小麥低分子量麥谷蛋白亞基的聚丙烯醯胺凝膠電泳方法
2023-05-21 00:10:16
專利名稱：小麥低分子量麥谷蛋白亞基的聚丙烯醯胺凝膠電泳方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及小麥麥谷蛋白亞基的分離方法，特別涉及小麥低分子量麥谷蛋白亞基的聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，。
背景技術：
小麥麥谷蛋白亞基是小麥的一類重要的儲藏蛋白。研究表明，亞基的組成對小麥麵粉的加工品質和營養品質有重要影響，不同亞基和亞基組合對加工品質的影響或貢獻大小不同。麥谷蛋白亞基按分子量大小分為高分子量谷蛋白亞基和低分子量谷蛋白亞基。兩類亞基對品質的貢獻，早先研究認為高分子量亞基的貢獻較大。經過進一步研究認為低分子量亞基對品質，尤其是加工品質有相當貢獻。對蛋白亞基的分離是研究亞基和亞基對品質作用的基礎，也可利用麥谷蛋白亞基對小麥種質資源進行分類研究。
聚丙烯醯胺凝膠電泳技術，經過國內外研究者的創立和改良，目前是應用最為廣泛的分離麥谷蛋白亞基的技術，在分離構成多採用β巰基乙醇來打破二硫鍵，解聚蛋白質。在我國，對麥谷蛋白亞基的研究多集中於對高分子量亞基的電泳分離和研究，主要原因之一在於低分子量麥谷蛋白亞基難以分離或分離不清。因此要進一步擴大我國在蛋白亞基、品質、品質育種等方面的成就，必須在研究高分子量麥谷蛋白亞基的同時，注意對低分子量谷蛋白亞基的研究，分析其對品質的影響和其與高分子量亞基之間的相互作用。這就意味著必須要改良現有凝膠電泳技術體系，建立一種簡單，高效的能清晰分離低分子量谷蛋白亞基的凝膠電泳技術。
發明內容
本發明的目的在於，對常用的蛋白凝膠電泳方法的基礎上進行改進，提供一種小麥低分子量麥谷蛋白亞基的聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，該方法簡單，高效，能夠清晰的單向一步分離低分子量麥谷蛋白亞基。
為了實現上述任務，本發明採取如下的技術解決方案1.一種小麥麥谷蛋白亞基低分子量的聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，其特徵在於，具體包括下列步驟1)小麥麥谷蛋白亞基的提取與處理首先將種子研壓破碎成粉末；然後使用體積分數50％異丙醇，去除醇溶蛋白和沉澱蛋白後加入樣品緩衝液50ul，該樣品緩衝液含有24％甘油，8％十二烷基硫酸鈉，0.012％溴酚蘭的0.125MTris-Hcl，緩衝液的pH值為6.8，35℃～40℃水浴1h備用；2)單向一步分離高、低分子量谷蛋白亞基電泳A.採用電泳儀進行垂直板聚丙烯醯胺凝膠電泳，壓條封邊後，將交聯度2.6％的10％pH8.8丙烯醯氨分離膠灌至膠板的4/5處，立即用蒸餾水或無水乙醇封頂，凝膠半小時以上；B.棄去封頂水或無水乙醇，用4％交聯度1.3％的PH為6.8的丙烯醯氨濃縮膠灌滿膠板，插入長城齒梳子，凝膠半小時以上；C.用Tris-甘氨酸電極緩衝液，其中含0.3％Tris，0.1％SDS，0.4M甘氨酸，pH值為8.3，在20mA恆壓電泳11h-12h。
3)脫色用G250考馬斯亮蘭染色3h，清水脫色24h，即可清晰分離出低分子量麥谷蛋白亞基。
本發明的方法，去除了小麥高、低分子量麥谷蛋白中醇溶蛋白對分離效果的幹擾，並且樣品緩衝液中不使用有臭味的β巰基乙醇；丙烯醯胺凝膠分離膠使用交連度為2.6％的10％丙烯醯胺凝膠，降低分子篩孔度，一步同時分離高、低分子量亞基，達到了更好的分離效果；電極緩衝液採用0.4M甘氨酸，增大了緩衝液電泳的離子效應，配合凝膠清晰的分離出低分子量麥谷蛋白亞基；使用清水脫色即可，節約藥品成本。
圖1是採用本發明清晰分離的低分子量麥谷蛋白亞基圖片。
具體實施例方式
本發明參考了朱金寶和Morel等提出的聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，並對其中部分作了調整和改進，其主要步驟是1.小麥麥谷蛋白亞基的提取1)切取1/3種子放入1.5ml離心管，將其研壓破碎成粉末。
2)在粉末中加入120ul體積分數50％異丙醇，60℃水浴30min，10000rpm離心10分鐘，棄去上清，重複一次，去除醇溶蛋白對分離條帶特別是D、B、C區的幹擾。
3)加入160ul含0.3％二硫蘇糖醇的50％異丙醇，60℃水浴30min。加入等體積含1.4％4-己烯基吡啶的50％異丙醇溶液，60℃水浴30min，10000rpm離心10分鐘，小心移取200ul上清液於另一試管。
4)在試管中加入上清液4倍體積的丙酮，在35℃-40℃水浴30min，10000rpm離心10分鐘，棄去上清。
5)加入含有24％甘油，8％十二烷基硫酸鈉，0.012％溴酚蘭的0.125MTris-Hcl樣品緩衝液(PH6.8)50ul，35℃-40℃水浴1h備用。
2.單向一步分離高、低分子量谷蛋白亞基電泳1)採用北京六一儀器廠生產的ECP三恆電泳儀進行垂直板聚丙烯醯胺凝膠電泳，壓條封邊後，將交聯度2.6％的10％pH8.8丙烯醯氨分離膠灌至膠板的4/5處，立即用蒸餾水或無水乙醇封頂，凝膠半小時以上。
2)棄去封頂水或無水乙醇，用4％交聯度1.3％的pH6.8丙烯醯氨濃縮膠灌滿膠板，插入長城齒梳子，凝膠半小時以上。
3)用Tris-甘氨酸電極緩衝液(含0.3％Tris，0.1％SDS，0.4M甘氨酸，PH8.3)在20mA恆壓電泳11-12h(指示線剛剛遷移出凝膠)。
3.脫色用G250考馬斯亮蘭染色3h，清水脫色24h即可分離出低分子量麥谷蛋白亞基(如圖1所示)。
本發明的方法與改進前的技術的不同之處參見下表
權利要求
1.一種低分子量小麥麥谷蛋白亞基的聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，其特徵在於，包括如下步驟1)小麥麥谷蛋白亞基的提取與處理首先將1/3種子研壓破碎成粉末；然後使用體積分數50％異丙醇，去除醇溶蛋白和沉澱蛋白後加入緩衝液50ul，該緩衝液中含有24％的甘油，8％的十二烷基硫酸鈉，0.012％溴酚蘭的0.125MTris-Hcl，緩衝液的pH值為6.8，35℃～40℃水浴1h備用；2)單向一步分離高、低分子量谷蛋白亞基電泳A.採用電泳儀進行垂直板聚丙烯醯胺凝膠電泳，壓條封邊後，將交聯度2.6％的10％pH8.8丙烯醯氨分離膠灌至膠板的4/5處，立即用蒸餾水或無水乙醇封頂，凝膠半小時以上；B.棄去封頂水或無水乙醇，用4％交聯度1.3％的PH為6.8的丙烯醯氨濃縮膠灌滿膠板，插入長城齒梳子，凝膠半小時以上；C.用Tris-甘氨酸電極緩衝液，其中含0.3％Tris，0.1％SDS，0.4M甘氨酸，pH值為8.3，在20mA恆壓電泳11-12h。3)脫色用G250考馬斯亮蘭染色3h，清水脫色24h，即可清晰分離出低分子量麥谷蛋白亞基。
全文摘要
本發明公開了一種小麥麥谷蛋白亞基低分子量的聚丙烯醯胺凝膠電泳方法，該方法對常用的蛋白凝膠電泳方法的基礎上進行改進，去除了小麥高、低分子量麥谷蛋白中醇溶蛋白對分離效果的幹擾，並且樣品緩衝液中不使用有臭味的β巰基乙醇；丙烯醯胺凝膠分離膠使用交連度為2.6％的10％丙烯醯胺凝膠，降低分子篩孔度，一步同時分離高、低分子量亞基，達到了更好的分離效果；電極緩衝液採用0.4M甘氨酸，增大了緩衝液電泳的離子效應，配合凝膠清晰的分離出低分子量麥谷蛋白亞基；使用清水脫色即可，節約藥品成本。該方法簡單，高效，能夠清晰的單向一步分離低分子量麥谷蛋白亞基。
文檔編號C07K14/415GK1876675SQ200610042829
公開日2006年12月13日 申請日期2006年5月18日 優先權日2006年5月18日
發明者張宏, 吉萬全, 王長有, 王秋英, 任志龍, 王亞娟, 蔡東明 申請人:西北農林科技大學