維生素C、30g/L蔗糖和6g/L瓊脂，pH5. 8 ；(3)將步驟(2)的胚狀體轉入培育培養基，控溫22 27°C，光照12h d— 1，光照度為 1200 lx，光培養至長出幼苗；其中，培育培養基採用MS培養基，在其中附加10mg/L維生素 C、蔗糖 30g/L 和瓊脂 6g/L，ρΗ5· 8 ；(4)將步驟(3)的幼苗轉入生長培養基，培養至長成完整小苗；其中，生長培養基採用 MS培養基，在其中附加10mg/L維生素C、蔗糖20g/L和瓊脂6g/L，pH5. 8。
2.根據權利要求1所述的福建山櫻花體細胞胚胎發生方法，其特徵在於步驟(1)中， 誘導培養基中的2，4-D的濃度為2. (Γ3. Omg/L。
全文摘要
本發明公開了一種福建山櫻花體細胞胚胎發生方法，該方法包括在誘導培養基上誘導未成熟胚的胚性愈傷組織、採用增殖培養基進行胚性愈傷組織增殖、採用培育培養基和生長培養基分別進行胚狀體的發育和成熟，直至長成完整小苗。本發明的福建山櫻花體細胞胚胎發生技術為福建山櫻花的大規模無性繁殖育苗提供一種周期短、繁殖率高、成本低廉的方法，有效解決了福建山櫻花現存林分極為稀少、種子成熟時極易爆裂、種子的採收貯存與發芽極為困難、傳統育種方法困難、且育種效率低，無法滿足園林綠化及生產需要問題。
文檔編號A01H4/00GK102217534SQ201110097798
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月19日 優先權日2011年4月19日
發明者呂月良, 張元莉, 施季森, 蘇倩, 陳璋, 陳金慧 申請人:南京林業大學