一種聯合治療腫瘤的基因藥物及其應用的製作方法

2023-05-20 23:06:46 1

專利名稱：一種聯合治療腫瘤的基因藥物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因治療領域，具體涉及一種聯合治療腫瘤的基因藥物及其應用。
背景技術：
腫瘤的快速增殖和惡性轉移得益於腫瘤新生血管的生成增加以及腫瘤細胞的凋亡減少等多種因素的影響。針對各種因素相應通路中的關鍵基因或靶標蛋白正越來越多被科學家們研究並成功應用於臨床。但是，在大多數情況下，機體對腫瘤治療的反應是無效和微弱的。其主要原因在於惡性腫瘤的發生發展是一個長期的、多階段的、多基因改變累積的過程，腫瘤在與機體的對抗和選擇過程中受多種信號通路的影響，單一的改變某一個基因或某一條信號通路往往難於取得令人滿意的效果。因此，通過同時調控腫瘤中多條信號通路的多個基因來研究抑制腫瘤生長增殖情況，對於明確腫瘤的發生和發展以及開展合理的治療方案均有著重要的意義。 近年來，對新生血管生成與腫瘤生長、侵襲及轉移等的關係進行了深入研究，腫瘤血管新生對於腫瘤的生長、轉移具有重要作用。Pepper (Arterioscler ThrombVascBiol. 1997，17(4) :605)的研究表明，實體瘤的生長、發展可分為血管前期和血管化期。在腫瘤形成的早期，瘤體內並無血管生成，此為血管前期。這時的腫瘤生長依靠氧、營養物質的彌散來維持，腫瘤直徑一般僅能長到2-3mm。此期的腫瘤細胞增殖和凋亡處於平衡狀態，生長緩慢，可持續多年，相當於臨床上的原位癌，幾乎不發生轉移。腫瘤的進一步生長有賴於隨後的腫瘤血管生成的啟動,促使腫瘤形成新生血管,進入血管化期。此期腫瘤組織主要以血流灌注的方式獲取營養，腫瘤細胞呈指數生長且凋亡減少，腫瘤細胞的增殖和凋亡平衡被破壞，導致腫瘤生長加速。內皮抑素(Endostatin)由膠原蛋白X VDI的羧基末端非膠原區內的184個胺基酸構成，其分子量為20KD。Endostatin對體外內皮細胞具有明顯的增殖抑制活性，體內亦可特異性地抑制內皮細胞增殖和新生血管的生成，從而抑制腫瘤生長。Endostatin發揮抑瘤作用的特點有①對腫瘤血管內皮細胞增殖有選擇性抑制作用；②對生長靜止的內皮細胞無作用；③抑制腫瘤有量效依賴關係；④對不同類型的腫瘤的抑瘤率相近無耐藥傾向、無不良反應。腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-indueingligand, TRAIL)是腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor, TNF)超家族的成員之一。它能選擇性誘導腫瘤細胞凋亡，對大多數正常細胞無殺傷作用。TRAIL可通過與細胞膜上的死亡受體結合而激活凋亡信號通路，最終導致腫瘤細胞的凋亡。與其他TNF家族成員相比，TRAIL抗腫瘤活性強，對正常細胞幾乎無毒性，因此受到人們的廣泛關注。腫瘤基因治療的迅速發展使其成為除放療、化療和手術治療之外的第四種腫瘤治療模式。在眾多的基因治療載體中，應用腺病毒作為基因治療的載體最為廣泛，已經報導的1000多種基因治療的臨床方案中，約26%的基因治療方案是用腺病毒作為載體。與其他病毒載體相比，腺病毒載體具有許多獨特的優點，表現在①腺病毒顆粒相對穩定，病毒基因組重排頻率低，外源基因插入片段在病毒複製幾個周期後仍可保持不變，易於重組DNA技術操作；②安全性較好，腺病毒無需整合進宿主細胞基因組中，目的基因在宿主細胞基因組外游離狀態下表達，整合突變致癌可能性小，基因毒性低；③腺病毒基因組較大(36kb)，絕大多數基因組(約35kb)均能被外源基因取代，插入大片段外源性基因的潛力大有較大的宿主範圍，可以感染肝細胞、血管內皮等多種人體細胞，對於受體細胞是否處於分裂期要求不嚴格腺病毒載體容易將外源基因直接轉移到靶細胞中，並有效表達成活性蛋白。以上一些優勢使得腺病毒成為應用最為廣泛的基因治療載體。

發明內容
本發明的目的是提供一種聯合治療腫瘤的基因藥物及其應用本發明提供的用於預防和/或治療腫瘤的組合物，其為如下1)-3)中的任意一種I)含有Endostatin蛋白編碼基因的重組病毒和含有TRAIL蛋白編碼基因的重組 病毒組成的組合物；2)由Endostatin蛋白和TRAIL蛋白組成的組合物；3)含有Endostatin蛋白編碼基因的重組載體和含有TRAIL蛋白編碼基因的重組載體組成的組合物。上述組合中，所述Endostatin蛋白為人源Endostatin蛋白；所述TRAIL蛋白為人源TRAIL蛋白。上述組合中，所述人源Endostatin蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列3 ;所述人源Endostatin蛋白編碼基因的核苷酸序列具體為序列表中的序列I或序列表中序列I自5』末端1003-1540位核苷酸或序列表中序列I自5』末端942-1540位核苷酸；所述人源TRAIL蛋白的氣基酸序列為序列表中的序列4 ;所述人源TRAIL蛋白編碼基因的核苷酸序列具體為序列表中的序列2或序列表中序列2自5』末端1003-1497位核苷酸或序列表中序列2自5』末端942-1497位核苷酸。上述組合中，所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組載體為含有Endostatin蛋白編碼基因的重組腺病毒載體或重組穿梭載體；所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組病毒為將所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組腺病毒載體線性化後轉染HEK293細胞，包裝得到含有Endostatin蛋白編碼基因的重組病毒；所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組載體為含有TRAIL蛋白編碼基因的重組腺病毒載體或重組穿梭載體；所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組病毒為將所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組腺病毒載體線性化後轉染HEK293細胞，包裝得到含有TRAIL蛋白編碼基因的重組病毒。上述組合中，所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組腺病毒載體為將所述Endostatin蛋白編碼基因插入腺病毒載體,得到表達Endostatin蛋白的載體；在本發明的實施例中，含有Endostatin蛋白編碼基因的重組腺病毒載體具體為將序列表中的序列I插入pAdeno-X的PI-SceI和I-Ceu I酶切位點間得到的載體；上述腺病毒載體選自Adeasy-I、pAdeno-X、Ad truck、AdMax、RAPAd載體系統中的任意一種，優選pAdeno-X腺病毒表達載體。
所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組穿梭載體為將所述Endostatin蛋白編碼基因插入穿梭載體，得到表達Endostatin蛋白的載體；在本發明的實施例中，上述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組穿梭載體為將序列表中序列I自5』末端942-1540位核苷酸插入pShuttle2載體的Xba I和Kpn I酶切位點間得到的載體；所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組腺病毒載體為將所述TRAIL蛋白編碼基因插入腺病毒載體，得到表達TRAIL蛋白的載體；在本發明的實施例中，含有TRAIL蛋白編碼基因的重組腺病毒載體具體為將序列表中的序列2插入pAdeno-X的PI-SceI和I-Ceu I酶切位點間得到的載體；
所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組穿梭載體為將所述TRAIL蛋白編碼基因插入穿梭載體，得到表達TRAIL蛋白的載體。在本發明的實施例中，上述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組穿梭載體為將序列表中序列2自5』末端942-1497位核苷酸插入pShuttle2載體的Xba I和Kpn I酶切位點間得到的載體；上述組合中，所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組病毒和所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組病毒的病毒顆粒數比為(1-3):1 ;所述Endostatin蛋白編碼基因的重組病毒和所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組病毒的病毒顆粒數比具體為1:1。上述組合物中的含有Endostat in蛋白編碼基因的重組病毒和含有TRAIL蛋白編碼基因的重組病毒的病毒顆粒數具體均為I X IO9至大約1X1011。上述的組合物在如下I) -6)中至少一種的應用也是本發明保護的範圍I)製備預防和/或治療腫瘤產品；2)製備抑制腫瘤細胞增殖產品；3)製備抑制腫瘤血管生成產品；4)製備促進腫瘤細胞凋亡產品；5)製備減小腫瘤體積和/或重量產品；6)製備抑制⑶31血管內皮抗原表達。上述抑制⑶31血管內皮抗原表達通過降低⑶31陽性細胞數體現。上述應用中，所述腫瘤為肝癌、宮頸癌、乳腺癌和/或肺癌；所述腫瘤細胞為肝癌細胞，所述肝癌細胞具體為HepG2細胞。上述應用中,所述產品為藥物或疫苗。如下I) -4)中任--種物質也是本發明保護的範圍I)上述的組合物中所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組載體；2)上述的組合物中所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組載體；3)上述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組病毒；4)上述的組合物中所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組病毒。Endostatin蛋白由人膠原蛋白X VDI C端184個胺基酸殘基和IL2信號肽組成，其胺基酸序列為序列表中的序列3 ;TRAIL蛋白由人TRAIL全長基因的第114至281位包含167個胺基酸殘基序列所組成，其胺基酸序列為序列表中的序列4。序列I中自5』末端第942-1002位核苷酸為信號肽，從1003-1540位核苷酸為endostatin基因；序列2中自5』末端第942-1002位核苷酸為信號肽，從1003-1497位核苷酸為TRAIL基因。本發明的實驗證明，本發明是基於Endostatin優良的抗腫瘤血管生成作用和TRAIL特異性誘導腫瘤細胞凋亡的功能的基礎上，構建獲得重組Endostatin(Ad-Endostatin)和TRAIL (Ad-TRAIL)的腺病毒，採用按比例混合的重組Endostatin和TRAIL腺病毒聯合基因治療實現對腫瘤生長的有效控制；且二者聯合作用效果遠遠大於單獨一種的作用效果，達到腫瘤血管生成抑制的同時促進腫瘤細胞的凋亡的雙層作用；是一類新型的腫瘤基因治療藥物，在腫瘤治療中具有廣闊的應用前景。具體來說，本發明的聯合藥物具有如下優點(I)聯合藥物兼具了抑制腫瘤新生血管生成和選擇性促進腫瘤細胞凋亡的優點，可通過不同的途徑抑制腫瘤的生長，有廣闊的應用前景；(2)該聯合藥物為重組腺病毒，具有較好生物安全性，對環境無害，有廣闊的發展前景；(3)重組腺病毒藥物生產高效且成本低廉，方法簡單快捷，適用於大規模工業化生產；
(4)本發明還提供具體的藥物使用方法,可通過調節Ad-Endostatin和Ad-TRAIL腺病毒的比例，可對不同腫瘤類型、腫瘤不同的生長階段的腫瘤進行有效控制，實現對肝癌、宮頸癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤的有效治療。


圖I 為 Xba I 和 Kpn I 雙酶切鑑定pShuttle2_Endostatin(左)和 pShuttle2_TRAIL(右)重組質粒電泳圖。圖2為PI-SceI/1-Ceu I雙酶切鑑定Ad-Endostat in和Ad-TRAIL重組病毒質粒電泳圖。圖3為Western blot檢測Ad-TRAIL和Ad-Endostatin重組病毒的蛋白表達。圖4為Ad-TRAIL和Ad-Endostatin重組病毒對腫瘤細胞和內皮細胞增殖抑制效率的檢測。圖5為聯合Ad-TRAIL和Ad-Endostatin基因治療人肝細胞肝癌的效果圖。圖6為聯合Ad-TRAIL和Ad-Endostatin基因治療抑制腫瘤血管生成效果圖。圖7為聯合Ad-TRAIL和Ad-Endostatin基因治療促進腫瘤細胞凋亡效果圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中定量試驗均為重複三次，結果取平均值。下述實施例中Endostatin蛋白由人膠原蛋白X VDI C端184個胺基酸殘基和IL2信號肽組成，其胺基酸序列為序列表中的序列3 ;TRAIL蛋白由人TRAIL全長基因的第114至281位包含167個胺基酸殘基序列所組成，其胺基酸序列為序列表中的序列4。序列I中自5』末端第942-1002位核苷酸為信號肽，從1003-1540位核苷酸為endostatin 基因；序列2中自5』末端第942-1002位核苷酸為信號肽，從1003-1497位核苷酸為TRAIL基因；序列5中自5』末端第942-1002位核苷酸為信號肽，從1003-1665位核苷酸為EGFP基因。實施例I、重組腺病毒的製備I、Endostatin基因和TRAIL基因的擴增根據人Endostatin基因和人TRAIL基因分別設計特異性引物，擴增Endostatin基因的引物序列如下上遊引物5』 -GCTCTAGAGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTC-3』 (XbaI)，下遊引物
5， -GGGGTACCTTACTTGGAGGCAGTCATG-3』 (KpnI)，擴增TRAIL基因的引物序列如下上遊引物5』 -GCTCTAGAGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTC-3』 (Xba I)，下遊引物5，-GGGGTACCTTAGCCAACTAAAAAGGCCC-3，(Kpn I)，以攜帶Endostatin基因(也可以以序列表中序列I為模板)和TRAIL基因(也可以以序列表中序列2為模板)的T載體為模板，利用上述引物分別進行PCR擴增，得到621bp的Endostatin基因擴增產物(具有序列表中序列I自5』末端第942-1540位所示的核苷酸，編碼的蛋白Endostatin的胺基酸序列為序列表中的序列3)和578bpTRAIL基因擴增產物(具有序列表中序列2自5』末端第942-1497為核苷酸，編碼的蛋白TRAIL的胺基酸序列為序列表中的序列4)。2、重組穿梭載體的構建將上述擴增產物分別經XbaI和Kpn I酶切後，分別連接到用同樣酶酶切的穿梭載體 pShuttle2 (Clontech Laboratories, Inc. Cat. No. 631513)中，得到重組穿梭質粒pShuttle2_Endostatin 和 pShuttle2_TRAIL ；用XbaI 和 Kpn I 分別酶切 pShuttle2_Endostatin 和 pShuttle2_TRAIL,結果如圖I所示，左圖為pShuttle2_Endostatin (pShuttle-E)雙酶切鑑定圖，右圖為pShuttle2-TRAIL (pShuttle-T)雙酶切鑑定圖；V代表未酶切的重組質粒；從圖中看出，pShuttle2_Endostatin (pShuttle-E)雙酶切後得到約 621bp 的片段；pShuttle2_TRAIL(pShuttle-T)雙酶切後得到約578bp的片段，表明質粒構建成功。將酶切鑑定正確的pShuttle2_Endostatin和pShuttle2_TRAIL送去測序,結果如下pShuttle2-Endostatin為將序列表中的序列I自5』末端第942-1540位所示的核苷酸插入pShuttle2載體的Xba I和Kpn I酶切位點間得到的載體；pShuttle2-Endostatin為將序列表中序列2自5』末端第942-1497為核苷酸插入pShuttle2載體的Xba I和Kpn I酶切位點間得到的載體。3、重組腺病毒載體構建用PI-SceI和I-Ceu I雙酶切對pShuttle2_Endostatin質粒進行雙酶切,得到約1700bp的包含Endostatin基因的片段(序列I)。用PI-SceI和I-Ceu I雙酶切對pShuttle2_TRAIL質粒進行雙酶切，得到約1700bp的包含TRAIL基因的片段(序列2)。
將上述約1700bp的包含Endostatin基因的片段與經過PI-SceI和I-Ceu I雙酶切的 pAdeno-X 腺病毒載體(Clontech Laboratories, Inc. Cat. No. 631513)連接，得到重組腺病毒載體Ad-E ；將上述約1700bp的包含TRAIL基因的片段與經過PI-SceI和I-Ceu I雙酶切的pAdeno-X腺病毒載體連接，得到重組腺病毒載體Ad_T。將重組腺病毒載體Ad-E和Ad-T分別用PI-SceI/1-Ceu I雙酶切，結果如圖2所示，V為未酶切的質粒Ad-E ;從圖中看出，Ad-E雙酶切後得到約1700bp的片段;Ad_T雙酶切後得到約1700bp的片段，表明質粒構建成功。將重組腺病毒載體Ad-E送去測序，結果為該質粒將序列表中的序列I插入pAdeno-X腺病毒載體的PI-SceI和I-Ceu I酶切位點間得到的載體。將重組腺病毒載體Ad-T送去測序，結果為該質粒將序列表中的序列2插入pAdeno-X腺病毒載體的PI-SceI和I-Ceu I酶切位點間得到的載體。將Pac I酶切線性化重組腺病毒載體Ad_E轉染HEK293細胞(中國科學院上海細胞生物研究所，目錄號GNHu I)進行病毒包裝、擴增、純化(方法參照Clontech公司Adeno-X Expression System I 用戶指南)，得到重組腺病毒 Ad-Endostatin ;將Pac I酶切線性化重組腺病毒載體Ad_T轉染HEK293細胞(中國科學院上海細胞生物資源中心，目錄號=GNHu I)進行病毒包裝、擴增、純化(方法參照Clontech公司Adeno-X Expression System I 用戶指南)，得到重組腺病毒 Ad-TRAIL。對照載體pAdeno-XDNA-EGFP，為將含有EGFP的編碼基因的片段(序列表中序列5插入)pAdeno-X腺病毒載體的PI-SceI和I-Ceu I酶切位點間得到的載體。 採用同樣的方法將Pac I酶切線性化pAdeno-XDNA-EGFP轉染HEK293細胞進行病毒包裝、擴增、純化，得到重組腺病毒Ad-EGFP。4、重組腺病毒Ad-Endostatin和重組腺病毒Ad-TRAIL的蛋白表達將人臍靜脈內皮細胞(HUVEC，上海博晗生物科技有限公司，目錄號=HUVEC-OOI)種植於六孔板中培養(培養基為人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)完全培養液，上海博晗生物科技有限公司，目錄號MD-001)過夜，待細胞長至80%細胞融合率時，分別使用10或50M0I的重組腺病毒Ad-Endostatin感染HUVEC細胞I小時後，用2ml新鮮培養基替換病毒液，繼續培養48小時，收集培養基，用超濾管濃縮後用Western blot進行檢測(一抗為小鼠抗人Endostatin單克隆抗體，Santa Cruz生物技術公司，目錄號sc_101478 ;二抗為HRP標記的兔抗小鼠IgG，杭州華安生物技術有限公司，貨號HA1008)。以重組腺病毒Ad-EGFP為對照(control)ο將人肝細胞肝癌細胞(!fepG2，中國科學院上海細胞生物資源中心，目錄號TCHu71)種植於六孔板中培養過夜，待細胞長至80%細胞融合率時，分別使用10或50M0I的重組腺病毒毒Ad-TRAIL感染HepG2細胞I小時後，用2ml新鮮培養基替換病毒液，繼續培養48小時,收集培養基,用超濾管濃縮後用Western blot進行檢測(一抗為小鼠抗人TRAIL單克隆抗體，Santa Cruz生物技術公司，目錄號sc_8440 ;二抗為HRP標記的兔抗小鼠IgG,杭州華安生物技術有限公司，貨號HA1008)。以重組腺病毒Ad-EGFP為對照(control)。結果如圖3所示，上圖為用10或50M0I的Ad-Endostatin病毒感染48小時後HUVEC細胞表達分泌Endostatin蛋白的結果；下圖為用10或50M0I的Ad-TRAIL病毒感染48小時後!fepG2細胞表達分泌TRAIL蛋白的結果；表明感染重組腺病毒Ad-Endostatin的HUVEC細胞以及感染重組腺病毒Ad-TRAIL病毒後的HepG2細胞能分別表達分泌型的Endostatin和TRAIL蛋白，隨著感染時病毒濃度的增加，Endostatin和TRAIL蛋白的表達量也隨之增加。實施例2、Ad-Endostat in和Ad-TRAIL重組腺病毒聯合作用一、單獨作用對內皮細胞和腫瘤細胞增殖抑制效率的檢測在96孔板中分別培養HUVEC和H印G2細胞，當細胞融合率達到80%時，按照實施例I的方法分別感染10M0I、50M0I重組腺病毒Ad-Endostat in和Ad-TRAIL。分別於轉染後24小時、48小時和72小時後，每孔加入10 μ I的5mg/ml MTT溶液，繼續培養4小時，去除培養液，每孔加入100 μ 1DMS0溶解10分鐘，在酶標儀上檢測溶液490nm處的吸收值，並計算細胞的增殖活性。以等體積的O. IM PBS, pH 7. 4PBS和10M0I或50M0I等量Ad-EGFP為對照。
以每次實驗PBS處理組中最大值為100% ;增值率(％)= (A處理/Apbs最大值)X 100 ；Ααa表示各處理組其中490nm處的吸收值，Apbs最大值表示當次實驗中PBS處理在490nm處的最大的吸收值。結果如圖4、表I和表2所示，4A圖為用10或50M0I的Ad-Endostatin病毒感染後HUVEC細胞24小時、48小時和72小時的細胞增值率，PBS和Ad-EGFP為對照；4B圖為用10或50M0I的Ad-TRAIL病毒感染後HepG2細胞24小時、48小時和72小時的細胞增值率，PBS和Ad-EGFP為對照；表IHUVEC細胞增值率
HUVEC MTT(%)
細胞增值率PBbAd-EGFP 10 MOI 50 MOI
Ad-E Ad-E
24 h10093. 32 91.61 80.40
48 h99.9988.64 74.48 65. 75
72 h10083.59 45.83 34. 72表2!fepG2細胞增值率
HepG2 MTT (%)
細胞增值率PBS Ad-EGFP 10 MOI 50 MOI
Ad-T Ad-T
24 h10098. 38 93. 74 78.60
48 h10087. 58 82.85 73.92
72 h99.99 88. 15 63. 30 50.76可以看出，感染Ad-Endostatin病毒後的HUVEC細胞以及感染Ad-TRAIL病毒後的HepG2細胞增殖活性明顯受到抑制，隨著時間的延長，細胞增殖活性受到抑制的效應愈加明顯，此外，隨著感染時病毒濃度的增加，細胞增殖抑制活性也愈加明顯。二、Ad-TRAIL和Ad-Endostatin聯合對腫瘤生長的抑制作用用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養H印G2細胞，取對數生長期的細胞，製成單細胞懸液，調節細胞濃度I X IO8個細胞/ml。在8周齡的雌性裸鼠(BALB/c裸鼠，北京維通利華實驗動物技術有限公司，SPF級)的背側翼部皮下注射O. lmlHepG2細胞懸液，當腫瘤長到IOOmm3開始治療。將裸鼠腫瘤大小、體重等因素搭配後隨機分為五組，第一組為PBS對照組，第二組為Ad-EGFP病毒對照組，第三組為Ad-TRAIL治療組，第四組為Ad-Endostatin治療組，第五組為Ad-TRAIL和Ad-Endostatin聯合治療組。每組5隻，實驗重複三次，結果取平均值。具體方法為用無菌PBS分別稀釋Ad-EGFP、Ad_TRAIL和Ad-Endostatin病毒濃度至2X lO'fu/ml，將100 μ I含2Χ 109pfu病毒顆粒進行腫瘤局部注射，聯合基因治療組將50 μ I 含 I X 109pfu Ad-TRAIL 病毒顆粒和 50 μ I 含 I X 109pfuAd_Endostat in 病毒顆粒混合後進行腫瘤局部注射，PBS對照組則注射100 μ I的濃度為O. 1Μ、ρΗ值為7. 4的PBS，每三天注射一次。每三天用遊標卡尺測量腫瘤最長徑(L)和橫徑(S)，計算腫瘤的近似體積。計算公式為V(mm3)=0.5XLXS2。給藥4次後結束實驗，處死裸鼠，取出腫瘤稱重。結果如圖5所示，左圖為腫瘤體積，右圖為增加小鼠體重； PBS 對照組注射後 10、13、16、19、22、25、28 天后腫瘤體積(mm3)為 109. 58,157. 07、209.57,307.01,516. 98,722. 21,841. 47 ；第二組為Ad-EGFP病毒對照組注射後10、13、16、19、22、25、28天後腫瘤體積(mm3)為 100.92,169.02,210.63,295.52,418.28,539.20,695.33 ；第三組為Ad-TRAIL治療組注射後10、13、16、19、22、25、28天後腫瘤體積(mm3)為104.88,168.43,178.71,246. 47,294. 15,366. 56,483. 48 ；第四組為Ad-Endostatin治療組注射後10、13、16、19、22、25、28天後腫瘤體積(mm3)為 104. 26,175. 39,165. 11,193. 30,302. 21,373. 31,468. 76 ；第五組為Ad-TRAIL 和 Ad-Endostatin 聯合治療組注射後 10、13、16、19、22、25、28天後腫瘤體積(mm3)為 107. 37,152. 01,147. 23,144. 75,179. 03,166. 63,158. 71 ；PBS對照組注射後10、13、16、19、22、25、28天後小鼠體量增重(g)為0、0. 18,0. 68、
I.5,1. 74,2. 12,2. 38 ；第二組為Ad-EGFP病毒對照組注射後10、13、16、19、22、25、28天後小鼠體量增重(g)為 0,0. 44,0. 56,0. 88,1. 34,1. 64,1. 92 ；第三組為Ad-TRAIL治療組注射後10、13、16、19、22、25、28天後小鼠體量增重(g)為 0、0· 60,0. 90,1. 10,1. 20,1. 40,1. 52 ；第四組為Ad-Endostatin治療組注射後10、13、16、19、22、25、28天後小鼠體量增重(g)為 0,0. 62,1. 04,1. 22,1. 36,1. 54,1. 64 ；第五組為Ad-TRAIL 和 Ad-Endostatin 聯合治療組注射後 10、13、16、19、22、25、28天後小鼠體量增重(g)為 0,0. 24,0. 68,0. 94,1. 2,1. 3,1. 32。上述結果表明在肝癌移植腫瘤裸鼠模型上，Ad-TRAIL和Ad-Endostatin聯合基因治療的裸鼠腫瘤明顯比PBS和Ad-EGFP對照組和其他兩種單純基因治療處理小，說明Ad-TRAIL和Ad-Endostatin聯合基因治療能明顯抑制腫瘤的生長。三、聯合Ad-TRAIL和Ad-Endostatin基因治療對腫瘤血管生成抑制效果按照上述二的方法對HepG2肝細胞肝癌荷瘤裸鼠進行治療後，處死小鼠，剝取腫瘤，將腫瘤組織固定後用常規方法切片並進行免疫組織化學染色。腫瘤組織血管密度以CD31血管內皮抗原表達程度判斷(常規方法切片並進行免疫組織化學染色，在顯微鏡下隨機選取6個高倍視野計數其中CD31陽性細胞數)；所選一抗為大鼠抗小鼠CD31單克隆抗(Santa Cruz生物技術公司，目錄號sc_18916), 二抗為生物素標記的兔抗大鼠IgG (北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，貨號SB-0042)。結果如圖6所示，A為PBS對照組，B為Ad-EGFP病毒對照組，C為Ad-TRAIL治療組，D為Ad-Endostatin治療組，E為Ad-TRAIL和Ad-Endostatin聯合治療組，F為每個視野CD31陽性細胞數；PBS對照組、Ad-EGFP病毒對照組、Ad-TRAIL治療組、Ad-Endostat in治療組、Ad-TRAIL和Ad-Endostatin聯合治療組每個視野CD31陽性細胞數分別為111. 24,98. 06、88. 67,62. 34,46. 76 ；上述結果表明，在聯合Ad-TRAIL和Ad-Endostatin治療組小鼠腫瘤切片中腫瘤血管生成明顯減少。在顯微鏡下隨機選取6個高倍視野計數其中CD31陽性細胞數，聯合Ad-TRAIL和Ad-Endostatin治療組的平均每個視野CD31陽性細胞數為46. 76，明顯低於 Ad-EGFP (98. 06)和 PBS 對照組(111. 24)和單純 Ad-TRAIL (88.67)和 Ad-Endostatin(62. 34)基因治療組。說明Ad-TRAIL和Ad-Endostatin聯合基因治療能明顯抑制腫瘤血管生成。四、聯合Ad-TRAIL和Ad-Endostatin基因治療促進腫瘤細胞凋亡效果按照上述二的方法對HepG2肝細胞肝癌荷瘤裸鼠進行治療後，處死小鼠，剝取腫瘤，將腫瘤組織固定後用常規方法切片並進行TUNEL檢測腫瘤組織中的細胞凋亡的情況，操作方法參照Invitrogen公司的原位TUNEL檢測試劑盒進行。結果如圖7所示，A為PBS對照組，B為Ad-EGFP病毒對照組，C為Ad-TRAIL治療組，D為Ad-Endostatin治療組，E為Ad-TRAIL和Ad-Endostatin聯合治療組，F為腫瘤細胞凋亡指數(腫瘤細胞凋亡指數的計算方法為顯微鏡下隨機選取6個相同放大視野倍數腫瘤細胞的凋亡數/總細胞數);PBS對照組、Ad-EGFP病毒對照組、Ad-TRAIL治療組、Ad-Endostatin治療組、Ad-TRAIL和Ad-Endostatin聯合治療組腫瘤細胞凋亡指數分別為I. 18、2. 548、16. 45、8. 52,24. 29 ；上述結果表明，在聯合Ad-TRAIL和Ad-Endostat in治療組小鼠腫瘤切片中腫瘤細胞凋亡數量明顯增加。在顯微鏡下隨機選取6個高倍視野計數其中凋亡陽性細胞數，聯合Ad-TRAIL和Ad-Endostatin治療組的凋亡指數為24. 30%,明顯低於Ad-EGFP (2. 52%)和 PBS 對照組(I. 18%)和單純 Ad-TRAIL (16. 45%)和 Ad-Endostatin (8. 52%)基因治療組。說明Ad-TRAIL和Ad-Endostatin聯合基因治療能明顯促進腫瘤細胞的凋亡。
權利要求
1.一種用於預防和/或治療腫瘤的組合物，其為如下I) -3)中的任意一種 1)含有Endostatin蛋白編碼基因的重組病毒和含有TRAIL蛋白編碼基因的重組病毒組成的組合物； 2)由Endostatin蛋白和TRAIL蛋白組成的組合物； 3)含有Endostatin蛋白編碼基因的重組載體和含有TRAIL蛋白編碼基因的重組載體組成的組合物。
2.根據權利要求I所述的組合物，其特徵在於所述Endostatin蛋白為人源Endostatin蛋白；所述TRAIL蛋白為人源TRAIL蛋白。
3.根據權利要求2所述的組合物，其特徵在於 所述人源Endostatin蛋白的胺基酸序列為序列表中的序列3 ;所述人源Endostatin蛋白編碼基因的核苷酸序列具體為序列表中的序列I或序列表中序列I自5』末端1003-1540位核苷酸或序列表中序列I自5』末端942-1540位核苷酸； 所述人源TRAIL蛋白的氣基酸序列為序列表中的序列4 ;所述人源TRAIL蛋白編碼基因的核苷酸序列具體為序列表中的序列2或序列表中序列2自5』末端1003-1497位核苷酸或序列表中序列2自5』末端942-1497位核苷酸。
4.根據權利要求1-3中任一所述的組合物，其特徵在於 所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組載體為含有Endostatin蛋白編碼基因的重組腺病毒載體或重組穿梭載體； 所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組病毒為將所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組腺病毒載體線性化後轉染HEK293細胞，包裝得到含有Endostatin蛋白編碼基因的重組病毒； 所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組載體為含有TRAIL蛋白編碼基因的重組腺病毒載體或重組穿梭載體； 所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組病毒為將所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組腺病毒載體線性化後轉染HEK293細胞，包裝得到含有TRAIL蛋白編碼基因的重組病毒。
5.根據權利要求4所述的組合物，其特徵在於 所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組腺病毒載體為將所述Endostatin蛋白編碼基因插入腺病毒載體，得到表達Endostatin蛋白的載體； 所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組穿梭載體為將所述Endostatin蛋白編碼基因插入穿梭載體，得到表達Endostatin蛋白的載體； 所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組腺病毒載體為將所述TRAIL蛋白編碼基因插入腺病毒載體，得到表達TRAIL蛋白的載體； 所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組穿梭載體為將所述TRAIL蛋白編碼基因插入穿梭載體，得到表達TRAIL蛋白的載體。
6.根據權利要求1-5中任一所述的組合物，其特徵在於 所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組病毒和所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組病毒的病毒顆粒數比為(1-3) : I ； 所述Endostatin蛋白編碼基因的重組病毒和所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組病毒的病毒顆粒數比具體為1:1。
7.權利要求1-6中任一所述的組合物在如下I)-6)中至少一種的應用 O製備預防和/或治療腫瘤產品； 2)製備抑制腫瘤細胞增殖產品； 3)製備抑制腫瘤血管生成產品； 4)製備促進腫瘤細胞凋亡產品； 5)製備減小腫瘤體積和/或重量產品； 6)製備抑制⑶31血管內皮抗原表達。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於 所述腫瘤為肝癌、宮頸癌、乳腺癌和/或肺癌； 所述腫瘤細胞為肝癌細胞，所述肝癌細胞具體為HepG2細胞。
9.根據權利要求7或8所述的應用，其特徵在於 所述產品為藥物或疫苗。
10.如下I)-4)中任--種物質 1)權利要求1-6中任一所述的組合物中所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組載體； 2)權利要求1-6中任一所述的組合物中所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組載體； 3)權利要求1-6中任一所述的組合物中所述含有Endostatin蛋白編碼基因的重組病毒； 4)權利要求1-6中任一所述的組合物中所述含有TRAIL蛋白編碼基因的重組病毒。
全文摘要
本發明公開了一種聯合治療腫瘤的基因藥物及其應用。本法明提供一種用於預防和/或治療腫瘤的組合物，其為如下1)-3)中的任一一種1)含有Endostatin蛋白編碼基因的重組病毒和含有TRAIL蛋白編碼基因的重組病毒組成的組合物；2)由Endostatin蛋白和TRAIL蛋白組成的組合物；3)含有Endostatin蛋白編碼基因的重組載體和含有TRAIL蛋白編碼基因的重組載體組成的組合物。本發明的實驗證明，本發明提供的藥物是將抑制腫瘤新生血管生成的Endostatin基因和促進腫瘤細胞凋亡的TRAIL基因分別攜帶信號肽並構建於腺病毒高表達載體系統中，可用於宮頸癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤的治療。
文檔編號C12N15/63GK102921020SQ201210419699
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月29日 優先權日2012年10月29日
發明者黃來強, 嚴飛 申請人:清華大學深圳研究生院