一種用於系統性紅斑狼瘡的早期診斷的檢測試劑盒的製作方法
2023-05-21 02:16:16 2
一種用於系統性紅斑狼瘡的早期診斷的檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種通過檢測人CR2基因5』UTR區rs3813946和第10外顯子上rs17615和rs104897三個SNP位點突變SNP位點的試劑盒。該試劑盒可以應用在對系統性紅斑狼瘡（SLE）的早期診斷中，從分子水平上通過對患者基因型組合的檢測，實現對SLE的提早判別。本發明所提供的方法為測序基因分型法，準確率高達99.9%，易於廣泛使用和推廣。
【專利說明】一種用於系統性紅斑狼瘡的早期診斷的檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬於分子生物學領域，涉及一種用於系統性紅斑狼瘡的早期診斷的檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種自身免疫介導的，以免疫性炎症為突出表現的瀰漫性結締組織病，累及全身多系統、多器官、臨床表現複雜、病程遷延反覆的自身免疫性疾病。本病多發於生育年齡女性，我國約有一百萬患者，並有逐年增加趨勢，平均患病率更是高居全球第二位。
[0003]然而，系統性紅斑狼瘡的臨床誤診率相當高，這主要因為系統性紅斑狼瘡是由於遺傳、感染、性激素及環境等多因素相互作用引起機體免疫紊亂所致，病因則迄今未明。雖然美國風溼病協會(ARA)在1997年頒布了 11項分類標準，這也是目前臨床診斷最常用的手段；免疫膠體金檢測抗雙鏈DNA法在一定程度上也能有效的幫助確診SLE。但這類診斷方法多適用於典型或活動期的系統性紅斑狼瘡的診斷，對早期、不典型或非活動期的患者則不適用，因為早期患者臨床表現通常不典型，症狀也無特異性，尤其是單系統受累患者更加難以診斷。這也是造成誤診和漏診的一個主要原因。
[0004]誤診除了會給患者造成健康和經濟上的雙重負擔，最主要的是會延誤病情，增加死亡的危險。據統計，在SLE患者中，首發症狀以關節疼痛維多，約佔40%，而近1/4的誤診為類風溼性關節炎，臨床上平均35%的患者會並發腫瘤。然而，早期就接受正規系統治療的患者10年以上的存活率卻可達75%。由此可見，早期診斷，早期治療對SLE患者的康復尤為重要。
[0005]建立一種簡單快捷準確的早期檢測方法，有助於幫組醫生及時篩查出系統性紅斑狼瘡，避免因為誤診導致病人的病情惡化。
[0006]SNP (single nucleotide polymorphism),單核苷酸多態性位點，也被稱為第三代遺傳標記。在位於基因5』端非翻譯區和基因編碼區(外顯子)內的SNP，往往會引起蛋白質含量變化及功能異常，進而導致生物體性狀變異，在遺傳研究和疾病分子機制研究中具有重要意義，也越來越多的被作為各種疾病的分子診斷標記。
[0007]近年來，研究人員通過比較SLE患者和健康人群的基因組，發現並確認了 CR2基因功能異常與SLE的發生機制顯著相關。含有特異CR2突變位點的人群發生SLE的機率更是顯著升高160%。
[0008]CR2基因是Complement receptor 2的簡寫，中文名稱前列腺幹細胞抗原。該基因位於人第I號常染色體第32帶區。由19個外顯子組成，編碼一個B細胞表面的糖蛋白，是人體自身免疫系統的重要調節因子。大量的研究證明，SLE病者體內都伴隨著CR2蛋白水平的顯著下降。2007年，Wuet.al.首次在來自258個高加索家庭和142個中國家庭的1416名SLE患者中發現了位於CR2基因5』 UTR上的rs3813946突變可改變CR2基因的轉錄水平，而位於第10外顯子上的rsl7615和rsl048971則通過改變蛋白序列影響CR2的特異結合功能。這個發現分別在2009和2012年在2084例歐洲和美洲的SLE患者中得到驗證。CR2基因上的rsl7615, rsl048971和rs3813946三個SNP位點可以作為SLE的早期檢測指標。
[0009]
【發明內容】
[0010]CR2基因上的rsl7615, rsl048971和rs3813946三個SNP位點的組合可以用來作為SLE早期診斷的輔助手段，降低誤診率。
[0011]本發明提供一種用於檢測CR2基因上的rsl7615，rsl048971和rs3813946三個SNP突變位點的檢測試劑盒，包括:
(1)檢測CR2基因上rsl7615和rsl048971突變位點的特異性引物；
(2)檢測CR2基因上rs3813946突變位點的特異性引物；
(3)PCR擴增反應試劑(包括Taq酶，dNTP混合液，反應緩衝液，無菌去離子水)；
(4)DNA測序反應試劑(包括BigDye mix, EDTA溶液，100%乙醇，70%乙醇，HIDI溶液，無菌去離子水)；
本發明試劑盒的組分和含量包括:
(1)PCR反應體系:10mM 的 dNTP 混合液 2μ I ；5U/y I 的 Taq DNA 聚合酶 1μ I ；TaqBuffer 10 μ I,特異引物各I μ I ；25mM的MgCl2 10 μ I ;無菌去離子水73 μ I ;
(2)測序反應體系:25%的BigDyemix I μ I ；DNA測序引物I μ I ；125mM的EDTA溶液I μ I ；100%乙醇溶液15 μ I ；70%乙醇溶液30 μ I ；HIDI溶液10 μ I;無菌去離子水10 μ I ;
(3)本試劑盒可用於一個樣本的檢測，試劑盒的保存溫度為-20°C。
[0012](4)根據檢測結果確定樣品中是否存rsl7615，rsl048971和rs3813946三個SNP位點的突變，根據組合結果給出臨床指導意見。
[0013]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1: rsl048971位點測序圖譜，測序結果為:CCTGCTCCCCT【G/A】TGTAAACTT,圖中106號位為基因型的判斷區。
[0015]圖2: rsl7615位點測序圖譜，測序結果為:AAGGGCA【G/A】TAGTCAGA,圖中246號位為基因型的判斷區。
[0016]圖3: rs3813946位點測序圖譜，測序結果為:TGGGAGGGCA【G/A】GGCTGGAGCA,圖中79號位為基因型的判斷區。
[0017]
【具體實施方式】
[0018]本發明的【具體實施方式】僅對本發明的內容做進一步的解釋和說明，並不對本發明的應用範圍進行限制。實例中未註明具體條件的實驗方法，或按照製造廠商所建議的條件。
[0019]實施例1.檢測試劑盒的使用 1.提取樣品DNA
清潔口腔，使用消毒刮片刮取受檢測者口腔黏膜，以採集上皮細胞，用酚氯法提取基因組 DNA。
[0020]2.PCR擴展反應
使用試劑盒中的PCR反應試劑，其中含有下列引物對:
(1)CR2 (rsl7615)正向引物:SEQ NOl CR2 (rsl7615)反向引物:SEQ N02
(2)CR2 (rs3813946)正向引物:SEQ N03 CR2 (rs3813946)反向引物:SEQ N04
PCR擴增反應體系為:10XPCR反應緩衝液10 μ I ；10mM的dNTP混合液2 μ I ；5U/ μ I的Taq DNA聚合酶I μ I ;特異引物各I μ I ;無菌去離子水73 μ I
PCR反應程序:95攝氏度3分鐘預變性，94攝氏度30秒變性，降溫至55攝氏度35秒退火，再升溫至72攝氏度40秒進行延伸，保持72攝氏度5分鐘進行延伸修復；以上循環35次。4攝氏度保溫。
[0021]3.PCR產物純化
使用生工SK1141PCR純化試劑盒回收PCR產物。
[0022]4.DNA測序反應
使用試劑盒中的測序反應試劑，包含下列測序引物:
(1)CR2 (rsl7615)測序引物:SEQ N05
(2)CR2 (rs3813946)測序引物:SEQ N06
反應總體積20 μ I,包含PCR純化產物I μ I (純度0D260/0D280在1.6至2.0之間)，25%的BigDye mix 8 μ I; 3.2uM DNA測序引物I μ I;無菌去離子水10 μ I。
[0023]在ΑΒΙ2720型PCR擴增儀上進行反應，反應條件為96攝氏度I分鐘後進行25次下列條件循環:
96攝氏度10秒，降溫至55攝氏度5秒，升溫至60度4分鐘。
[0024]反應結束後加入125mMde EDTA溶液2 μ I ；2μ I的3Μ NaAc, 100%乙醇溶液50 μ I ；震蕩4次,在室溫下沉澱15分鐘。然後在4攝氏度下使用臺式離心機12000rpm/min的轉速離心30分鐘，馬上用槍吸盡上清液。再加入70 μ L 70%酒精，4攝氏度12000rpm/min離心15 min，馬上用槍吸盡上清液。此步可以重複I次。讓酒精在室溫揮發乾淨，加入10 μ IH1-Di Formamide 溶解 DNA。
[0025]最後在PCR儀上變性:95攝氏度4 min，4攝氏度4 min。上機電泳。
[0026]5.結果分析
將測序結果序列與CR2基因5』 UTR部分標準序列SEQ N07進行比較，確定CR2基因rs3813946位點的基因型。
[0027]其中R是檢測突變位點，R代表該位點可能出現的鹼基為G或者A。
[0028]將測序結果序列與CR2基因和第10外顯子的部分標準序列SEQ N08進行比較，確定CR2基因rsl7615和rsl048971位點的基因型。
[0029]其中R是檢測突變位點，R代表該位點可能出現的鹼基為G或者A。
[0030]實施例2.為患者提供系統性紅斑狼瘡分子診斷服務 1.採樣及提取基因組
由醫院檢驗科醫生使用人唾液提取試劑盒從受檢者的口腔中提取上皮細胞樣本，並提取 DNA。
[0031]2.基因型檢測
通過實施例1中所述的使用方法使用本發明提供的試劑盒，得到受檢者CR2基因中含有rsl7615、rsl048971和rs3813946位點的DNA序列，確定位點的基因型。
[0032]3.判斷患者是否患有或後期發展成系統性紅斑狼瘡的可能性
通過受檢者的基因型，出具受檢者患系統性紅斑狼瘡的診斷報告。報告中詳細說明受檢者CR2基因上rsl7615、rsl048971和rs3813946位點的檢測結果和突變類型，並根據已知臨床統計結果計算並出具評估結果。
[0033]患者突變型為G/G (圖1)，表明rsl048971位點無基因座特異突變；
患者突變型為G/G (圖2)，表明rsl7615位點無基因座特異突變；
患者突變型為A/A (圖3)，表明rs3813946位點無基因座特異突變；
綜合上述結果確定患者已經患有系統性紅斑狼瘡的可能性極低。
【權利要求】
1.一種用於系統性紅斑狼瘡的早期診斷的檢測試劑盒，其特徵在於:同時檢測人CR2基因5，UTR區rs3813946和第10外顯子上rsl7615和rsl04897三個SNP位點。
2.包含如下引物: 擴展引物: rsl7615-F 正向引物:5』 TGGAACCACGGTCACTTACA 3』 rsl7615-R 反向引物:5』 TGGGTGGGAGATAATAAACAAG 3』 rs3813946-F 正向引物:5』 GAGCCAAGAAAACCCCGAG 3』 rs3813946-R 反向引物:5』 TGTAGTGGGTTGCGTGGTCA 3』 測序引物: rsl7615-F 正向引物:5』 TGGAACCACGGTCACTTACA 3』 rs3813946-F 反向引物:5』 GAGCCAAGAAAACCCCGAG 3』 根據權利要求1所述的試劑盒檢測人CR2基因5』 UTR區和第10外顯子突變的方法，包括如下步驟: (1)樣本DNA提取； (2)使用權力要求I所示試劑盒中的擴增引物(SEQNOl, SEQ N02, SEQ N03, SEQ N04)對目的基因片段進行PCR擴增； (3)對步驟(2)所得PCR產物進行純化處理； (4)將步驟(3)所得的純化產物進行測序； (5)結果分析。
3.根據權利要求2所述的檢測人CR2基因5』UTR區和第10外顯子突變的方法，其特徵在 於，PCR反應體系:10mM的dNTP混合液2μ I ；5U/y I的Taq DNA聚合酶I μ I ；TaqBuffer 10 μ I,特異引物各I μ I ；25mM的MgCl2 10 μ I ;無菌去離子水73 μ I ; 根據權利要求3所述的檢測人CR2基因5』 UTR區和第10外顯子突變的方法，其特徵在於， 所述的PCR擴增條件為94?96°C 3分鐘預變性；92?94°C 30秒變性、55?600C 35秒退火，72°C40秒延伸，72°C5分鐘延伸修復；重複30?35個循環；最後37°C保溫。
4.檢測人CR2基因5』UTR區和第10外顯子突變的試劑盒在系統性紅斑狼瘡診斷中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104293901SQ201310305641
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月19日 優先權日:2013年7月19日
【發明者】劉驍 申請人:金弗康生物科技(上海)有限公司