一種純化重組人白細胞介素12的方法
2023-05-20 15:30:16 4
專利名稱：一種純化重組人白細胞介素12的方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質純化方法，特別是指一種純化重組人白細胞介素12的方法。
背景技術：
白細胞介素12(Interleukin-12，IL-12)，又稱細胞毒性淋巴成熟因子(cytotoxiclymphocyte maturation factor，CLMF)或稱自然殺傷細胞刺激因子(natural killer cell stimulation factor，NKSF)，是一種人體的重要細胞因子。它具有廣泛的免疫效應；如促進自然殺傷細胞(naturekiller，NK)和T細胞的增值及殺傷作用，促使細胞因子的分泌，誘導抗原特異性輔助性T細胞(helper Tcell TH)向Th1分化。IL-12是一種具有多種免疫調節功能的細胞因子。它作為一種功能性橋梁連接於早期的非特異性先天性免疫與後期抗原特異性的適應性免疫之間，在感染、腫瘤、自體免疫性疫病中起重要作用。目前被廣泛運用於治療肝炎、腫瘤、結核和風溼等重大疾病的研究。
1989年，美國學者Kobayashi ML(J.Exp.Med.170；827)首次從經佛波醇脂(PDBU)刺激的EB病毒轉化的人B淋巴母細胞株(RPMI8866)培養上清中純化出人IL-12，後定名為IL-12。機體中主要分泌IL-12的是抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)，如單核巨噬細胞，樹突狀細胞，B細胞。IL-12是一種糖蛋白，由p40和p35兩個亞單位經一對二硫鍵連接組成。其重鏈p40由306個胺基酸組成，分子量為34699Da，包含10個半胱胺基酸殘基(3對分子內二硫鍵和1個分子間二硫鍵)和4個可能的N-端糖基化位點；輕鏈p35由197個胺基酸組成，分子量為22513Da，包含7個半胱胺基酸殘基(2對分子內二硫鍵和1個分子間二硫鍵)和3個可能的N-端糖基化位點。(Ueli Gubler.et al.proc Natl.Acad.sci USA 884143，1991；ChristinaYoon.et al.the EMBO journal 193530，2000)。經最新質譜測定，rhIL-12分子量為60013Da，其中含有18個糖基。p40在IL-12與受體結合時起關鍵作用，當兩者的cDNA共轉染時，才能得到有生物學活性的IL-12。IL-12在原核細胞中難以表達出活性形式，因此，IL-12的真核表達，就成為體外獲得IL-12從而對其深入理論和臨床研究的唯一途徑。目前已有多個專利涉及重組白細胞介素12的表達方法，僅中國專利就有CN01126923.5、CN00113786.7、CN01133631.5、CN03131567.4、CN02100866.3、CN01133658.7。
從細胞培養物中通過各種分離手段得到純品的下遊加工工程，是基因工程產品生產過程中非常重要的一環，目前國內外也有相關的專利涉及重組人白介素12的純化方法。如美國專利US5853714利用四個柱層析和一次超濾工藝進行純化，但分子篩層析所用的介質S-200 Sephacryl HighResolution孔徑太大，分離效果不理想。又如美國專利US6830751提到的純化方法包括三個柱層析，它是在專利US5853714的基礎上做了進一步的改進；中國專利CN200410080518.7包括三個柱層析和一次超濾工藝，該專利從離子交換層析圖譜中看出雜蛋白峰比較高，影響離子交換劑的使用壽命，並且所用的洗脫液與平衡液種類繁多，整個過程顯得很繁瑣，難於工業應用。因此，建立簡便，快速，廉價而有效且穩定性很好的有工業化可行性的rhIL-12純化工藝是當前急待解決的難題。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種簡便、快速、成本低的純化重組人白細胞介素12的方法。
本發明的技術方案是這樣的一種純化重組人白細胞介素12的方法，依次包括下述步驟(1)rhIL-12細胞培養上清液過濾；(2)對步驟(1)所得rhIL-12收集液進行陽離子交換層析；(3)對步驟(2)所得rhIL-12收集液進行硫酸銨沉澱；(4)對步驟(3)所得rhIL-12收集液進行陰離子交換層析；(5)對步驟(4)所得rhIL-12收集液進行分子篩層析，在進行硫酸銨沉澱時所用硫酸銨的pH值遠離rhIL-12的等電點。
本發明的技術方案也可以是這樣的一種純化重組人白細胞介素12的方法，依次包括下述步驟(1)rhIL-12細胞培養上清液過濾；(2)對步驟(1)所得rhIL-12收集液進行陰離子交換層析；(3)對步驟(2)所得rhIL-12收集液進行硫酸銨沉澱；(4)對步驟(3)所得rhIL-12收集液進行陽離子交換層析；(5)對步驟(4)所得rhIL-12收集液進行分子篩層析，在進行硫酸銨沉澱時所用硫酸銨的pH值遠離rhIL-12的等電點。
上述的一種純化重組人白細胞介素12的方法中，在步驟(4)之前還對步驟(3)所得到的rhIL-12收集液進行疏水層析，可進一步提高純化效果。
上述的一種純化重組人白細胞介素12的方法中，在進行硫酸銨沉澱時，是在rhIL-12收集液中加入1～10倍體積的1～5M的(NH4)2SO4溶液，混勻，4℃靜置10～60min，待其充分沉澱後，15000rpm離心60min，去沉澱，rhIL-12在上清液體中。
上述的一種純化重組人白細胞介素12的方法中，在第一次離子交換層析時進行了鹽離子濃度階段洗脫，使目標蛋白與雜蛋白在不同的洗脫峰中分開。在採取離子交換層析方法時，應先調節細胞培養上清的離子強度，控制離子強度在適當的範圍之內，方法是在進行離子交換層析之前對細胞培養上清進行2～10倍體積的稀釋。
本發明中所用的陽離子交換介質可選擇的範圍很廣，例如SPSepharose HP、SP Sepharose FF、S Sepharose FF、SP Sepharose XL、SP Sepharose Big Beads、CM Sepharose FF、Capto MMC、Capto S、CM SephadexC50、SP Sephadex C50或Mono S等。進行陽離子交換層析的方法是先用平衡緩衝液10～35mM PBS，pH6.0～7.5洗脫到基線，然後採用階段洗脫的方法，用含0～1M NaCl的10～35mM PBS，pH6.0～7.5進行階段洗脫，收集目的蛋白峰。
本發明所選用的陰離子交換介質可選擇的範圍也是很廣的，例如Souce 30Q、Q Sepharose HP、Q Sepharose FF、Capto Q、Q Sepharose XL、DEAE Sepharose FF、DEAE Sephadex A25、ANX Sepharose FF、Souce Q、Mono Q或Q Sepharose Big Beads等。進行陰離子交換層析的方法是先用10～48mM Tris-Cl，pH7.5～8.5洗脫至基線，然後採用階段洗脫的方法，用含0～1M NaCl的20～50mM Tris-Cl，pH7.5～8.5進行階段洗脫，收集目的蛋白峰。
本發明中所述的分子篩層析，可以去除分子大小差異明顯的rhIL-12聚體等雜質，能進一步提高rhIL-12的純度，常用的分子篩層析介質有Sephacryl S-100 High Resolution、Sephacry S200 HR、Sephadex G200、Sephadex G100、Superdex 75 prep grade、Bio-gel P100或Superose 12 preograde；所述分子篩層析所用洗脫劑為10～40mM PBS，pH6.5～8.0。
本發明的疏水層析介質可選用Phenyl Sepharose High Performance或者Phenyl Sepharose Fast Flow(High Sub)疏水層析洗脫收集的方法是先用平衡緩衝液20～50mM Tris-Cl，0.6～2.5M硫酸銨，pH7.0～8.5洗脫至基線，然後用階段洗脫的方法洗脫，用含0.6～2.5M鹽離子的20～50mMTris-Cl，pH7.0～8.5進行階段洗脫，收集目的蛋白峰。
由於rhIL-12培養上清中含有較多且比較複雜的雜蛋白，本發明的純化方法其精妙之處是用價格低廉的硫酸銨採取簡單的沉澱方法，除去大部分雜蛋白，使以後的純化更簡便有效，最終可以得到純度在98.7％以上的rhIL-12蛋白，並且整個純化工藝的回收率在54％以上；對所得到純品經質譜MALDI-TOF分子量檢測與理論相符合；其質譜肽圖、N端胺基酸序列與理論值也完全符合；SDS-PAGE電泳、免疫印跡結果與標準品一致；經PBMCIFN-γ誘生法檢測活性，比活在5.5×106IU/mg以上；經固相斑點雜交法檢測外源性DNA殘留量在10pg/ug以下；符合國家生物製品規範的要求，能用於動物實驗和臨床試驗；本發明具有分離純化成本低、操作簡便、周期短、回收率和純度高等優點，特別適合於工業化生產。
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步地詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。
圖1為陽離子交換層析洗脫圖；圖2為硫酸銨沉澱效果的SDS-PAGE電泳圖；圖3為疏水層析洗脫圖；圖4為陰離子交換層析洗脫圖；圖5為分子篩層析洗脫圖；圖6為經純化的rhIL-12的HPLC-SEC圖；圖7為經純化的rhIL-12的MALDI-TOF分子量檢測的質譜圖；圖8為經純化的rhIL-12的SDS-PAGE電泳和免疫印跡圖。
具體實施例方式
實施例1rhIL-12的純化1、樣品過濾細胞培養上清以0.45μm微孔濾膜過濾去除雜質，濾液以10mM PB，pH＝6.0進行4倍稀釋備用。
2、陽離子柱層析對rhIL-12的純化選用SP Sepharose High Performance陽離子交換柱，用2～3個柱體積平衡緩衝液(20mM PB，pH6.0)平衡，待色譜柱平衡充分後將步驟1所得的稀釋液上樣，上樣結束後用平衡緩衝液流洗色譜柱，直至A280達到基線或穩定至基線附近；用洗脫液I(20mM PB，0.30M NaCl，pH6.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰I，並充分流洗色譜柱至基線平穩；繼續用洗脫液II(20mM PB，0.60M NaCl，pH6.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰II，並充分流洗色譜柱至基線平穩；最後用洗脫液III(20mM PB，1M NaCl，pH6.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰III，並充分流洗色譜柱至基線平穩；色譜柱使用完畢後以0.2M NaOH、去離子水流洗2倍柱體積使柱再生，並以20％乙醇浸泡色譜柱長期保存。整個層析過程的洗脫圖如圖1所示，圖中A峰洗脫液I的洗脫峰；B峰洗脫液II的洗脫峰；C峰洗脫液III的洗脫峰。rhIL-12在B峰，其它峰是雜蛋白。
3、硫酸銨沉澱配置4M的(NH4)2SO4溶液，氨水調pH至8.0，在步驟2所得含rhIL-12的收集液中加入5倍體積的4M、pH8.0的(NH4)2SO4溶液，混勻，4℃靜置60min，待其充分沉澱後，4℃、15000rpm離心30min，去沉澱，上清液備用。對沉澱效果進行SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖2所示，圖中A為硫酸銨沉澱前，B為硫酸銨沉澱後，M為蛋白分子量標準。
4、疏水柱層析對rhIL-12的純化選用Phenyl Sepharose High performance疏水層析柱，用2～3個柱體積平衡緩衝液(20mM Tris-Cl，2M(NH4)2SO4，pH8.5)平衡，待色譜柱平衡充分後將步驟3所得含rhIL-12的上清液上樣，上樣結束後用平衡緩衝液流洗色譜柱，直至A280達到基線或穩定至基線附近；用洗脫液I(20mM Tris-Cl，1M(NH4)2SO4，pH8.5)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰I，並充分流洗色譜柱至基線平穩；繼續用洗脫液II(20mM Tris-Cl，0.5M(NH4)2SO4，pH8.5)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰II，並充分流洗色譜柱至基線平穩；最後用洗脫液III(20mM Tris-Cl，pH8.5)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰III，並充分流洗色譜柱至基線平穩；色譜柱使用完畢後以0.2M NaOH、去離子水分別流洗2倍柱體積使柱再生，並以20％乙醇浸泡色譜柱長期保存。整個層析過程的洗脫圖如圖3所示，圖中A峰洗脫液I的洗脫峰；B峰洗脫液II的洗脫峰；C峰洗脫液III的洗脫峰。rhIL-12在B峰，其它峰是雜蛋白。
5、陰離子柱層析對rhIL-12的純化選用SOURCE 30Q陰離子交換柱，用2～3個柱體積平衡緩衝液(20mMTris-Cl，pH8.5)平衡，待色譜柱平衡充分後將步驟4所得含rhIL-12的收集液用平衡緩衝液體積比1∶10稀釋後上樣，上樣結束後用平衡緩衝液流洗色譜柱，直至A280達到基線或穩定至基線附近；用洗脫液I(20mMTris-Cl，0.15M NaCl，pH8.5)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰I，並充分流洗色譜柱至基線平穩；繼續用洗脫液II(20mM Tris-Cl，0.25M NaCl，pH8.5)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰II，並充分流洗色譜柱至基線平穩；最後用洗脫液III(20mM Tris-Cl，1M NaCl，pH8.5)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰III，並充分流洗色譜柱至基線平穩；色譜柱使用完畢後以0.2M NaOH流洗2倍柱體積，去離子水洗至pH＜8.0後，以20％乙醇浸泡色譜柱長期保存。整個層析過程的洗脫圖如圖4所示，通過硫酸銨沉澱後，陰離子交換層析時雜蛋白的峰明顯減少。圖中A峰洗脫液I的洗脫峰；B峰洗脫液II的洗脫峰；C峰洗脫液III的洗脫峰。rhIL-12在B峰，其它峰是雜蛋白。
6、分子篩層析對rhIL-12的進一步純化將步驟5所得含rhIL-12的收集液用Sephacryl S-100 HR柱進行進一步純化。先用200mL 0.2M NaOH流洗凝膠柱，再用平衡緩衝液(120mM NaCl，20mM PB，pH7.0)柱平衡1.5～2個柱體積後上樣，單次上樣量為柱體積的3％～5％，上樣結束後繼續以緩衝體系進行流洗，分別收集色譜峰。其洗脫圖如圖5所示，圖中A峰是rhIL-12聚體和大分子雜蛋白；B峰是rhIL-12峰，C峰是雜蛋白。
實施例2純化rhIL-121、樣品過濾細胞培養上清以0.45μm微孔濾膜過濾去除雜質，濾液以10mMTris-Cl，pH8.0進行4倍稀釋備用。
2、陰離子柱層析對rhIL-12的純化選用DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，用平衡緩衝液(20mMTris-Cl，pH8.0)平衡2～3個柱體積，待色譜柱平衡充分後將步驟1所得含rhIL-12的稀釋液上樣，上樣結束後用平衡緩衝液流洗色譜柱，直至A280達到基線或穩定至基線附近；用洗脫液I(20mM Tris-Cl，0.15M NaCl，pH8.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰I，並充分流洗色譜柱至基線平穩；繼續用洗脫液II(20mM Tris-Cl，0.28M NaCl，pH8.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰II，並充分流洗色譜柱至基線平穩；最後用洗脫液III(20mM Tris-Cl，1M NaCl，pH8.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰III，並充分流洗色譜柱至基線平穩；收集含rhIL-12的組分。色譜柱使用完畢後分別以0.2M NaOH、去離子水流洗2倍柱體積使柱再生，以20％乙醇浸泡色譜柱長期保存。
3、硫酸銨沉澱沉澱分離方法與實施例1的步驟3相同。
4、疏水柱層析對rhIL-12的純化選用Phenyl Sepharose Fast Flow(High Sub)疏水層析柱，用平衡緩衝液(20mM Tris-Cl，2M (NH4)2SO4，pH8.5)平衡2～3個柱體積，待色譜柱平衡充分後將步驟3所得含rhIL-12的上清液上樣，上樣結束後用平衡緩衝液流洗色譜柱，直至A280達到基線或穩定至基線附近；用洗脫液I(20M Tris-Cl，1M (NH4)2SO4，pH8.5)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰I，並充分流洗色譜柱至基線平穩；繼續用洗脫液II(20mM Tris-Cl，0.5M(NH4)2SO4，pH8.5)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰II，並充分流洗色譜柱至基線平穩；最後用洗脫液III(20mM Tris-Cl，pH8.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰III，並充分流洗色譜柱至基線平穩；色譜柱使用完畢後分別以0.2M NaOH、去離子水流洗2倍柱體積使柱再生，以20％乙醇浸泡色譜柱長期保存。
5、陽離子柱層析對rhIL-12的純化選用CM Sepharose Fast Flow陽離子交換柱，用平衡緩衝液(20mM PB，pH6.0)平衡2～3個柱體積，待色譜柱平衡充分後將步驟4所得含rhIL-12的收集液用平衡緩衝液10倍體積稀釋後上樣，上樣結束後用平衡緩衝液流洗色譜柱，直至A280達到基線或穩定至基線附近；用洗脫液I(20mM PB，0.30M NaCl，pH6.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰I，並充分流洗色譜柱至基線平穩；繼續用洗脫液II(20mM PB，0.65M NaCl，pH6.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰II，並充分流洗色譜柱至基線平穩；最後用洗脫液III(20mM PB，1M NaCl，pH6.O)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰III，並充分流洗色譜柱至基線平穩；色譜柱使用完畢後分別以0.2M NaOH、去離子水流洗2倍柱體積使柱再生，以20％乙醇浸泡色譜柱長期保存。
6、分子篩(尺寸排阻層析)對rhIL-12的進一步純化將步驟5所得含rhIL-12的收集液用Superdex 75 prep grade柱進行進一步純化。先用200mL 0.2M NaOH流洗凝膠柱，再用平衡緩衝液(120mMNaCl，20mM PB，pH7.4)柱平衡1.5～2個柱體積後上樣，單次上樣量為柱體積的3％～5％，上樣結束後繼續以緩衝體系進行流洗，收集含rhIL-12的色譜峰。
實施例3純化rhIL-12
1、樣品過濾細胞培養上清以0.45μm微孔濾膜過濾去除雜質，濾液以10mM PB，pH＝6.5進行4倍稀釋備用。
2、陽離子柱層析對rhIL-12的純化選用Capto S陽離子交換柱，用平衡緩衝液(20mM PB，pH6.5)平衡2～3個柱體積，待色譜柱平衡充分後將步驟1所得的稀釋液上樣，上樣結束後用平衡緩衝液流洗色譜柱，直至A280達到基線或穩定至基線附近；用洗脫液I(20mM PB，0.40M NaCl，pH6.5)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰I，並充分流洗色譜柱至基線平穩；繼續用洗脫液II(20mM PB，0.70MNaCl，pH6.5)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰II，並充分流洗色譜柱至基線平穩；最後用洗脫液III(20mM PB，1M NaCl，pH6.5)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰III，收集含rhIL-12的組分。色譜柱使用完畢後分別以0.2M NaOH、去離子水流洗2倍柱體積使柱再生，以20％乙醇浸泡色譜柱長期保存。
3、硫酸銨沉澱沉澱分離方法與實施例1的步驟3相同。
4、陰離子柱層析對rhIL-12的純化選用Q Sepharose Fast Flow陰離子交換柱，用平衡緩衝液(20mMTris-Cl，pH8.0)平衡2～3個柱體積，待色譜柱平衡充分後將步驟3所得含rhIL-12的上清液用平衡緩衝液10倍體積稀釋後上樣，上樣結束後用平衡緩衝液流洗色譜柱，直至A280達到基線或穩定至基線附近；用洗脫液I(20mM Tris-Cl，0.15M NaCl，pH8.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰I，並充分流洗色譜柱至基線平穩；繼續用洗脫液II(20mM Tris-Cl，0.30MNaCl，pH8.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰II，並充分流洗色譜柱至基線平穩；最後用洗脫液III(20mM Tris-Cl，1M NaCl，pH8.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰III，並充分流洗色譜柱至基線平穩；收集含rhIL-12的組分。色譜柱使用完畢後分別以0.2M NaOH、去離子水流洗2倍柱體積使柱再生，以20％乙醇浸泡色譜柱長期保存。
5、分子篩(尺寸排阻層析)對rhIL-12的進一步純化將步驟4所得含rhIL-12的收集液用Sephacryl S-100 HR柱進行進一步純化，純化方法與實施例1的步驟6相同。
實施例4純化rhIL-12
1、樣品過濾處理方法與實施例2的步驟1相同。
2、陰離子柱層析對rhIL-12的純化選用Capto Q陰離子交換柱，用2～3個柱體積平衡緩衝液(20mMTris-Cl，pH8.5)平衡，待色譜柱平衡充分後將步驟1所得含rhIL-12的稀釋液上樣，上樣結束後用平衡緩衝液流洗色譜柱，直至A280達到基線或穩定至基線附近；用洗脫液I(20mM Tris-Cl，0.15M NaCl，pH8.5)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰I，並充分流洗色譜柱至基線平穩；繼續用洗脫液II(20mM Tris-Cl，0.25M NaCl，pH8.5)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰II，並充分流洗色譜柱至基線平穩；最後用洗脫液III(20mM Tris-Cl，1M NaCl，pH8.5)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰III，並充分流洗色譜柱至基線平穩；色譜柱使用完畢後分別以0.2M NaOH、去離子水流洗2倍柱體積使柱再生，以20％乙醇浸泡色譜柱長期保存。
3、硫酸銨分級分離沉澱分離方法與實施例1的步驟3相同。
4、陽離子柱層析對rhIL-12的純化選用CM Sepharose Fast Flow陽離子交換柱，用平衡緩衝液(20mM PB，pH6.0)平衡2～3個柱體積，待色譜柱平衡充分後將步驟3所得含rhIL-12的上清液用平衡緩衝液10倍體積稀釋後上樣，上樣結束後用平衡緩衝液流洗色譜柱，直至A280達到基線或穩定至基線附近；用洗脫液I(20mM PB，0.20M NaCl，pH6.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰I，並充分流洗色譜柱至基線平穩；繼續用洗脫液II(20mM PB，0.55M NaCl，pH6.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰II，並充分流洗色譜柱至基線平穩；最後用洗脫液III(20mM PB，1M NaCl，pH6.0)對色譜柱進行流洗，收集洗脫峰III，並充分流洗色譜柱至基線平穩；色譜柱使用完畢後分別以0.2M NaOH、去離子水流洗2倍柱體積使柱再生，以20％乙醇浸泡色譜柱長期保存。
5、分子篩(尺寸排阻層析)對rhIL-12的進一步純化將步驟4所得含rhIL-12的收集液用Superdex 75 prep grade柱進行進一步純化，純化方法與實施例2的步驟6相同。
實施例5HPLC-SEC檢測純化的rhIL-12純度1.儀器選用Waters HPLC系統，色譜柱(Ultrahydrogel 500，7.8×300mm)。
2.流動相200mM NaCl，25mM Na2HPO4(pH＝9.4)。
3.色譜條件流速0.6～1mL/min，上樣量100μL，柱溫20～25℃，紫外檢測波長280nm，樣品池溫度4℃，環境溫度2～25℃。
4.測定用流動相以0.8mL/min流速平衡Waters HPLC系統至基線平衡。取待測樣品100μL上柱，用流動相以0.6mL/min流速洗脫，同時在紫外檢測器280nm波長下記錄色譜圖及有關數據，記錄數據時間為40min，用面積歸一法計算純度。
5.結果實施例1所純化的rhIL-12的純度達到98.8％。(其色譜圖如圖6示)；實施例2所純化的rhIL-12的純度達到98.4％，實施例3所純化的rhIL-12的純度達到98.0％；實施例4所純化的rhIL-12的純度達到97.5％。
實施例6rhIL-12生物活性檢測(PBMC IFN-γ誘生法)1.NIBSC標準品(WHO國際標準品)和純化rhIL-12的稀釋標準品和經準確定量的純化rhIL-12用RMPI 1640基礎培養液稀釋成以下濃度8ng/mL、4ng/mL、2ng/ml、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.125ng/mL、0.0625ng/mL待用。
2.分離PBMC細胞抽取靜脈血5mL，肝素抗凝，Hank液等量混勻，取5mlFicoll淋巴細胞分離液置於15mL刻度離心管中，將稀釋的血液沿管壁緩緩疊加於分離液上，形成清晰的界面，置水平離心機中，2000r/min離心20min，用滴管直接吸出單個核細胞層置於另一刻度離心管中，加入4倍量以上的Hank液，充分混勻，1000r/min離心10min，傾去上清液，再用Hank液洗兩次，用含10％滅活胎牛血清的RMPI 1640基礎培養液配製細胞懸液，計數細胞，同時用臺盼蘭檢測細胞活力，要求細胞活力＞95％以上，每孔加入100uL細胞懸液及相應稀釋濃度標準品和純化rhIL-12至96孔培養板，空白對照組加RMPI 1640基礎培養液，陽性對照組加抗人CD3，終濃度(0.2ug/mL)，每個稀釋度做兩個復孔。
3.37℃，5％CO2，培養48小時。
4.收集細胞培養上清液每孔50ul，離心處理後ELISA(按BD公司試劑盒說明書操作)測定IFN-γ含量。
5.結果計算用MULTISKAN MK3酶標儀(Thermo公司)450nm測定各孔吸光度，Ascent software version2.6軟體曲線定量計算IFN-γ含量。用標準品各稀釋度體外刺激PBMCs IFN-γ產生量與純化rhIL-12對應稀釋度IFN-γ產生量對比。(t檢驗P＞0.05，兩樣品間無顯著性差異)。(或以IFN-γ含量對樣品濃度作圖，計算各實驗樣品的ED50(即IFN-γ含量為最大濃度的一半時的樣品濃度)，按公式待測樣品效價＝標準品效價×(標準品的ED50/實驗樣品的ED50)。
6.結果實施例1所純化的rhIL-12的比活為8.1×106IU/mg；實施例2所純化的rhIL-12的比活為7.5×106IU/mg；實施例3所純化的rhIL-12的比活為6.4×106IU/mg；實施例4所純化的rhIL-12的比活為7.8×106IU/mg。
對所純化的rhIL-12純品，經質譜MALDI-TOF分子量檢測，結果如圖7所示，與理論相符合。
對所純化的rhIL-12純品，經SDS-PAGE電泳、免疫印跡實驗，結果見圖8所示，與標準品一致。
權利要求
1.一種純化重組人白細胞介素12的方法，其特徵是依次包括下述步驟(1)rhIL-12細胞培養上清液過濾；(2)對步驟(1)所得rhIL-12收集液進行陽離子交換層析；(3)對步驟(2)所得rhIL-12收集液進行硫酸銨沉澱；(4)對步驟(3)所得rhIL-12收集液進行陰離子交換層析；(5)對步驟(4)所得rhIL-12收集液進行分子篩層析，在進行硫酸銨沉澱時所用硫酸銨的pH值遠離rhIL-12的等電點。
2.一種純化重組人白細胞介素12的方法，其特徵是依次包括下述步驟(1)rhIL-12細胞培養上清液過濾；(2)對步驟(1)所得rhIL-12收集液進行陰離子交換層析；(3)對步驟(2)所得rhIL-12收集液進行硫酸銨沉澱；(4)對步驟(3)所得rhIL-12收集液進行陽離子交換層析；(5)對步驟(4)所得rhIL-12收集液進行分子篩層析，在進行硫酸銨沉澱時所用硫酸銨的pH值遠離rhIL-12的等電點。
3.根據權利要求1或2所述的一種純化重組人白細胞介素12的方法，其特徵是步驟(4)之前還對步驟(3)所得到的rhIL-12收集液進行疏水層析。
4.根據權利要求1或2所述的一種純化重組人白細胞介素12的方法，其特徵是步驟(2)中對rhIL-12收集液進行2～10倍體積的稀釋。
5.根據權利要求1或2所述的一種純化重組人白細胞介素12的方法，其特徵是所述的硫酸銨沉澱是在rhIL-12收集液中加入1～10倍體積的1～5M的(NH4)2SO4溶液，混勻，4℃靜置10～60min，待其充分沉澱後，15000rpm離心60min，去沉澱，rhIL-12在上清液體中。
6.根據權利要求1或2所述的一種純化重組人白細胞介素12的方法，其特徵是所述的陽離子交換層析的交換介質為SP Sepharose HP、SP Sepharose FF、S Sepharose FF、SPSepharose XL、SP Sepharose Big Beads、CM Sepharose FF、Capto MMC、Capto S、CM Sephadex C50、SP Sephadex C50或Mono S，陽離子交換層析的方法是先用平衡緩衝液10～35mM PBS，pH6.0～7.5洗脫到基線，然後採用階段洗脫的方法，用含0～1M NaCl的10～35mM PBS，pH6.0～7.5進行階段洗脫，收集目的蛋白峰。
7.根據權利要求1或2所述的一種純化重組人白細胞介素12的方法，其特徵是所述的陰離子層析的交換介質為Souce 30Q、Q Sepharose HP、Q Sepharose FF、Capto Q、QSepharose XL、DEAE Sepharose FF、DEAE Sephadex A25、ANX Sepharose FF、Souce Q、Mono Q或Q Sepharose Big Beads，陰離子交換層析的方法是先用10～48mM Tris-Cl，pH7.5～8.5洗脫至基線，然後採用階段洗脫的方法，用含0～1M NaCl的20～50mM Tris-Cl，pH7.5～8.5進行階段洗脫，收集目的蛋白峰。
8.根據權利要求1或2所述的一種純化重組人白細胞介素12的方法，其特徵是所述的分子篩層析介質為SephacrylS-100 High Resolution、Sephacry S200 HR、Sephadex G200、Sephadex G100、Superdex 75 prep grade、Bio-gel P100或Superose 12 preo grade，分子篩層析所用洗脫劑為10～40mM PBS，pH 6.5～8.0。
9.根據權利要求3所述的一種純化重組人白細胞介素12的方法，其特徵是所述的疏水層析介質用henyl SepharoseHigh Performance或者Phenyl Sepharose Fast Flow(HighSub)，疏水層析洗脫收集的方法是先用平衡緩衝液20～50mM Tris-Cl，0.6～2.5M硫酸銨，pH7.0～8.5，洗脫至基線，然後用階段洗脫的方法洗脫，用含0.6～2.5M鹽離子的20～50mM Tris-Cl，pH7.0～8.5進行階段洗脫，收集目的蛋白峰。
全文摘要
本發明公開了一種純化重組人白細胞介素12的方法，屬蛋白質純化技術領域，技術要點是將rhIL－12的細胞培養上清液經過濾、陽離子或陰離子交換層析、硫酸銨沉澱、陰離子或陽離子交換層析和分子篩層析，進行硫酸銨沉澱時pH遠離rhIL－12的等電點，本發明的方法中利用硫酸銨沉澱去除大部分的雜蛋白，使以後的分離更簡便有效；本發明具有分離純化成本低、操作簡便、周期短、回收率和純度高等優點，特別適合於工業化生產。
文檔編號C07K14/435GK101033254SQ20071002686
公開日2007年9月12日 申請日期2007年2月9日 優先權日2007年2月9日
發明者蒲勤, 李毅, 趙峰, 楊愈豐, 吳思紋, 葉倩君, 夏書奇, 曾振飛, 王翠玲, 郭凱旋, 粟寬源, 曾水娣, 於源, 邱向南, 張宜俊 申請人:廣州市愷泰生物科技有限公司