一種植物耐鹽蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-05-20 17:31:16 1

專利名稱：：一種植物耐鹽蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種植物耐鹽蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
：土壤鹽漬化對農業的威脅是一個全球性的問題，據統計全球鹽鹼土約有10億公頃，佔世界陸地面積近7.6%。我國是一個發展中的農業大國，全國鹽鹼土約有0.2億多公頃佔全國耕地面積的1/3。鹽分脅迫能顯著的抑制植物的生長，甚至導致植物的死亡。在長期的進化過程中，不同植物形成了不同的機制來適應鹽分的脅迫，同時其抗鹽能力也各不相同。大多數農作物都對鹽分非常敏感，而鹽生植物雖然能在高鹽條件下生存，但它們的經濟價值往往非常有限，提高作物的抗鹽能力已經成為我國農業生產和科研中的重要內容。植物對鹽分的抗性是一個多基因控制的複雜性狀。鹽分對植物的影響涉及到植物體內的各個方面和代謝過程。包括離子毒害，滲透脅迫和氧化脅迫以及光合作用。因此，對抗鹽、耐鹽相關基因及其蛋白的研究具有重要的意義。Apse等(ApseMP，AharonGS，SneddenWA，"a/.，SalttoleranceconferredbyoverexpressionofavacuolarNa+/H+antiporterinArabidopsis.Science，1999，285:1256-1258)對轉AWKO基因的擬南芥植株進行了分析，過量表達Na+ZH+逆向轉運蛋白的轉基因擬南芥植株在200mmol/LNaCl中能正常生長發育。免疫印跡表明，從轉化植株葉片提純液泡比從野生型提純具有更多的v4M^/X7的產物，液泡上Na+ZH+逆向轉運蛋白活力增強。Fukuda等(FukudaA,NakamuraA"TaginA.,etal.Function,intracellularlocalizationandtheimportanceinsalttoleranceofavacuolarNa+/H+antiporterfromrice.Plant&CellPhysiology,2004,45:146)將液泡膜逆向轉運蛋白基因CWW^7轉入到水稻中過量表達也可以提高轉基因植株的耐鹽性。將擬南芥的基因轉入番茄中，過量表達液泡Na+ZH+逆向轉運蛋白的轉基因番茄在200mmol/LNaCl脅迫下能夠正常生長、開花和結實，儘管葉片中Na+濃度高，但番茄果實中Na+濃度很低(ZhangHX,BlumwardE,Transgenicsalt-toleranttomatoplantsaccumulatesaltinfoliagebutnotinfruit.NatureBiotechnology,2001,19:765~768)。Shi等(ShiH,Byeong-haL,"OverexpressionofaplasmamembraneNa+/H+antiportergeneimprovesalttoleranceinArabidopsisthaliana.NatureBiotechnology,2002,1-5)將擬南芥質膜Na+/H+逆向轉運蛋白基因SOW轉入到擬南芥中，轉基因植株可以在150mMNaCl脅迫下開花結實，並且提高了轉基因植株在鹽脅迫下的SOS1的轉錄水平。
發明內容本發明的目的是提供一種植物耐鹽蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的植物耐鹽蛋白，名稱為GmNHX2，來源於大豆屬大豆(G/yc/wmax(Linn.)Merr)，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQIDJV2.2的胺基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQIDW.2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐鹽功能的蛋白質。其中，序列表中的序列2由534個胺基酸殘基組成。GmNHX2為一類>^+氾+逆向轉運蛋白基因，主要功能是在脅迫下調整植物體內的離子平衡。疏水性分析結果表明，在GmNHX2的N-端是高度疏水性的並預測到IO跨膜結構域，具有序列表中序列2的氨基端的第25—432位胺基酸殘基序列；在GmNHX2的C-端有一小段高度親水性的尾巴，具有序列表中序列2的氨基端的第433—534位胺基酸殘基序列，預測其位於細胞質內。GmNHX2與番茄的Na+ZH+逆向轉運蛋白具有高度的胺基酸序列相似性，序列一致性為80%，序列相似性為880/。。所述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多於十個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。為了使(a)中的GmNHX2便於純化，可在由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質的N端或C端連接上如表1所示的標籤。表l.標籤的序列tableseeoriginaldocumentpage4上述(b)中的GmNHX2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的GmNHX2的編碼基因可通過將序列表中SEQIDJY2:l的DNA序列中缺失一個或幾個胺基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個鹼基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標籤的編碼序列得到。為了便於蛋白的分泌表達，還可在所述GmNHX2的氨基末端添加上信號肽序列。上述植物耐鹽蛋白的編碼基因(GmAWX2)也屬於本發明的保護範圍。上述植物耐鹽蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)自序列表中SEQIDW:l的5，端的第117至1718位核苷酸；2)序列表中SEQIDW:1的核苷酸序列；3)編碼序列表中SEQIDJVf2:2蛋白質序列的多核苷酸；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDWs:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴謹條件可為在O.lxSSPE(或O.lxSSC)，0.1。/。SDS的溶液中，在65°C下雜交並洗膜。其中，序列表中的SEQIDW:1由2152個脫氧核苷酸組成，自序列1的5'端的第117至1718位核苷酸為GmAWZ2的編碼序列,序列表中序列1編碼序列表中序列2的胺基酸殘基序列。含有本發明基因的重組表達載體、轉基因細胞系及宿主菌均屬於本發明的保護範圍。實驗表明，該蛋白具有很高的耐鹽性，將該蛋白的編碼基因轉入植物中，可提高植物的耐鹽性。本發明蛋白和其編碼基因通過調節植物體內的Na+離子平衡以提高植物的耐鹽性，具有很高的應用價值。圖1為過表達GmNHX2基因的擬南芥轉基因植株(轉pBI121-GmNHX2擬南芥)的耐鹽性鑑定(處理的NaCl濃度為200mM)。具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例l、植物耐鹽蛋白及其編碼基因的獲得分析大豆品種綏農14的葉片為材料構建的cDNA文庫中獲得的ESTs，發現一個EST與Na+ZH+逆向轉運蛋白類基因有很高的同源性。用RT-PCR和3'RACE從鹽處理6h的文豐7號(統一編號ZDD02611;中國國家種質資源庫)中獲得該基因的全長cDNA序列，具體方法為用200mMNaCl溶液浸泡萌發後生長2周的大豆品種文豐7號的幼苗的根部6小時，收穫葉片提取RNA並反轉錄成cDNA第一鏈，cDNA第一鏈合成按ReverseTranscriptionSystemKit(Promega)試劑盒說明書進行，以該cDNA為模板，用引物N21F(5'-CAGTTGTGTTGAGGGACACA-3')和N21R(5'-GCACTCGACAAAAGGTAGCC-3')進行PCR擴增。PCR反應體系為10xBuffer2.5nl，dNTP2.5mM，N21F5pM，N21R5pM，cDNA20ng,Taq酶1U，加去離子水至25pl。PCR反應程序先94。C5min;然後94°C30S，60°C30s，72°Clmin，擴增35個循環；最後72。C延伸8min。PCR擴增得到650bp左右的EST片段。由於獲得的EST片段不含有完整的編碼區，含有完整的編碼區的cDNA用3'RACE的方法獲得。3'RACE的cDNA第一鏈合成的方法為，用200mMNaCl溶液浸泡萌發後生長2周的大豆品種文豐7號的幼苗的根部6小時，收穫葉片提取RNA並反轉錄成cDNA第一鏈，3'RACE的cDNA第一鏈合成按ReverseTranscriptionSystemKit(Promega)試劑盒說明書進行，但用3CDS:5嗎-ggatcctaatacgactcactagcttmttttttmt(a/g/c)-3'引物替代了試劑盒中的Oligo(dT)16引物。根據獲得的EST序列設計兩條基因特異性引物GSP1:5'-CAGGGCGTGGTTCAATTTTCACG-3'和GSP2:5'-CAGGGCGTGGTTCAATTTTCACG-3';接頭弓l物為3RAC:5'-ggatcctaatacgacteactagc-3'。以3'RACEcDNA為模板，以GSP1和3RAC引物進行第一輪PCR擴增，再以1^1第一輪PCR產物為模板，以GSP2和3RAC為引物進行第二輪PCR擴增。3，RACE的反應體系10xLABuffer(Takara)2.5pl，10mMdNTP0.5|al，GSP1或GSP20.5|iiM,3RAC0.5jaM，第一鏈cDNA(20ng)或第一輪PCR產物0.5|al，LATaq1U(Takara)，加水至終體積25jal。PCR反應程序94°C預變性3min;94°C30s，72°C2min30s擴增5個循環；94°C30s，70。C30s，72。C2min30s擴增5個循環；94。C30s，68°C30s，72。C2min30S擴增27個循環。結果表明上述3'RACEPCR擴增得到2047bp的cDNA片段，將RT-PCR和3'RACE得到的片段組裝拼接獲得長度為2152bp的全長cDNA命名為GmM/X2。經過測序表明，C7miVEY2長2152bp，具有序列表中序列1的核苷酸序列，自序列1的5，端的第117至1718位核苷酸為GmiV/a2的編碼序列，編碼一條長534個胺基酸的蛋白GmNHX2，該蛋白GmNHX2的序列是序列表中序列2的胺基酸殘基序列。疏水性分析結果表明，在GmNHX2的N-端是高度疏水性的並預測到10跨膜結構域，具有序列表中序列2的氨基端的第25—432位胺基酸殘基序列；在GmNHX2的C-端有一小段高度親水性的尾巴，具有序列表中序列2的氨基端的第433—534位胺基酸殘基序列，預測其位於細胞質內。GmNHX2與番琉的Na+ZH+逆向轉運蛋白具有高度的胺基酸序列相似性，序列一致性為80%,序列相似性為88%。實施例2、植物耐鹽蛋白及其編碼基因的功能驗證1、在擬南芥中過表達載體的構建將Gm7WiY2的ORF克隆到pBI121載體並置於35S啟動子控制下。具體方法為根據上述GmA^Z2cDNA序列設計引物，序列如下所示BamN2:5，-GCCGGATCCATGGCCTCGGAATTAGAAATTTC-3，(下劃線標註的是5ami/I酶識別位點)；SacN2:5'-GCGGAGCTCTCATGATGAATAGTGGTTCTGGC-3'(下劃線標註的是SacI酶識別位點)。用200mMNaCl溶液浸泡萌發後生長2周的大豆品種文豐7號的幼苗的根部6小時，取葉片提取RNA並反轉錄得到cDNA，作為模板，以BamN2和SacN2為引物進行PCR擴增。PCR擴增得到1605bp的片段，測序表明，該片段具有自序列1的5'端的第117至1718位核苷酸序列(GmNHX2的ORF)。將擴增得到的片段用5"mEI和&cI雙酶切，將得到的片段插入到pBI121載體的5"mZ/I和SacI酶識別位點之間，得到重組載體。將該重組載體進行酶切和測序鑑定。將經過測序表明含有GmNHX2的ORF的重組載體命名為pBI121-GmNHX2。2、轉pBI121-GmNHX2擬南芥的獲得用農桿菌介導法獲得轉pBI121-GmNHX2擬南芥，具體方法為將重組載體pBI121-GmNHX2轉入農桿菌菌株GV3101獲得重組菌，將該重組菌利用PCR方法驗證。利用以根癌農桿菌介導的蘸花法轉化(CloughSJBentAF，Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacteriura-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana,ThePlantJournal,1998/16/P735-743.[4])，通過鑑定正確的含有pBI121-GmNHX2的重組農桿菌菌株GV3101，將pBI121-GmNHX2轉入擬南芥(Columbia生態型)獲得T。代轉pBI121-GmNHX2擬南芥。將獲得的To代轉pBI121-GmNHX2擬南芥種子種植在含有50mg/L卡那黴素的MS培養基上篩選，獲得陽性植株，將獲得的陽性植株逐代在含有50mg/L卡那黴素的MS培養基上篩選獲得純合體的轉基因株系。篩選獲得的純合的株系用RT-PCR驗證，驗證方法提取12個正常條件下生長的轉pBI121-GmNHX2擬南芥株系和野生型(Columbia生態型)的RNA並反轉錄成第一鏈cDNA，以該cDNA為模板，用引物N25F:5'-GCAGGTGTTGGAGTTGGATT隱3'，N25R:5'-TGACCAGCTATGTTGCTCCA-3'進行PCR擴增，轉入了pBI121-GmNHX2的陽性轉基因擬南芥應擴增得到410bp的片段。結果表明獲得12個RT-PCR鑑定陽性的轉pBI121-GmNHX2擬南芥株系，選擇其中三個株系(Ll、L4和L6)作為其耐鹽性鑑定的材料。3、轉pBI121-GmNHX2擬南芥的耐鹽性鑑定將野生型擬南芥(Columbia生態型)和轉pBI121-GmNHX2擬南芥的3個株系(Ll、L4和L6)的種子均勻的播種於MS培養基上，於4。C放置3天後，轉移至培養室於22°C，16h光照/8h黑暗條件下生長1周後，移入含有200mMNaCl的MS固體培養基上，繼續在該溫度和光照條件下進行脅迫處理7天。鹽處理7天後保持大於75%的綠色葉片面積的植株計為存活，存活率為存活的植株數佔處理的總植株數的百分數。實驗重複三次，每次每個株系至少60粒種子。結果如圖1所示，結果表明在200mM處理下，野生型和轉pBI121-GmNHX2擬南芥的生長和根長都受到抑制，但轉pBI121-GmNHX2擬南芥的生長表現要明顯好於野生型，轉pBI121-GmNHX2擬南芥能維持綠色的葉片並繼續生長，而野生型植株則逐漸白化死亡。過表達GmNHX2基因的擬南芥植株(轉pBI121-GmNHX2擬南芥)株系L1、L4和L6在200mMNaCl處理下，轉基因植株的存活率分別為46.34%、70.59%%、65.06%,而野生型的存活率為24.36%，表明GmNHX2基因在擬南芥中過表達可以提高轉基因植株的耐鹽性。圖1中，wt表示野生型；Ll、L4和L6表示3個獨立的轉pBI121-GmNHX2擬南芥株系。<160〉2<210〉12152DNA〈213〉大豆屬大豆(G/戸'"e顧x(Linn.)Merr)<400〉1cagttgtgttgagggacacatcattctcttctgattcgcgaagaactcaacgatcccaac60ccaatcgcgiatcggaagcaatcgatcagtcaattgcttccggc肌gg卿acaataatgg120cctcggaattagaaatttctccggcggscgctcgcaaggctcccggcaaggagcagcaag180ccgccggcgtcggaatcctcctgcagatcatgstgttggtcttgtccttcgtcctcggcc240acgtcctccgccgcaagaaggtttacatcattcccgaagccagtgcttctcttctcatag300ggttaattgttggtatactagcaaacatttcagacaccgagactaatatcagggcgtggt360tcaattttcacgaggagtttttcttcctgttcctgctacctcctatcatatttcagtctg420ggttcagtctcgcacctaaaccctttttctcaaattttggagcaeittgtcacatttgcta480tattcggtaccttcattgcttcaattgtaacgggtatcttggtttatcttgg"tggcttgc540tctttctgatgtataggctaccttttgtcgsgtgcctgatgtttggtgctcttatatcag600ctactgatcctgttactgttttgtccatatttcaggaactgggcac卿tgcc站tctat6603tgCCttggtttttggag肌tctgttttga8tgatgcca_tggcaatttctttgtacagga720caatgtcatcagttagagctgatccatctggacaaaatttattcatggtggttgttcgat780ttttggagacttttgtagggtcaatgtctgcaggtgttgg3gttgg3tttatatctgctt840tgctgttt犯gt3tgC鄉3ttggatattg8LC犯CCttC8gaacttggsgagttgtcttt900ttgtccttttcccatatttctcgtacatgcttgctg肌ggccttggtctgtctggtattg960tatcaatcctgttcacaggaatagtcatgaatattccaat11atcacaaa1020gttctcaacgatttgcctctgcttttttcgagttaatatcatctttagctgaaacatttg1080tatttstatacatgggctttgatattgctatgg3gC犯C3t3gCtggtC3catgttggat1140ttatattcttctccattatattcattggMttgcaagggcagcaaatgtcttctcatgtg1200cttatttggtcaatctggtcaggcccactcatcgaaagataccttcaaaacatcagaagg1260cactttggt3teigtggacttcg鄉恥caatggcttttgcgcttgctttgcaatcaattc1320atgatcttccgggC3g3Ct3tctttactgcaactactgca3tagttgttt1380tgacggtattgctgattggtggttcaacaggtagcatgctggaagctctagatgttgtag1440gtggagataatgatagccctttggcttcagttggtaccatcacaaatttcgatggaaaca1500atggtta_ta/ttgctcctcattac33cg犯gaatcatcttctgggaaca肌15606igctaaetag21attccacaagactgctgcatcttttacggcattagataaaaactacctga1620ccccattctttacaagtcaaaatgg卿tgaagatgatgaagccgagccttttacttcca1680ca卿tcggg3tttC3tggCcagaaccactattcatcatgattcgttcca1740tgaatgcttt"tttgtacateiatttccgtcageitagctcgtaggaattggcac肌tacagg1800aatctaatttacctcctacattccaagttgtacgatagagaatctcatgtcaagtctcat1860tagtttggacaacaccatgtctggcagagatagcattccatgcagttgatacatgcctct1920gccatgaagttggaggtttataattggatctcaccataceiatcacacacgtatttttaag1980ttgacatttatacgggttttcttacttagtctagttcaggtgaattctgaaaattctggc2040tcacttcatcattgtgacagtgaaattatacccctcaaiSLSLtgaetttcaatcatggaaaac2100tgtatctcaaaataaatgcatcatggactatggctgagtccttatacaggeg2152〈210〉2534PRT〈213〉大豆屬大豆(G7少c/"em"x(Linn.)Merr)〈400〉2MetAlaSer1GlyLysGluGlulieSerProAlaAspAlaArgLysAlaPro15lieMetGluLeu5GinGinAlaAlaGly20LeuSerPheValAla10GlylieLeuLeuMetLeuVal35ValTyrlielieProGlu50ValGlylieLeuAla65TrpPheAsnLeu40AlaSerAlaSer55AsnlieSerAspThr70GluGluPhePheVal25GlyHisValLeuPheHisGluGluPhePhePhe8590lieliePheGinSerGlyPheSerLeuAla100105AlalieValThrPheAlalieAsnPheGly115SerlieValThrGlylie130Leu135Phe120ValTyrLeuArg45lieGin30ArgGlyLeuLeu60GluThrAsnlie75LeuPheLeuLeuProLysPheGlyGlyGly140ProPhe110PheLysLysLeulieArgAla80ProPro95PheSerlieAlaThr125LeuLeuPheLeuMetTyrArgLeuProPheValGluCysLeuMetPheGlyAla145SerAlaThrAspPhe150ValThrValLeuThrAspAspAlaAlaMet195SerAsn180AlaPro165LeuTyrAlaLeuMet155liePheGinGluSer170PheGlyGluSerVal185ArgThrMetSerLeulie160LeuGly175LeuAsnAspPro210ThrPhe225AlaLeuLeuPhelieSerLeuTyr200PheMetValValVal190ValArgAlaGlyGinAsnGlyValGlySerLeu215SerAlaGlyValSer205ArgPheLeuGluMet230TyrAlaGlyLeuLys245LeuPheValLeuGly235lieVal220ValGlyPheLeuGluSerCys260LeuGlyLeuSerAsp250ProTyrPheSerAlaGluGly275MetLysHisTyrPhe265lieValSerlielieSer240AspAsnLeuGinAsn255MetLeulieVal290ArgPheAlaSerAla305PheValPhelieGly280TyrSerAsnLeuTyr270PheThrGlyThr295PheGluLeulieLeu285GinSerSerGinPhe310MetGlyPheAspSer300SerLeuAlaTrpSerAlaArgArgPro370TyrSer385HisAla355ThrTyr325GlyPheliePheSer315AlaMetGluGinVal340AlaAsnValPhelie330SerlieliePhePhe345CysAlaTyrLeuGluThr320HisSer335GlylieHisArgLysArgGlyLeuArgSer360ProSerLysHislie350AsnLeuValGly390lie375AlaMetAlaPheVal365LysAlaLeuTrpAla395Gin380LeuAlaLeuGinSer400lieHisAspLeuProGluGlyHisGlyGinThrliePheThrAlaThr405410415ThrAlalieValValLeuThrValLeuLeulieGlyGlySerThrGly420425430SerMetLeuGluAlaLeuAspValValGlyGlyAspAsnAspSerPro435440445LeuAlaSerValGlyThrlieThrAsnPheAspGlyAsnAsnGlyTyr450455460lieAlaProHisTyrAsnGluGluSerSerSerGlyAsnLyslieLys465470475480MetLysLeuLysGluPheHisLysThrAlaAlaSerPheThrAlaLeu485490495AspLysAsnTyrLeuThrProPhePheThrSerGinAsnGlyAspGlu500505510AspAspGluAlaGluProPheThrSerThrArgSerGlyPheHisGly515520525GinAsnHisTyrSerSer530權利要求1、一種植物耐鹽蛋白，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQID№.2的胺基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐鹽功能的蛋白質。2、權利要求l所述的植物耐鹽蛋白的編碼基因。3、根據權利要求2所述的編碼基因，其特徵在於所述植物耐鹽蛋白的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一.-1)自序列表中SEQIDW2:l的5，端的第117至1718位核苷酸；2)序列表中SEQIDJV2:1的核苷酸序列；3)編碼序列表中SEQIDW2:2蛋白質序列的多核苷酸；4)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDW:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。4、含有權利要求2或3所述的植物耐鹽蛋白的編碼基因的重組表達載體。5、含有權利要求2或3所述的植物耐鹽蛋白的編碼基因的轉基因細胞系。6、含有權利要求2或3所述的植物耐鹽蛋白的編碼基因的宿主菌。7、權利要求1所述的植物耐鹽蛋白的編碼基因在提高植物耐鹽性中的應用。8、根據權利要求7所述的應用，其特徵在於所述植物為水稻、小麥、玉米、大豆、棉花、馬鈴薯、油菜、甘薯、綠豆、紅小豆、橡膠、香蕉、西紅柿、黃瓜、苜蓿或擬南芥。全文摘要本發明公開了一種植物耐鹽蛋白及其編碼基因與應用。該植物耐鹽蛋白，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQID№.2的胺基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQID№.2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物耐鹽功能的蛋白質。實驗表明，該蛋白具有很高的耐鹽性，將該蛋白的編碼基因轉入植物中，可提高植物的耐鹽性。文檔編號C07K14/415GK101386645SQ20081022531公開日2009年3月18日申請日期2008年10月29日優先權日2008年10月29日發明者關榮霞,劉章雄,周國安,常汝鎮,張麗娟,李向華,李英慧,王克晶,邱麗娟,金龍國申請人:中國農業科學院作物科學研究所