甘露醇在製備抗胃癌藥物中的應用的製作方法
2023-05-20 00:59:26
專利名稱:甘露醇在製備抗胃癌藥物中的應用的製作方法
技術領域:
本發明涉及甘露醇的新用途,尤其是甘露醇在製備抗胃癌藥物中的應用。
背景技術:
目前,在抗腫瘤研究中,誘導癌細胞的凋亡是一個重要的途徑,促進腫瘤細胞凋亡可達到腫瘤縮小,癌症消退的目的,如傳統的抗腫瘤藥物順鉬、美法倫等均能刺激細胞線粒體凋亡途徑,引發凋亡。此種方式比採用殺傷腫瘤細胞的治療方式有明顯的優越性,因為抗腫瘤藥物若能大量的誘發腫瘤細胞的凋亡,激活其自身的程序性死亡過程,將會避免因大量細胞壞死而釋放細胞內物質引起的各種副作用,減輕化療對正常細胞的損傷,延長患者的生存期。然而,至今尚未篩選出能誘發腫瘤細胞大量凋亡的抗腫瘤藥。中藥誘導腫瘤細胞凋亡多為體外實驗研究,體內實驗較少,基本上處於初級研究階段。研究表明與細胞增殖 有關的原癌基因和抑癌基因都參與對細胞凋亡的調控,其中研究較多的有Bcl-2家族、細胞色素C、抑癌基因p53、Ice蛋白酶以及Fas/ΑΡΟ-Ι等。因此,以上述細胞凋亡的調控基因為靶基因,尋找在引發細胞凋亡作用中具有區別腫瘤細胞及正常細胞(即能引發腫瘤細胞凋亡而對正常細胞無反應)能力的藥物是近年來各國科學家努力的方向和抗腫瘤藥物研究的新売點。在傳統的非抗癌藥物中,科學家發現其中有一些具有可引起細胞凋亡的作用,這可能成為研發新的抗腫瘤藥物的途徑。然而,已發現的具有引起細胞凋亡作用的非抗癌藥物,僅僅在實驗室中得到證實,且尚不能誘發大量腫瘤細胞的凋亡,在臨床上尚未真正用於治療腫瘤。甘露醇(Mannitol)是一種己六醇,傳統醫藥用作良好的利尿劑,也是降低顱內壓、眼內壓及治療腎病的藥物。常用製劑甘露醇注射液作為高滲透降壓藥,是臨床搶救特別是腦部疾患搶救常用的一種藥物,具有降低顱內壓藥物所要求的降壓快、療效準確的特點。國內外未見甘露醇是否具有誘導癌細胞凋亡作用的報導,也沒有將甘露醇用於抗腫瘤治療的臨床應用先例。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種甘露醇在製備抗胃癌藥物中的應用,特別是使用特定濃度的甘露醇注射液治療胃癌。為解決上述技術問題本發明採用如下技術方案甘露醇在製備抗腫瘤藥物中的應用。上述腫瘤是肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、胃腺癌。肺癌是肺鱗癌、肺腺癌。上述抗腫瘤藥物為甘露醇注射液。上述甘露醇注射液的質量濃度為10% 19%。上述甘露醇注射液的質量濃度為13% 17%。
發明人通過科學實驗發現甘露醇具有抗腫瘤活性,尤其是特定濃度的甘露醇注射液具有明顯引起細胞凋亡的作用。通過採用多項細胞凋亡檢測技術及檢測凋亡相關基因bcl-2、bax,證實特定濃度甘露醇可誘導人多種癌細胞株明顯癌細胞凋亡,並掌握了其與濃度、時間的效應關係,初步闡明其可能機理,而且,發明人已將研究結果用於腫瘤病人治療並取得明顯的療效,這些為甘露醇在製備抗腫瘤藥物中的應用及其臨床推廣提供了理論依據和實際病例。同時,本發明為科學廉價地尋找高效低毒的誘導腫瘤細胞凋亡的藥物開闢了新的思路,極具科研意義。
圖1是48小時MTT濃度-抑制率曲線圖。圖2 是 7 天 MTT 時間-抑制率曲線圖,圖中120ug/ul,240ug/ul,360ug/ul,480ug/ul,5100ug/ul,6120ug/ul。圖3是7天MTT濃度-抑制率曲線圖,圖中1 一天,2 二天,3三天,4四天,5五天,6六天,7七天。圖4是7天化學發光時間-抑制率曲線圖。圖5是對照組透射電鏡圖。圖6是對照組透射電鏡圖。圖7是24小時組透射電鏡圖。圖8是24小時組透射電鏡圖。圖9是48小時組透射電鏡圖。圖10是48小時組透射電鏡圖。圖11是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結果對照I組圖。圖12是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結果對照2組圖。圖13是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結果對照3組圖。圖14是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結果0%組圖。圖15是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結果5%組圖。圖16是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結果9%組圖。圖17是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結果13%組圖。圖18是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結果17%組圖。圖19是H1299細胞凋亡流式細胞儀檢測結果20%組圖。 圖20是早期+晚期凋亡細胞與劑量關係圖。圖21是晚期凋亡和壞死細胞與劑量關係圖。
具體實施例方式實施例1甘露醇抗腫瘤的基礎實驗研究(肺癌)I實驗材料1.1 材料1.1.1細胞株SPC-A-1人肺癌細胞系引自上海腫瘤研究所。1.1. 2試劑RPMI1640、胰蛋白酶購自Gibcol BRL公司;新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;碳酸氫鈉(分析純)為河北磁州製藥廠生產;青黴素鈉和硫酸鏈黴素為哈藥集團製藥總廠生產;噻唑藍(MTT)、二甲基亞碸(DMSO)為Sigma公司產品;ATP試劑盒(ATP提取液、螢光素-螢光酶、稀釋液等)為德國DCS公司產品;檸檬酸鈉為廣州化學試劑廠生產;碘化丙啶(PI)、RnaseA為Sigma公司產品;甘露醇注射液購自廣西南寧百會藥業集團有限公司。1.1. 3器材C02培養箱(日本HERAEUS);倒置顯微鏡(日本NIKON);全自動酶標儀(芬蘭DENLEY DRAGON MK-2型);自發光板式分析儀(德國BETH0LD);流式細胞儀(美國BECKMAN);透射電鏡。
2實驗方法及觀察指標2.1細胞培養5%C02培養箱,用含10%新生牛血清,青黴素、鏈黴素各IX 105U/L及NaHCO3調PH值至7. 2-7. 4的RPMI1640培養基培養,收集對數生長期細胞進行實驗。2. 2採用MTT法測定細胞抑制率將濃度為2X 104/ml的細胞懸液接種於96孔細胞培養板中,每孔體積100 μ L。細胞貼壁後,分別加入1-150 μ g/μ I濃度的甘露醇,對照組不加藥,只加相應體積的培養基,同時設復孔,37°C、5%C02條件下培養48小時後,每孔加入20 μ I ΜΤΤ,繼續培養4小時,加入100 μ I DMS0,振蕩混勻,用全自動酶標儀比色,492nm波長處測定各孔的吸光度A值,計算平均值,並按下列公式計算細胞生長抑制率細胞生長抑制率(%)=(對照組A-實驗組A)/對照組A X 100% ;同方法取20、40、60、80、100、120 μ g/μ I濃度的甘露醇,對照組不加藥,只加相應體積的培養基,同時設復孔,分別培養7天,計算出每天不同濃度的抑制率。2. 3採用化學發光法測定細胞抑制率將濃度為2 X 104/ml的細胞懸液接種於96孔細胞培養板中,每孔體積100 μ I。細胞貼壁後,加入48小時MTT結果中半數抑制濃度(IC50)的甘露醇,對照組不加藥,只加相應體積的培養基,同時設復孔,37°C、5%C02條件下培養1、2、3、4、5、6、7天,每孔加入5(^1八了?提取液,充分混勻,每孔吸出100 μ I混合液加入另一個96孔板相應的孔中,新板的每孔中加入20 μ I螢光素-螢光酶,振蕩混勻,用自發光板式分析儀檢測每孔的值,然後計算平均值,並按下列公式計算細胞生長抑制率細胞生長抑制率(%)=(對照組-實驗組)/ (對照組-空白組)X 100%。2. 4流式細胞儀分析細胞周期2. 4.1PI染液的配製高精度天平上精確稱取PI5mg、RnaSeA10mg、枸櫞酸鈉O.1g,溶解於IOOml滅菌生理鹽水中。精確吸取NP-400. 3ml加入上液中,搖勻,4°C下避光保存。2. 4. 2流式細胞儀分析細胞周期方法收集培養細胞,於PBS中洗兩次,然後按(1-2) X IO6/ml加入70%冰乙醇並混勻,於4°C下固定過夜。檢測時標本以1000r/min離5min, 3mlPBS重懸5min,以300目篩網過濾細胞懸液以除去粘連成團的細胞群,再於1000r/min下離心5min,棄去上清液,加入PI染液Iml/管,4°C下避光30min。取48小時MTT結果中的半數抑制濃度(IC5tl),分為24、48小時兩組和對照組,共三組,用流式細胞儀進行細胞周期分析,收集數據,在MultiCycle分析軟體進行細胞周期的分析,分別計算G1'S、G2/M期的相對比例。2. 5透射電鏡檢測收集培養細胞,少量PBS混懸後移入塑料錐形離心管中,在1000-1500r/min離心5_10min,棄去上清液,加入新生牛血清1_2滴,然後用吸管吹散離心物使其混合,離心3-5min後,儘量吸棄上層多餘的新生牛血清;沿管壁緩慢加入戊二醛固定液,4°C下預固定30min,用細針沿管壁在標本周圍輕輕劃一圈,使固定液充分滲入底部,並繼續固定至少2小時,取48小時MTT結果中的半數抑制濃度(IC5tl),分為24、48小時兩組和對照組,共三組,按常規電鏡包埋步驟處理。2. 6統計學處理所有數據採用SPSS10. O軟體進行統計處理,計量資料的比較採用t檢驗,計數資料的比較採用X2檢驗。3實驗結果3.1採用MTT法測定細胞抑制率結果顯示 48小時內,在1-150 μ g/μ I濃度範圍時甘露醇可抑制肺癌細胞的增殖活性,其抑制作用隨濃度的增高而增強,7天內,隨著濃度和時間的增長,抑制率也不斷增加。見圖1、2、3。3. 2採用化學發光法測定細胞抑制率結果顯示取48小時MTT結果中的半數抑制濃度(IC5tl)時,作用7天,甘露醇可抑制肺癌細胞的增殖活性,並且抑制作用隨時間的延長而增強,見圖4。3. 3流式細胞儀分析細胞周期結果顯示取48小時MTT結果中的半數抑制濃度(IC50)時,作用24、48、72小時組細胞周期停止在G2+M期的較對照組明顯增多,見表I。表I甘露醇不同處理時間對細胞周期的影響
權利要求
1.甘露醇在製備抗胃癌藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用,其特徵在於所述藥物為甘露醇注射液。
3.根據權利要求2所述的應用,其特徵在於所述甘露醇注射液的質量濃度為10% 19%。
4..根據權利要求3所述的應用,其特徵在於所述甘露醇注射液的質量濃度為13% 17%。
全文摘要
本發明公開了甘露醇在製備抗胃癌藥物中的應用,特別是使用特定濃度(10%~19%)的甘露醇注射液治療胃癌。傳統上甘露醇僅作為利尿劑、高滲透降壓藥等,發明人通過科學實驗發現甘露醇具有抗腫瘤活性,通過採用多項細胞凋亡檢測技術及檢測凋亡相關基因bc1-2、bax,證實特定濃度甘露醇可誘導人多種癌細胞株明顯癌細胞凋亡,並掌握了與濃度、時間的效應關係,初步闡明其可能機理,而且,發明人已將研究結果用於腫瘤病人治療並取得明顯的療效,這些為甘露醇在製備抗腫瘤藥物中的應用及其臨床推廣提供了理論依據和實際病例。
文檔編號A61P35/00GK103006623SQ20121059056
公開日2013年4月3日 申請日期2011年4月18日 優先權日2011年4月18日
發明者黃鼎銘, 劉德森, 黎樂群, 黃亞銘, 張力圖, 曹驥, 黃其春, 吳軍, 嶽惠芬, 李黃羿, 潘琪, 黎斌, 楊立, 黃亞芬, 茅乃權, 左傳田, 謝彤, 潘泓, 黃耀元, 歐超, 梁新強, 崔英 申請人:廣西壯族自治區腫瘤防治研究所