通過表達過氧化物酶在轉基因植物中增加病原體抗性的方法
2023-05-20 18:11:41
專利名稱：通過表達過氧化物酶在轉基因植物中增加病原體抗性的方法
技術領域：
本發明涉及產生具有增加的病原體抗性的轉基因植物和/或植物細胞的方法，其特徵在於將編碼具有過氧化物酶活性的蛋白質的DNA序列插入到植物中並且在植物中表達。本發明還涉及編碼過氧化物酶的核酸用於產生具有增加的病原體抗性的轉基因植物和/或植物細胞的用途。另外，本發明涉及編碼大麥過氧化物酶的核酸序列。
由多種病原體如病毒、細菌和真菌引起的植物疾病可以一方面導致經濟損失，即在栽培植物生長中大量的農作物減產，另一方面還對人類食物安全性造成威脅。自上世紀起使用了化學殺真菌劑以控制真菌疾病。儘管使用這些製劑減少了植物疾病的程度，但是到目前為止還不能排除這些化合物對人類、動物和環境的有害影響。為了將常規殺蟲劑的使用減少到最小，因此重要的是檢查多種植物對不同病原體的天然病原體防禦，並且系統地使用遺傳工程，如通過引入外源的抗性基因或通過操作植物中內源的基因表達，來產生病原體抗性植物。
抗性指的是植物預防或至少減少有害病原體的侵襲和建群的能力。
在天然存在的抗性中可以識別出不同的機制，植物用這些機制抵抗植物致病生物的建群。病原體和宿主之間的這些特異性的相互作用決定了感染過程(Schopfer和Brennicke(1999)Pflanzenphysiologie，SpringerVerlag，Berlin-Heidelberg，德國)。
對於品種特異性的抗性(也稱作宿主抗性)，在相容相互作用(compatible interaction)和不相容相互作用(incompatible interaction)間存在著區別。在相容相互作用中，致病性強的病原體和易感植物之間發生相互作用。病原體存活並且可以建立繁殖結構，同時宿主死亡。另一方面當病原體感染植物但是在較輕的症狀發展之前或之後其生長被抑制時，發生不相容相互作用。在後一種情況中，植物對各自病原體有抗性(Schopfer和Brennicke(1999)Pflanzenphysiologie，Springer Verlag，Heidelberg，德國)。在相容相互作用和不相容相互作用中都發生了宿主對病原體的防禦反應。
基因對基因假設(Flor(1971)Annu.Rev.Phytopathology 9275 296)已經分別描述了相容或不相容宿主/病原體相互作用的遺傳基礎。品種特異性病原體識別的前提是植物的顯性或半顯性抗性基因(R基因)的產物和來自植物病原體的互補和顯性的無毒基因(Avr基因)的產物之間直接或間接的相互作用(Keen(1992)Annu.Rev.Genet.24447-463；Staskawicz等人(1995)Science 268661-667)。但是，如果病原體缺乏互補的無毒基因，那麼結果是疾病發作。對於很多鏽菌、黑粉菌、白粉菌以及霜黴菌侵染已經證明了基因對基因模型的正確性，但是沒有將其轉移到所有的宿主/寄生蟲相互作用。
但是在自然中，由於病原體快速的進化發展，此品種特異性的抗性通常被克服(Neu等人(2003)American Cytopathol.Society，MPMI 16 No.7626-633)。相對於此，非宿主抗性提供了強烈的、廣泛的並且持久的保護以免受植物病原體侵害。非宿主抗性指的是病原體可以在某些植物物種中引起疾病，但是不在基因相似的植物物種中引起疾病的現象(Heath(2002)Can.J.Plant Pathol.24259-264)。
除了此有趣的特徵，非宿主抗性的遺傳和分子生物學基礎到目前為止僅很少了解。有跡象表明非宿主抗性由非特異性的介質引起，並且基因對基因相互作用類型的個體病原體蛋白質也引起了非宿主抗性反應(Heath(1981)Phytopathology 711121-1123；Heath(2001)Physiol.Mol.PlantPathol.5853-54；Kamoun等人(1998)Plant Cell 101413-1425；Lauge等人(2000)Plant J.23735-745；Whalen等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856743-6747)。
植物病原體的植物建群僅僅很少發生的另一個原因是這樣的事實，即由於缺乏感染進程所需的介質和結構，病原體不能發展感染結構。另外，由非特異性引起或執行的抗性屏障在病原體感染前就已經存在，阻止了感染結構的形成。這種抗性被稱為基礎抗性，或品種非特異性的抗性，通過被動的和主動的防禦機制來維持。
通過以感染多種不同類型穀類的黴菌(禾布氏白粉菌(Blumeriagraminis))作為例子，說明了造成植物物種或其栽培種對某些植物病原體的抗性或易感性的不同抗性機制。黴菌是子囊菌屬(Ascomycetes)的一部分，並且除了小麥和大麥外還會感染黑麥、燕麥以及多種草類。在某些情況下，造成的大麥和小麥農作物的損失在一些情況下總計可達25％。但是通常損失在5％和15％之間。另外，黴菌還為其他病原體(感染)提供機會(灰雪黴病(gray snow mold)、麥類穎斑病(Glume blotch)、鐮孢菌枯萎症(Fusariumhead blight))。黴感染最普遍的症狀是主要在葉子頂端和在葉鞘上出現白色「黴皰狀突起(mildew pustule)」。白粉菌——禾布氏白粉菌是苛求活體營養的，即它只能以活物質為食並且不能在培養基上培養。真菌以刺激其自身生長的方式影響宿主的新陳代謝(Ferrari等人(2003)The Plant Journal35193-205)。黴菌僅侵襲大麥葉的表皮細胞層。真菌用入侵絲機械地和酶促地通過細胞壁侵入植物細胞，所述入侵絲是分生孢子，即無性產生的孢子。當真菌的補給器官吸器形成時，就實現了對大麥葉的成功感染。吸器從植物細胞中取出養分，這使得未被感染的相鄰細胞要補償細胞養分的這種損失從而保持其存活。通過養分向損傷細胞中的流動，真菌獲得了其自身存活一段時間的基礎。
黴菌作為物種包含幾種專化型(formae speciales)，專化型取決於黴菌攻擊例如小麥還是大麥。在感染大麥的情況下稱其為大麥禾布氏白粉菌(Blumeria graminis f.sp.hordei)，而在感染小麥的情況下稱其為小麥禾布氏白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)。另外，可以在多種專化型中鑑定不同的品種或致病型，宿主物種的不同的栽培種對於所述的專化型表現出不同的抗性。每種專化型僅攻擊幾種植物物種並且不攻擊其他緊密相關的植物。因此稱這種為不被某些專化型攻擊的那些植物的非宿主抗性。
可以鑑別提供給大麥黴抗性的一些不同的遺傳機制。品種特異抗性基於對大麥白粉菌的抗性基因(R基因)，所述基因僅對真菌大麥禾布氏白粉菌的單獨分離菌有效，這是因為如上所述每種單個的R基因僅識別攜帶著互補無毒基因的分離菌(Collins等人(2002)The Powdery MildewAccomprehensive Treatise，American Phytopathological Society，Minnesota；Peterhnsel等人(1997)Plant Cell 91397-1409)。相反的，針對幾種黴分離菌的廣泛的、品種非特異性的抗性受到單個隱性基因的調控，稱此基因為mlo基因(Schulze-Lefert和Vogel(2000)Trends in PlantScience 5343-348)。對mlo基因效果的現有假設是mlo野生型蛋白質是防禦反應的負調節子，並且此蛋白質的缺失會因此導致更迅速、更強烈的防禦反應以引起有效的病原體防禦(Collins等人(2002)，同上)。Mlo介導的抗性導致亞細胞壁添附的形成，所述亞細胞壁添附稱為乳突，直接在被稱為附著器的真菌的入侵絲下面形成。由此抑制了真菌在乳突形成階段的侵入嘗試，即沒有形成真菌養分補給及由此建立有效感染所必需的吸器。
和品種非特異性的抗性對比，在大麥對白粉菌小麥禾布氏白粉菌(Bgt)的非宿主抗性中引起了類似於用無毒型的大麥禾布氏白粉菌(Bgh)接種大麥的防禦機制，所述的小麥禾布氏白粉菌攻擊小麥卻不攻擊大麥。由於非宿主抗性是強烈、廣泛並且長期持續的，所以尤其有興趣的是鑑定負責非宿主抗性的基因。所以大麥的非宿主抗性還可以在農學上應用於其它宿主/病原體系統。因此，存在對這種植物或植物細胞的需要，即所述植物或植物細胞表達介導非宿主抗性的基因並因此表現出對真菌病原體如黴增加的抗性。
本發明的目標是提供對病原體具有增加的抗性的植物或植物細胞。本發明另外的目標是提供對不同病原體如黴具有非宿主抗性的植物或植物細胞。另外，本發明的一個目標是提供促進上述轉基因植物或植物細胞產生的方法，所述植物或植物細胞對植物病原體如黴具有增加的(非宿主)抗性。
另外，本發明的一個目標是提供DNA序列，可以用所述DNA序列鑑定對病原體具有非宿主抗性的植物。
獨立權利要求的特徵用來解決在說明書中描述的這種及另外的目標。
本發明優選的實施方案通過從屬權利要求的特徵來定義。
在本發明的範圍內發現大麥和小麥禾布氏白粉菌的相互作用引起了過氧化物酶的特異性誘導，所述過氧化物酶參與對黴的這一專化型的非宿主抗性的介導。
因此本發明所述的目標基本上是通過提供產生具有增加的病原體抗性的轉基因植物的方法來解決，所述方法的特徵在於將編碼具有過氧化物酶活性的蛋白質的DNA序列插入到植物中並在植物中表達。
在本發明中，通過寡核苷酸指紋法研究來鑑定基因，與作為對照目的的大麥和bgh的相互作用相比，所述基因通過大麥和bgt的相互作用轉錄激活。此基因的表達圖式隨後通過多種分子生物學方法確定，並且確定了最強誘導的基因的全長序列。隨後鑑定出此基因為過氧化物酶並且稱其為HvBgt1。在大麥和bgt的非宿主反應期間僅僅24小時後HvBgt1的表達強烈增加，而在宿主反應(大麥和bgh)的全部過程期間，僅觀察到了表達的少量增加(對比表5和
圖1)。
過氧化物酶是通過它將作為有機化合物分子接納體的過氧化氫還原成水的酶。過氧化物酶在細胞壁合成和生物異源物質的解毒作用中有重要作用。在病原體感染期間產生了可以對植物具有副作用的活性氧類別。設想過氧化物酶酶促轉化這些活性氧類別，從而使它們無害。
因此本發明的目標包括分離的核酸分子，其包含選自下列的核酸序列i)包含由SEQ ID No.1或此序列片段編碼的核苷酸序列的DNA序列，ii)包含編碼具有在SEQ ID No.2中所述的胺基酸序列的蛋白質或其片段的核苷酸序列的DNA序列，iii)與在SEQ ID No.1中所給出的核苷酸序列有至少80％的序列同一性的DNA序列，和/或iv)包含核苷酸序列的DNA序列，所述核苷酸序列在嚴格條件下與i)到iii)的核苷酸序列的互補鏈雜交，
並且所述核酸分子編碼具有過氧化物酶活性的蛋白質。
核酸序列優選來自大麥(hordeum vulgare)。
本發明的另一個目標涉及由上述核酸分子編碼的蛋白質或蛋白質片段。
本發明的目標還涉及產生具有增加的病原體抗性的植物或植物細胞的方法，其特徵在於DNA序列選自下列i)包含由SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或這些序列的片段編碼的核苷酸序列的DNA序列，ii)DNA序列，其包含編碼具有在SEQ ID No.2或SEQ ID No.4中描述的胺基酸序列或其片段的蛋白質的核苷酸序列，iii)與在SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所描述的核苷酸序列有至少80％的序列同一性的DNA序列，和/或iv)包含核苷酸序列的DNA序列，所述核苷酸序列在嚴格條件下與i)到iii)的核苷酸序列的互補鏈雜交，所述DNA序列編碼具有過氧化物酶活性的蛋白質，被插入到植物或植物細胞中，並在那裡表達。
本發明另外的目標涉及重組核酸分子，其在5』-3』方向包含-在植物細胞中有活性的啟動子的調節序列，-有效連接到其上的上面給出的核酸序列，-任選地，有效連接到其上的在植物細胞中作用為轉錄、終止、和/或加A信號的調節序列。
本發明的主題還涉及依照根據本發明的方法之一產生的轉基因植物或植物細胞，所述轉基因植物或植物細胞比野生型具有增加的病原體抗性和更高的過氧化物酶含量。
同樣，本發明的主題是在本發明中描述的核酸序列用於產生具有增加的病原體抗性的轉基因植物和植物細胞的用途。
另外本發明的主題涉及在本發明中描述的一種核酸序列用於鑑定對病原體顯示出非宿主抗性的植物的用途。
「病原體抗性」指的是減輕或削弱由病原體攻擊引起的植物的致病症狀。症狀可以是多種，但優選地包括這些，即直接或間接導致損害了植物質量、收成大小、用作動物飼料或用於人類消費的食物的適宜性，或妨礙作物的播種、栽培、收穫或加工。
根據本發明，術語「增加的病原體抗性」理解為指的是根據本發明的轉基因植物或植物細胞受到病原體的攻擊比在其他方面同樣處理(如氣候條件和栽培條件，病原體類型等)的未轉化的野生型植物或植物細胞較不強烈和/或較不頻繁。病原體的侵襲優選的至少減少到1/2，特別優選至少減少到1/3，尤其優選至少減少到1/5，以及最優選至少減少到1/10，表現為病原體症狀發展的減少。侵入效率為定量病原體侵襲提供了一種可能性(見實施例9)。術語「增加的病原體抗性」也包括已知為瞬時病原體抗性的抗性，即，根據本發明的轉基因植物或植物細胞只在有限的時期內比各自的野生型具有增加的病原體抗性。
「病原體」可以是通常攻擊野生型植物的任何病原體，換句話說，是真菌病原體、細菌病原體、病毒病原體和動物病原體。優選地，它們是真菌病原體，例如黴。但是也可以假設依照本發明所使用的序列的過表達還可以對其他病原體引起抗性。
真菌病原體或類真菌病原體(如藻界(chromista))優選地來自根腫菌門(Plasmodiophoromycota)，卵菌門(oomycota)，子囊菌門(ascomycota)，壺菌綱(chytridiomycetes)，接合菌綱(zygomycetes)，擔子菌門(basidiomycota)，和半知菌綱(deuteromycetes)(半知菌(fungi imperfecti))。在表1中所述的真菌病原體及與它們相關的疾病以實例的方式論及，但是並不局限於此。
表1植物真菌疾病
特別優選地，過氧化物酶賦予下列物種以抗性-根腫菌門，例如根腫病菌(Plasmodiophora brassicae)(十字花科植物根腫病)、馬鈴薯粉痂菌(Spongospora subterranea)(馬鈴薯塊莖粉痂病)、多粘黴(Polymyxa graminis)(穀類和草類的根病)；-卵菌門，例如萵苣盤梗黴(Bremia lactucae)(萵苣霜黴病)、霜黴屬(Peronospora)(霜黴病)，其在金魚草中(金魚草霜黴(P.antirrhini))、在洋蔥中(毀壞霜黴(P.destructor))、在菠菜中(散展霜黴(P.effusa))、在大豆中(東北霜黴(P.manchurica))、在菸草中(「青黴」；菸草霜黴菌(P.tabacina))、在苜蓿和三葉草中(車軸草霜黴(P.trifolium))、草假霜黴(Pseudoperonospora humuli)(草霜黴病)、單軸黴屬(Plasmopara)(葡萄霜黴病)(葡萄生單軸黴(P.viticola))、和向日葵中(霍爾斯單軸黴(P.halstedii))、指疫黴菌(穀類和草類的霜黴病)、腐黴屬(種子腐爛病、苗期猝倒病以及根腐病和所有類型的植物黑根病例如由德巴利腐黴(P.debaryanum)引起的甜菜黑根病)、致病疫黴(Phytophthora infestans)(馬鈴薯和番茄晚疫病等)、白鏽屬(Albugo spec.)(十字花科植物白銹病)；-子囊菌門，例如Microdochium nivale(黑麥和小麥雪黴病)、禾本科鐮孢、大刀鐮孢(穗腐病，特別是小麥穗腐病)、尖鐮孢(番茄萎蔫)、禾布氏白粉菌(大麥白粉病(f.sp.hordei)和小麥白粉病(f.sp.tritici))、豌豆白粉菌(Erysiphe pisi)(豌豆白粉病)、仁果癌叢赤殼菌(Nectria galligena)(果樹潰瘍)、葡萄鉤絲殼(Uncinula necator)(葡萄樹白粉病)、維管束假盤菌(Pseudopeziza tracheiphila)(葡萄樹的「Rotbrenner」)、麥角菌(Clavicepspurpurea)(麥角病，例如黑麥和草類麥角病)、小麥全蝕病菌(小麥、黑麥和其它草類的全蝕病)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)(稻瘟病)、麥類核腔菌(Pyrenophora graminea)(大麥葉條紋病)、圓核腔菌(Pyrenophorateres)(大麥網斑病(net blotch of barley))、偃麥草核腔菌(Pyrenophoratritici-repentis)(小麥褐斑病(黃斑病))、蘋果黑星菌(Venturiainaequalis)(蘋果黑星病)、油菜菌核病菌(白黴)、苜蓿假盤菌(Pseudopezizamedicaginis)(苜蓿、白色核紅色三葉草褐斑病)；-擔子菌綱，如肉孢核瑚菌(Typhula incarnata)(大麥、黑麥、小麥雪腐病(灰雪黴病))、玉蜀黍黑粉菌(玉米黑粉病)、裸黑粉菌(Ustilagonuda)(大麥散黑粉病)、小麥散黑粉菌(Ustilago tritici)(小麥、斯卑爾脫小麥散黑粉病)、燕麥散黑粉菌(Ustilago avenae)(燕麥散黑粉病)、立枯絲核菌(馬鈴薯黑痣病)、軸黑粉菌(Sphacelotheca spp.)(高粱絲黑穗病)、亞麻柵鏽菌(Melampsora lini)(亞麻銹病)、禾柄鏽菌(Puccinia graminis)(小麥、大麥、黑麥、燕麥杆銹病)、隱匿柄鏽菌(Puccinia recondita)(葉銹病)、散生柄鏽菌(Puccinia dispersa)(黑麥葉銹病)、大麥柄鏽菌(Puccinia hordei)(大麥葉銹病)、禾冠柄鏽菌(Puccinia coronata)(燕麥冠銹病)、條形柄鏽菌(小麥、大麥、黑麥以及多種草類的條銹病)、疣頂單孢鏽菌(Uromycesappendiculatus)(菜豆銹病)、齊整小核菌(多種植物的根腐和莖腐病)；-半知菌綱(半知菌(fungi imperfecti))，如小麥穎枯殼針孢(小麥穎枯病)(小麥殼針孢)、小麥基腐病菌(小麥、大麥、黑麥眼斑病)、黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)(黑麥和大麥葉斑枯病)、早疫鏈格孢(Alternariasolani)(馬鈴薯、番茄早疫病)、菜莖點黴(Phoma betae)(甜菜黑根病)、菾菜生尾孢(Cercospora beticola)(甜菜葉斑病)、芸苔鏈格孢(Alternariabrassicae)(芸苔、甘藍和其它十字花科植物的十字花科植物黑斑病)、大麗花輪枝孢(Verticillium dahliae)(芸苔萎蔫和莖腐病)、豆刺盤孢(Colletotrichum lindemuthianum)(菜豆炭疽病)、黑脛莖點黴(Phomalingam-black leg)(甘藍黑腿病；芸苔莖潰瘍)、灰葡萄孢(葡萄樹、草莓、馬鈴薯、啤酒花等的灰黴病)。
最優選地，根據本發明的方法產生的植物對下列病原體有抗性致病疫黴(黑斑病、馬鈴薯晚疫病等)、Microdochium nivale(以前已知為雪腐鐮孢(Fusarium nivale)；黑麥和小麥雪腐病)、禾本科鐮孢、大刀鐮孢(小麥頸腐病)、尖鐮孢(番茄萎蔫)、禾布氏白粉菌(大麥白粉病(f.sp.hordei)和小麥白粉病(f.sp.tritici))、稻瘟病菌(稻瘟病)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotium)(白黴、油菜籽潰瘍)、穎枯殼針孢和小麥殼針孢(小麥穎枯病)、芸苔鏈格孢(芸苔、甘藍和其它十字花科植物的十字花科植物黑斑病)、黑脛莖點黴(甘藍黑腿病、株腐病、芸苔莖潰瘍)。
在表2中所列的病原體及與它們相關的疾病以細菌病原體實例的方式論及，但是並不局限於此。
表2細菌疾病
特別優選地，根據本發明產生的轉基因植物對下列病原細菌有抗性壞腐棒桿菌(Corynebacterium sepedonicum)(馬鈴薯細菌性環腐病)、胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)(馬鈴薯黑腿病)、解澱粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)(梨、蘋果和榲桲的火疫病)、瘡痂病鏈黴菌(Streptomyces scabies)(馬鈴薯瘡痂病)、丁香假單胞菌菸草致病變種(Pseudomonas syringae pv.Tabaci)(菸草野火病)、丁香假單胞桿菌菜豆致病變種(Pseudomonas syringae pv.Phaseolicola)(矮菜豆暈疫病)、丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringae pv.Tomato)(番茄細菌葉斑病)、油菜黃單胞菌錦葵致病變種(Xanthomonas campestris pv.Malvacearum)(棉花細菌性黑枯病)、和野油菜黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas campestris pv.Oryzae)(水稻和其他草類的細菌葉枯病)。
術語「病毒病原體」包括所有植物病毒，例如菸草花葉病毒(tobaccomosaic virus)、黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus)、環斑病毒(ringspotvirus)、壞死病毒(necrosis virus)、玉米矮花葉病毒(maize dwarf mosaicvirus)等等。
在表3中列出的病原體和與它們相關的疾病以病毒病原體的實例的方式論及，但是並不局限於這些。
表3病毒疾病
根據本發明的過氧化物酶還可以賦予對動物害蟲(例如昆蟲和線蟲)的抗性。昆蟲如甲蟲、毛蟲、蝨或蟎可以以實例的方式論及，但是不局限於此。
根據本發明的過氧化物酶優選地賦予對下列屬的昆蟲的抗性鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、纓翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、蝨目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等等。特別優選的昆蟲屬為鞘翅目和鱗翅目、如歐洲玉米螟(European corn borer(ECB))、巴氏根葉甲(Diabrotica barberi)(長角葉甲(Northern corn rootworm))、南方玉米根葉甲(Diabroticaundecimpunctata)、玉米根葉甲(Diabrotica virgifera)、小地老虎(Agrotisipsilon)、透翅切根夜蛾(Crymodes devastator)、Feltia ducens(番茄褐夜蛾，dingy cutworm)、泥背地老虎(Agrotis gladiaria)、梳爪叩頭蟲(Melanotusspp.)、Aeolus mellillus(捻轉血矛線蟲(wireworm))、Aeolus mancus(麥金針蟲(wheat wireworm))、砂地金針蟲(Horistonotus uhlerii)、玉米長喙象(Sphenophorus maidis)、Sphenophorus zeae(牛草長象喙(timothy billbug))、早熟禾象甲(Sphenophorus parvulus)、南方玉米長喙象(Sphenophoruscallosus)、食葉鰓金龜(Phyllogphaga spp.)、(蠐螬(white grubs))、Anuraphismaidiradicis(玉米根蚜(corn root aphid))、灰地種蠅(Delia platura)(玉米種蠅，seedcorn maggot)、葡萄肖葉甲(Colaspis brunnea)、Stenolophuslecontei(玉米籽慄褐步甲(seedcorn beetle))和玉米籽細步甲(Cliviniaimpressifrons)。
其它是黑角負泥蟲(Oulema melanopus)、歐洲麥稈蠅(Oscinella frit)、捻轉血矛線蟲(Agrotis lineatus)和蚜蟲(如燕麥蚜蟲禾穀縊管蚜(Rhopalosiphum padi)、穀物蚜蟲禾穀網蚜(Sitobion avenae))。
在表4中列出的病原體和與它們相關的疾病以線蟲害蟲實例的方式指出，但是並不局限於這些。
表4.寄生蟲線蟲
根據本發明的轉基因植物特別優選地對下列有抗性馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis)和馬鈴薯白線蟲(G.Pallida)(馬鈴薯、番茄和其它茄科草本的孢囊線蟲)、甜菜胞囊線蟲(Heterodera schachtii)(甜菜和飼用甜菜、芸苔、甘藍等的甜菜胞囊線蟲)、燕麥胞囊線蟲(Heterodera avenae)(燕麥和其它禾穀類胞囊線蟲)、鱗球莖莖線蟲(莖和鱗莖線蟲，黑麥、燕麥、玉米、三葉草、菸草和甜菜的甜菜頭線蟲)、小麥粒線蟲(Anguina tritici)(小麥粒線蟲病，小麥(斯卑爾脫小麥、黑麥)的種癭和葉癭)、北方根結線蟲(Meloidogyne hapla)(胡蘿蔔、黃瓜、萵苣、番茄、馬鈴薯、甜菜、苜蓿的北方根結線蟲)。
對於在農業中特別重要的特定物種，根據本發明所用的過氧化物酶優選地對下列病原體有效
對於大麥，針對下面的真菌病原體、細菌病原體和病毒病原體有效大麥禾柄鏽菌(Puccinia graminis f.sp.hordei)(大麥杆銹病)、大麥禾布氏白粉菌(Blumeria(Erysiphe)graminis f.sp.hordei)(大麥白粉病)、大麥黃矮病毒(BYDV)、以及致病昆蟲/線蟲玉米螟(Ostrinia nubilalis)(歐洲玉米螟)；小地老虎；麥二叉蚜(Schizaphis graminum)；麥長蝽(Blissus leucopterusleucopterus)；擬綠蝽(Acrosternum hilare)；褐美洲蝽(Euschistus servus)；灰地種蠅(Deliaplatura)；麥癭蚊(Mayetiola destructor)；麥巖蟎(Petrobialatens)。
對於大豆，針對下面的真菌病原體、細菌病原體或病毒病原體有效Phytophthora megasperma fsp.glycinea、菜豆殼球孢、立枯絲核菌、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、尖鐮孢、菜豆間座殼大豆變種(Diaporthephaseolorum var.Sojae)(大豆擬莖點黴(Phomopsis sojae))、大豆莖潰瘍病菌(Diaporthe phaseolorum var.Caulivora)、齊整小核菌、菊池尾孢(Cercospora kikuchii)、大豆尾孢(Cercospora sojina)、東北霜黴、束狀刺盤孢(Colletotrichum dematium)(平頭刺盤孢(Colletotrichumtruncatum))、山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola)、大豆殼針孢(Septoriaglycines)、大豆生葉點黴(Phyllosticta sojicola)、鏈格孢、丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonas syringae p.v.glycinea)、野油菜黃單胞菌菜豆致病變種(Xanthomonas campestris p.v.phaseoli)、Microsphaera diffussa、半裸鐮孢(Fusarium semitectum)、大豆莖褐腐病菌(Phialophora gregata)、大豆花葉病毒(soybean mosaic virus)、大豆小叢殼(Glomerella glycines)、菸草環斑病毒(tobacco ring spot virus)、菸草條點病毒(tobacco streak virus)、豆薯層鏽菌(Phakopsorapachyrhizi)、瓜果腐黴、終極腐黴(Pythiumultimum)、德巴利腐黴、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus)、大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)、腐皮鐮孢、以及致病昆蟲/線蟲大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)；梨豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)；苜蓿綠夜蛾(Plathypena scabra)；玉米螟(歐洲玉米螟)；小地老虎；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)；煙芽夜蛾(Heliothis virescens)；美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea)；墨西哥豆瓢蟲(Epilachna varivestis)；桃短尾蚜(Myzuspersicae)；蠶豆小綠葉蟬(Empoasca fabae)；擬綠蝽；紅足黑蝗(Melanoplusfemurrubrum)；特異黑蝗(Melanoplus differentialis)(特異黑蝗(differentialgrasshopper))；種蠅(Hylemya platura)；Sericothrips variabilis(大豆薊馬(soybean thrips))；棉薊馬(Thrips tabaci)；土耳其斯坦葉蟎(Tetranychusturkestani)；二點葉蟎(Tetranychus urticae)。
對於油菜，針對下面的真菌病原體、細菌病原體或病毒病原體有效白鏽菌(Albugo candida)、芸苔鏈格孢、十字花科小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)、立枯絲核菌、核盤菌、芸苔生球腔菌(Mycosphaerellabrassiccola)、終級腐黴、寄生霜黴(Peronospora parasitica)、粉紅鐮孢、鏈格孢。
對於苜蓿，針對下面的真菌病原體、細菌病原體或病毒病原體有效Clavibater michiganese subsp.insidiosum、終級腐黴、畸雌腐黴(Pythiumirregulare)、華麗腐黴(Pythium splendens)、德巴利腐黴、瓜果腐黴、大雄疫黴(Phytophthora megasperma)、車軸草霜黴(Peronosporatrifoliorum)、苜蓿莖點黴(Phoma medicaginis var.Medicaginis)、苜蓿尾孢(Cercospora medicaginis)、苜蓿假盤菌、苜蓿黃斑病菌(Leptotrochilamedicaginis)、鐮刀菌、野油菜黃單胞菌苜蓿致病變種(Xanthomonascampestris p.v.alfalfa)、根腐絲囊黴(Aphanomyces euteiches)、草本匍柄黴(Stemphylium herbarum)、苜蓿匍柄黴(Stemphylium alfalfa)。
對於小麥，針對下面的真菌病原體、細菌病原體或病毒病原體有效丁香假單胞菌atrofaciens致病變種(Pseudomonas syringae p.v.atrofaciens)、冰草條黑粉菌(Urocystis agropyri)、油菜單胞菌小麥致病變種(Xanthomonas campestris p.v.translucens)、丁香假單胞菌丁香致病變種、鏈格孢、多主枝孢(Cladosporium herbarum)、禾本科鐮孢、燕麥鐮孢、大刀鐮孢、小麥散黑粉菌、小麥殼二孢、麥類條斑病菌(Cephalosporiumgramineum)、禾生炭疽菌、小麥禾白粉菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)、小麥禾柄鏽菌(Puccinia graminis f.sp.tritici)、小麥隱匿柄鏽菌(Pucciniarecondita f.sp.tritici)、條形柄鏽菌(Puccinia striiformis)、偃麥草核腔菌、穎枯殼針孢、小麥殼針孢、燕麥殼針孢(Septoria avenae)、小麥基腐病菌、立枯絲核菌、禾穀絲核菌(Rhizoctonia cerealis)、禾頂囊殼小麥變種(Gaeumannomyces graminis var.Tritici)、瓜果腐黴、禾根腐黴、終級腐黴、小麥根腐病菌、大麥黃矮病毒、雀麥草花葉病毒、小麥土傳花葉病毒(soilborne wheat mosaic virus)、小麥條紋花葉病毒、小麥梭斑病毒(wheatspindle streak virus)、美洲小麥條點花葉病毒、麥角菌、小麥腥黑粉菌(Tilletia tritici)、小麥光腥黑粉菌(Tilletia laevis)、小麥散黑粉菌、印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、立枯絲核菌、Pythium arrhenomannes、禾生腐籬(Pythium gramicola)、瓜果腐黴、高原病毒(High Plains Virus)、歐洲小麥條點病毒(European wheat striate virus)、小麥禾柄鏽菌(小麥稈銹病)、小麥禾布氏白粉菌(Blumeria(Erysiphe)graminis f.sp.tritici)(小麥白粉病)、以及致病昆蟲/線蟲粘蟲(Pseudaletia unipunctata)；秋夜蛾(Spodopterafrugiperda)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)；蒼白西部地老虎(Agrotis orthogonia)(西部地老虎(Western cutworm))；ElasmopalpusZignosellus(lesser cornstalk borer)；黑角負泥蟲；車軸草葉象(Hyperapunctata)；南方玉米根葉甲(Diabrotica undecimpunctata howardi)；俄羅斯麥長管蚜；麥二叉蚜；麥長管蚜(Macrosiphum avenae)；紅足黑蝗；特異黑蝗；遷飛黑蝗(Melanoplus sanguinipes)；麥癭蚊；麥紅吸漿蟲(Sitodiplosismosellana)；美洲麥稈蠅(Meromyza americana)；冬作種蠅(Hylemyacoarctata)；煙褐薊馬(Frankliniella fusca)；麥莖蜂(Cephus cinctus)；鬱金香癭蟎(Aceria tulipae)。
對於向日葵，針對下面的真菌病原體、細菌病原體或病毒病原體有效霍爾斯單軸黴(Plasmophora halstedii)、核盤菌、翠菊黃化(aster yellows)、向日葵殼針孢(Septoria helianthi)、向日葵擬莖點黴(Phomopsis helianthi)、向日葵鏈格孢(Alternaria helianthi)、百日草鏈格孢(Alternaria zinniae)、灰葡萄孢、莖點黴黑莖病菌(Phoma macdonaldii)、菜豆殼球孢、二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)、米根黴(Rhizopus oryzae)、少根根黴、匍枝根黴、向日葵柄鏽菌(Puccinia helianthi)、大麗花輪枝孢、胡蘿蔔歐文氏軟腐桿菌胡蘿蔔致病變種(Erwinia carotovorum p.v.Carotovora)、頂頭孢黴、隱地疫黴(Phytophthora cryptogea)、婆羅門參白鏽(Albugo tragopogonis)，以及致病昆蟲/線蟲Suleima helianthana；向日葵斑螟(Homoeosomaelectellum)；向日葵葉甲(zygogramma exclamationis)；胡蘿蔔金龜(Bothyrus gibbosus)；向日葵籽癭蚊(Neolasioptera murtfeldtiana)。
對於玉米，針對下面的真菌病原體、細菌病原體或病毒病原體有效亞粘團串珠鐮孢、斯氏歐文氏菌、串珠鐮孢、玉蜀黍赤黴(禾本科鐮孢)、Stenocarpella maydi(玉米色二孢)、畸雌腐黴、德巴利腐黴、禾生腐黴、華麗腐黴、終級腐黴、瓜果腐黴、黃麴黴、玉米小斑病菌0、T(異旋孢腔菌)、炭色長蠕孢I、IIIII(玉米圓斑病菌)、玉米大斑病菌I、IIIII、Helminthosporium pedicellatum、玉蜀黍節壺菌、玉米黃葉枯病菌、玉米球梗孢(Kabatiella maydis)、高粱尾孢、玉蜀黍黑粉菌、高粱柄鏽菌、多堆柄鏽菌、菜豆殼球孢、草酸青黴、稻黑孢、多主枝孢、彎孢、不等彎孢、蒼白彎孢、Clavibacter michiganese subsp.nebraskense、綠色木黴、玉米矮花葉病毒AB、小麥條紋花葉病毒、玉米褪綠矮化病毒、高粱麥角(Claviceps sorghi)、Pseudonomas avenae、菊歐文氏菌玉米致病變種、胡蘿蔔軟腐歐文氏菌、Cornstunt spiroplasma、Diplodia macrospora、指疫黴菌、高粱指霜黴、菲律賓指霜黴、玉蜀黍指霜黴、甘蔗指霜黴、Spacelothecareiliana、玉米殼鏽菌、玉米晚枯病菌、頂頭孢黴、玉米褪綠斑駁病毒、高原病毒(High Plains virus)、玉米花葉病毒、玉米雷亞多非納病毒、玉米條紋病毒(MSV)、玉米線條病毒、玉米粗矮病毒，以及致病昆蟲/線蟲玉米螟(歐洲玉米螟)；小地老虎；美洲棉鈴蟲；秋夜蛾；西南玉米稈草螟(Diatraeagrandiosella)；南美玉米苗斑螟；小蔗螟(Diatraea saccharalis)；Diabroticavirgifera(Western corn rootworm)；長角葉甲(Diabrotica longicornisbarberi)；南方玉米根葉甲(Diabrotica undecimpunctata howardi)；梳爪叩頭蟲；圓頭犀金龜(Cyclocephala borealis)(圓頭犀金龜、蠐螬)；南方圓頭犀金龜(Cyclocephala immaculata)(南方圓頭犀金龜、蠐螬)；日本弧麗金龜(Popillia japonica)；玉米銅色跳甲(Chaetocnema pulicaria)；玉米長喙象；Anuraphis maidiradicis(玉米根蚜)；麥長蝽；紅足黑蝗；遷飛黑蝗；種蠅；玉米斑潛蠅(Agromyza parvicornis)；美洲錐尾薊馬(Anaphothripsobscrurus)；竊蟻(Solenopsis molesta)；二點葉蟎。
對於高粱，針對下面的真菌病原體、細菌病原體或病毒病原體有效玉米大斑病菌、禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)、高粱尾孢、高粱膠尾孢、高粱生殼二孢(Ascochyta sorghina)、丁香假單胞菌丁香致病變種、油菜黃單胞菌高粱致病變種、須芒草假單胞菌、紫柄鏽菌(Pucciniapurpurea)、菜豆殼球孢、高粱根腐病菌、串珠鐮孢、鏈格孢、Bipolarissorghicola、高粱生長蠕孢(Helminthosporium sorghicola)、彎孢、高粱莖點黴(Phoma insidiosa)、燕麥假單胞菌(白沉澱假單胞菌(Pseudomonasalboprecipitans))、高粱座枝孢(Ramulispora sorghi)、高粱生座枝孢(Ramulispora sorghicola)、甘蔗黑痣菌(Phyllachora sacchari)、絲孢堆黑粉菌(Sporisorium reilianum)(絲軸黑粉菌)、高粱軸黑粉菌(Sphacelothecacruenta)、高粱堅孢堆黑粉菌(Sporisorium sorghi)、甘蔗花葉H(Sugarcanemosaic H)、玉米矮花葉病毒AB、高粱麥角(Claviceps sorghi)、立枯絲核菌、點枝頂孢菌、指疫黴菌、高粱指霜黴、菲律賓指霜黴、禾生指梗黴、禾本科鐮孢、尖鐮孢、禾根腐黴、禾生腐黴，以及致病細菌/線蟲斑禾草螟(Chilo partellus(sorghum borer))；秋夜蛾；美洲棉鈴蟲；南美玉米苗斑螟；粒膚地老虎(Feltia subterranea)；Phvllophaga crinita(蠐螬)；Eleodes spp、寬胸金針蟲Conoderus spp.和Aeolus spp.(捻轉血矛線蟲)；黑角負泥蟲；玉米銅色跳甲；玉米長喙象；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)(玉米縊管蚜)；黃偽毛蚜(Siphaflava)(蔗黃偽毛蚜)；麥長蝽；高粱癭蚊(Contariniasorghicola)；硃砂葉蟎(Tetranychus cinnabarinus)；二點葉蟎。
對於棉花，針對下面的致病昆蟲/線蟲有效煙芽夜蛾；美洲棉鈴蟲；甜菜夜蛾；棉花紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)；墨西哥棉鈴象(Anthonomus grandis grandis)；棉蚜(Aphis gossypii)(cotton aphid)；棉偽斑腿盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)；結翅粉蝨(Trialeurodes abutilonea)；美洲牧草盲蝽(Lygus lineolaris)；紅足黑蝗；特異黑蝗；棉薊馬；煙褐薊馬(Franklinkiella fusca)；硃砂葉蟎；二點葉蟎；對於稻，針對下面的致病昆蟲/線蟲有效小蔗螟；秋夜蛾；美洲棉鈴蟲；葡萄肖葉甲；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus)；米象(Sitophilusoryzae)；Nephotettix nigropictus(黑尾葉蟬)；麥長蝽；擬綠蝽；對於芸苔，針對下面的致病昆蟲/線蟲有效甘藍蚜(Brevicorynebrassicae)；蘿蔔菜跳甲(phyilotreta cruciferae)；披肩粘蟲(Mamestraconjgurata)；菜蛾(Plutella xylostella)；種蠅(Delia ssp.)(根蛆)。
根據本發明，術語「野生型」理解為各自的非遺傳修飾的親本生物。
根據本發明的方法在轉基因植物和/或在植物細胞中引起過氧化物酶含量的增加。含量的這一增加至少為5％，優選至少為20％，還優選至少為50％，特別優選至少為100％，還特別優選至少為5倍，尤其優選的至少為10倍，還尤其優選至少為50倍，以及最優選為100倍。
本文用到的術語「DNA片段」理解為編碼具有過氧化物酶活性的蛋白質的DNA區段，其中由DNA區段編碼的蛋白質基本具有和由完整DNA序列編碼的蛋白質相同的過氧化物酶活性，並且應用這些片段可以實現在根據本發明的轉基因植物中增加病原體抗性。
本文用到的術語「蛋白質片段」指的是具有過氧化物酶活性的蛋白質區段，其中蛋白質區段和全長蛋白質基本具有相同的過氧化物酶活性，並且應用這些片段可以實現在根據本發明的轉基因植物中增加病原體抗性。
在根據本發明的方法中所用的過氧化物酶的基本相同的酶活性指的是與由SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的序列所編碼的酶及其衍生物相比，所述酶活性仍然至少是50％，優選至少是60％，特別優選至少是70％，並且尤其優選至少是80％，並且最優選至少是90％。因此具有基本相同的酶活性的過氧化物酶也能在轉基因植物中產生增加的病原體抗性。
過氧化物酶的活性可以通過本領域技術人員已知的簡單方法測定，如廣泛應用的guajacol過氧化物酶活性測定(Chance和Maehley(1955)Method Enzymol.11764-775)或丁香醛連氮活性測定(Pandolfini等人(1992)Plant Cell Environ.15719-725)。
本文用到的術語「核酸(分子)」在優選的實施方案中另外包括位於編碼基因區域的3』和5』端的未翻譯的序列編碼區5』端上遊該序列的至少500、優選地200、特別優選地100個核苷酸，以及編碼基因區域的3』端下遊該序列的至少100、優選地50、特別優選地20個核苷酸。「分離的」核酸分子從在核酸的天然貯庫中存在的其它核酸分子中分離出來。「分離的」核酸優選地沒有天然與該核酸來源生物的基因組DNA中天然位於該核酸側翼的序列(例如，位於此核酸5』和3』端的序列)。在多種實施方案中，分離的過氧化物酶分子可以包含例如小於大約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然地位於核酸來源細胞的基因組DNA中該核酸分子的側翼。所有在此提及的核酸分子可以是例如RNA、DNA或cDNA。
在本方法中使用的核酸分子，例如具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或其一部分的核苷酸序列的核酸分子，可以使用標準的分子生物學技術和本文提供的序列信息來分離。藉助於可以在如NCBI主頁(http://www.ncbi.hlm.nih.gov)下找到的比較算法，還可以在DNA或胺基酸水平上鑑定出例如同源序列或同源的保守序列區域。此序列的基本部分或完整的同源序列可以用作雜交探針，使用標準雜交技術(如在Sambrook等人中所描述的，見上)通過篩選cDNA和/或基因組文庫從可用於本方法的其它生物中分離另外的核酸序列。此外，使用以在此給出的序列或其一部分為基礎的寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈式反應可以分離包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或其一部分的完整序列的核酸分子(例如，使用基於相同序列生成的寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈式反應可以分離包含完整序列或其部分的核酸分子)。例如，可以從細胞中分離mRNA(例如，通過Chirgwin等人(1979)Biochemistry 185294-5299中的硫氰酸胍提取方法)，並且cDNA可以從所述mRNA中用逆轉錄酶(例如Moloney-MLV逆轉錄酶，購自Gibco/BRL，Bethesda，MD，或AMV逆轉錄酶，購自SeikagakuAmerika，Inc.，St.Petersburg，FL)產生。用於通過聚合酶鏈式反應擴增的合成的寡核苷酸引物可以根據SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示序列的一種生成，或藉助於SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示的胺基酸序列生成。根據本發明的核酸可以通過使用cDNA，或備選地使用基因組DNA作為模板，並且使用適當的寡核苷酸引物，通過標準PCR擴增技術來擴增。以此方式擴增的核酸可以克隆到適當的載體中並且用DNA序列分析來鑑定。對應於過氧化物酶核苷酸序列的寡核苷酸可以通過標準的合成方法產生，如通過自動DNA合成儀。由這些核酸序列編碼的蛋白質的過氧化物酶活性之後可以通過上述的酶測定法來測定。使用在此所描述的方法，還可以通過檢測根據本發明所鑑定的過氧化物酶的存在來鑑定表現出非宿主抗性的植物。
在本發明的上下文中，術語「在嚴格條件下雜交」意思是雜交在能確保特異性雜交的足夠嚴格的條件下體外進行。嚴格體外雜交條件為本領域技術人員所已知並且可以在文獻(如Sambrook和Russell(2001)MolecularCloningA Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，Cold Spring Harbour，NY)中查到。術語「特異性雜交」指的是這種事實，即在嚴格條件下，分子優選地結合到某一核酸序列(靶序列)上，但是如果靶序列是例如DNA或RNA的複雜混合物的一部分，那麼所述分子不結合到或至少以相當小的程度結合到其它序列上。
嚴格條件決定於多種條件。更長的序列在更高的溫度下特異性雜交。通常選擇嚴格條件，使在確定的離子強度和確定的pH值下雜交溫度比特定序列的解鏈溫度(Tm)低約5℃。Tm是在平衡狀態下與靶序列互補的分子的50％雜交到靶序列時的溫度(處於確定的pH值，確定的離子強度和確定的核苷酸濃度)。通常，嚴格條件是指那樣的條件，其中在7.0到8.3的pH下鹽濃度為至少大約0.01到1.0M鈉離子濃度(或另一種鹽的濃度)，並且對於短的分子(例如10到50個核苷酸)，溫度為至少30℃。此外，嚴格條件可以包括添加去穩定化雜交分子的試劑，如甲醯胺。在本文用到的嚴格條件下的雜交中，相互具有至少60％同源性的核苷酸序列通常保持相互雜交。優選地，按照以下方式選擇嚴格條件，即相互同源性至少為大約65％，優選地至少為大約70％，並且特別優選地至少為大約75％，或更高的序列通常保持相互雜交。嚴格雜交條件的優選的非限制性實例是在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，在大約45℃下雜交，隨後在0.2×SSC、0.1％SDS、50℃到65℃下進行一步或多步洗滌步驟。溫度範圍，例如在標準雜交條件下的溫度範圍決定於核酸的類型，在濃度為0.1到5×SSC(pH 7.2)的水性緩衝液中為42℃到58℃。
如果有機溶劑如50％甲醯胺存在於上述緩衝液中，在標準條件下的溫度為大約42℃。優選地，DNADNA雜交分子的雜交條件為例如0.1×SSC和20℃到45℃，優選地為30℃到45℃。優選地，DNA:RNA雜交分子的雜交條件為例如0.1×SSC和30℃到55℃，優選地在45℃到55℃之間。為在例如沒有甲醯胺時具有大約100個鹼基對長度和G/C含量為50％的核酸確定上述雜交溫度。本領域的技術人員已知如何應用上述或下列教科書確定所需的雜交條件，所述教科書為Current Protocols in Molecular Biology，John WileySons，N.Y.(1989)，Hames和Higgins(publisher)1985，Nucleic Acids HybridizationA Practical Approach，IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford；Brown(publisher)1991，Essential MolecularBiologyA Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。
本發明中的術語「序列同一性」指的是同一性，即在SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所述的核酸序列的完整序列中，在相同的5』-3』序列中相同的核苷酸至少為80％，優選地至少為85％，特別優選地至少為90％，最優選地至少為95％。
序列同一性用基於多種算法的一些程序確定。Needleman和Wunsch的算法或Smith和Waterman的算法提供了尤其可靠的結果。對於序列比較，使用了程序PileUp(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evolution 25351-360；Higgins等人，(1989)CABIOS 5151-153)，或程序Gap和Best Fit(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol. Biol. 48443-453，以及Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482-489)，所述程序包含在GCG軟體包中(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，美國)。
以上以百分數描述的序列同一性值使用GAP程序跨越完整的序列區確定，使用下列設置缺口權重50，長度權重3，平均匹配10000以及平均錯配0.000。
除非另外說明，這些設置用作序列比較的標準設置。
與在SEQ ID No.1和SEQ ID No.3中所給的核酸序列背離的核酸序列可以例如通過向SEQ ID No.1和SEQ ID No.3的核苷酸序列中插入一個或多個核苷酸替代、添加或缺失來產生，由此產生的蛋白質與SEQ ID No.2或SEQ ID No.4中所述的序列相比插入了一個或多個胺基酸替代、添加或缺失。可以使用標準技術如位點專一誘變和PCR介導的誘變將突變插入到SEQ ID No.1和SEQ ID No.3的序列之一中。優選地，在一個或幾個預測的非必需胺基酸殘基處產生保守胺基酸替代，非必需胺基酸殘基是不影響過氧化物酶酶活性的胺基酸殘基。在「保守胺基酸替代」中，胺基酸殘基用具有相似側鏈的胺基酸殘基替代。在專業知識領域中已經定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基家族。這些家族包含具有下列側鏈的胺基酸鹼性側鏈(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側鏈(如天冬氨酸和穀氨酸)、不帶電的極性側鏈(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性的側鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。因此根據本發明所用的過氧化物酶中預測的非必需胺基酸殘基將優選地被來自同樣側鏈家族的另一個胺基酸殘基所替代。備選地，在另一個實施方案中，例如通過飽和誘變，突變可以在編碼過氧化物酶的完整序列或其一部分中隨機地插入，並且得到的突變體可以通過重組表達所編碼的蛋白質來篩選過氧化物酶的活性，從而鑑定保留過氧化物酶活性的突變體。蛋白質的過氧化物酶活性可以例如使用本文描述的測定法測定。
在本發明的術語中，「轉基因的」或「重組的」意思是對於如核酸序列、表達盒(＝基因構建體)、或包含根據本發明的核酸序列的載體、或用分別的核酸序列、表達盒或載體轉化的生物，所有那些構建體都用基因技術產生，其中a)根據本發明的核酸序列，或b)功能性地連接到根據本發明的核酸序列上的遺傳控制序列，如啟動子，或c)a)和b)的任一種不在其天然遺傳環境中，或用基因技術進行了修飾，修飾是例如一個或幾個核苷酸殘基的替代、添加、缺失、倒位或插入。天然遺傳環境意思是在親本生物中的天然基因組或染色體基因座，或在基因組文庫中存在。在基因組文庫的情況下，核酸序列的天然遺傳環境優選地是至少部分保守的。此環境與核酸序列的至少一側側面相接，並且具有的序列長度至少為50bp，優選地至少為500bp，特別優選地至少為1000bp，尤其優選地至少5000bp。當天然發生的表達盒(例如過氧化物酶的天然啟動子與各自的過氧化物酶基因的天然發生的組合)用非天然、合成的(「人工的」)方法(如誘變)修飾時，它就成為了轉基因表達盒。相應的方法在例如US5,365,350或WO 00/15815中描述。
根據本發明，如上所述的術語轉基因植物或植物細胞意思是本方法使用的核酸沒有在植物或植物細胞基因組中它們的天然位點上，由此所述核酸可以同源或異源地表達。然而，轉基因還指的是雖然根據本發明的核酸位於生物基因組中它們的天然位點上，但是相對於天然序列此序列已經改變，和/或天然序列的調節序列已經被修飾。優選地，轉基因理解為根據本發明的核酸在基因組的非天然位點上表達，即核酸同源地或優選異源地表達。
本領域技術人員顯而易見的是，用於產生轉基因植物或植物細胞、編碼過氧化物酶的核酸序列需要被調整以適應生物特異性的密碼子選擇。密碼子選擇可以用所選生物的其它已知基因的計算機分析確定。
在產生根據本發明的具有增加的病原體抗性的轉基因植物或植物細胞的優選方法中，將編碼根據本發明的過氧化物酶的核酸序列分別轉移到植物或植物細胞中。所述轉移使得過氧化物酶的表達或活性比野生型的植物或野生型的植物細胞增加，並且相應地使得轉基因植物或植物細胞的病原體抗性增加。
根據本發明，所述方法一般包括下列步驟a)產生包含5』-3』方向上下列核酸序列的載體-在植物細胞中有活性的啟動子的調節序列，-有效連接到其上的編碼根據本發明的過氧化物酶或過氧化物酶的部分的DNA序列，-有效連接到其上的在植物細胞中作為轉錄、終止和/或加A信號的調節序列，b)將來自步驟a)的載體轉移到植物細胞中，並且任選地，整合到植物基因組中；並且c)任選地，從轉化的植物細胞中再生完整植物。
在插入到植物細胞或植物中後，本方法中所用的核酸可以位於單獨的質粒上，或優選地整合到宿主細胞的基因組中。在整合到基因組的情形中，整合可以是隨機發生的，或通過用插入的拷貝替換天然基因的重組(它引起細胞過氧化物酶表達的調節)，或通過使用反式(in trans)基因從而將此基因功能性地連接到功能表達單元上，所述功能表達單元包含確保基因表達的至少一種序列和確保功能性轉錄基因的多聚腺苷化作用的至少一種序列。
根據本發明，編碼過氧化物酶的核酸的基因表達的增加也表示對植物內源過氧化物酶表達的操作。這可以通過例如修飾過氧化物酶編碼基因的啟動子DNA序列來實現。這種修飾導致內源過氧化物酶基因的表達速率的改變，優選增加，所述修飾可以依靠DNA序列的缺失或插入來發生。內源過氧化物酶基因的啟動子序列的修飾通常導致過氧化物酶基因表達量的改變，並且因此還導致在細胞或植物中可檢測到的過氧化物酶活性的改變。
增加內源過氧化物酶活性和含量的另一種可能是上調參與內源過氧化物酶基因轉錄的轉錄因子，例如通過過表達。本領域的技術人員已知轉錄因子過表達的方法，並且這些方法在本發明中公開以用於過氧化物酶。
此外，可以實現增加內源過氧化物酶基因表達，因為未轉化的生物中不存在的調節子蛋白質與這些基因的啟動子相互作用。所述的調節子可以是由DNA結合結構域和轉錄激活結構域組成的嵌合蛋白質，例如在WO96/06166中描述。
除了要被轉移的過氧化物酶的核酸序列，用於過氧化物酶表達的重組核酸分子還包含另外的調節元件。這些載體需要包含哪些精確的調節元件決定於每種情況下使用這些載體的方法。本領域技術人員熟悉用於產生蛋白質表達增加的轉基因植物多種上述方法，知道這些載體必須包含哪些調節元件和其它元件。
通常，作為載體的部分的調節元件允許用於轉錄並且如果需要，在植物細胞中用於翻譯。這意味著，例如根據所選擇的植物，基因只能在誘導後表達和/或過表達，或其立即表達和/或過表達。例如，這些調節序列是誘導物或阻抑物結合、從而調節核酸表達的序列。除了這些新的調節序列，或代替這些序列，實際的結構基因上遊序列的天然調節仍可以存在，也可能已經被基因修飾從而使天然調節失去功能，並且基因的表達增加。然而重組核酸分子也能以更簡單的方式構建，即在核酸序列的上遊不插入額外的調節信號並且不除去天然啟動子與其調節。而是將天然調節序列以調節不再發生和/或基因表達增加的方式突變。為了增加活性，可以將這些改變的啟動子以部分序列的形式單獨的插入天然基因的上遊。另外，基因構建體還可以有利地包含一個或多個所稱作的增強子序列，所述增強子序列功能性地連接啟動子並且允許核酸序列的表達增加。其它有用的序列，如另外的調節元件或終止子，也可以插入到DNA序列的3』端。
原則上，有可能使用具有其調節序列的任意天然啟動子用於根據本發明的方法。但是也有可能並且有利地僅使用合成啟動子或另外使用合成啟動子。
啟動子可以是組成型啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子或發育特異性啟動子。啟動子以及其它調節序列的選擇決定了區域和時間表達圖式，並且由此也決定了轉基因植物中過氧化物酶的表達。
組成型啟動子包括，例如Rsyn7啟動子的核心啟動子以及在WO99/43838和美國專利號6,072,050中描述的其它組成型啟動子、CaMV 35S啟動子(Odell等人(1985)Nature313810-812)、肌動蛋白啟動子(McElroy等人(1990)Plant Cell 2163-171)、泛蛋白啟動子(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18675-689)、pEMU啟動子(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81581-588)；MAS啟動子(Velten等人(1984)EMBO J.32723-2730)、ALS啟動子(美國申請號08/409.297)，以及類似的啟動子。當使用組成型啟動子時，也可以通過在不需要此基因表達的細胞或組織中抑制該基因表達來實現細胞特異性或組織特異性的表達，抑制基因表達通過如形成結合到該基因產物上的抗體並且由此阻止產物的活性，或通過在這些細胞中作用的適當的抑制劑實現。
優選地，過氧化物酶基因通過誘導型啟動子表達，並且特別優選地是通過病原體誘導型啟動子表達。此種啟動子包括病原體感染後誘導的致病相關蛋白(PR蛋白)的啟動子，所述致病相關蛋白為例如PR蛋白、SAR蛋白質、β-1，3葡聚糖酶、幾丁質酶等(例如參見，Redolfi等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.89245-254；Uknes等人(1992)Plant Cell 4645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4111-116)。
另外特別重要的啟動子是在病原體感染部位上或其附近局部表達的啟動子，如在Marineau等人(1987)Plant Mol.Biol.9335-342；Matton等人(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2325-331；Somsisch等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 832427-2430；Somsisch等人(1988)Mol.Gen.Genet.293-98；Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9314972-14977；Chen等人(1996)Plant J.10955-966；Zhang等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 912507-2511；Warner等人(1993)Plant J.319l-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell 1961-968中所描述的啟動子。
此外，由於病原體通常通過創傷進入，創傷誘導型啟動子也優選地用在根據本發明的方法中。此種創傷誘導型啟動子包括馬鈴薯的蛋白酶抑制劑(pin II)的啟動子(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28425-449；Duan等人(1996)Nature Biotechnology 14494-498)、wun1和wun2的啟動子(美國專利Nr.5,428,148)、win1和win2的啟動子(Stanford等人(1989)Mol.Gen.Genet.215200-208)、系統素的啟動子(McGurl等人(1992)Science 2251570-1573)、WIP1的啟動子(Rohmeier等人(1993)Plant Mol.Biol.22783-792；Eckelkamp等人(1 993)FEBS Letters 32373-76)、MPI基因的啟動子(Corderok等人(1994)Plant J.6(2)141-150)、FGAM-合酶的啟動子(Vaghchhipawala等人(2004)Genome 47(2)404-413)、prxC2的啟動子(Kaothien等人(2002)Plant Mol.Biol.49(6)591-599)、poxA的啟動子(Ito等人(2000)Plant Science 155(1)85-100)、FAD7的啟動子(Nishiuchi等人(1999)Plant Physiol.121(4)1239-1246)、TR2′的啟動子(WO 03/093483)。
通過應用外源化學調節子，可以使用化學調節的啟動子來調節在植物中的基因表達(見在Gatz(1997)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，4889-108中的綜述)。當希望基因表達以時間特異的方式發生時，化學誘導型啟動子是特別適合的。此類的實例包括苯磺醯胺激活的玉米In2-2啟動子、疏水親電化合物誘導的玉米GST啟動子、水楊酸激活的菸草PR-1a啟動子。其它化學調節的啟動子包括類固醇應答啟動子(參見，例如在Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810421-10425和McNellis等人(1998)Plant J.14(2)247-257中的糖皮質素誘導的啟動子)、乙醇誘導的啟動子和四環素誘導的啟動子(參見，例如Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227229-237；美國專利號5,814,618和5,789,156)。
本領域的技術人員已知誘導型啟動子的使用允許產生僅瞬時表達根據本發明的序列的植物或植物細胞。此類瞬時表達允許產生僅表現出瞬時病原體抗性的植物。例如當病原體汙染的危險迫在眉睫並且因此植物只在某段時期內需要對病原體有抗性時，需要此類瞬時抗性。本領域的技術人員已知需要瞬時抗性的另外的情況。此外，本領域的技術人員還知道通過使用載體可以實現瞬時表達以及由此產生的瞬時抗性，所述載體在植物細胞中不穩定地複製並且攜帶表達過氧化物酶的各自序列。
也可以使用組織特異性的啟動子來實現在某一植物組織中增加的過氧化物酶表達。適當的組織特異性的啟動子是例如允許葉特異性表達的啟動子。這些包括在Yamamoto等人(1997)Plant J.1(2)255-265；Kwon等人(1994)Plant Physiol 105357-367；Yamamoto等人(1994)Plant CellPhysiol.35(5)773-778；Gotor等人(1993)Plant J.3509-518；Orozco等人(1993)Plant Mol.Biol.23(6)1129-1138Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)9586-9590；Stockhaus等人(1987)Proc.Natl.Acad.G.USA 847943-7947；Stockhaus等人(1989)EMBO J.82445-2451中所描述的啟動子。
由於作為高等植物地上器官的外組織的表皮的任務之一是阻止病原體侵入到植物中，因此表皮特異性的啟動子的使用也是特別優選地。恰當的表皮特異性啟動子包括擬南芥(Arabidopsis)的CER6(CUT1)基因的啟動子(Hooker等人(2002)Plant Physiol.129(4)1568-1580和Kunst等人(2000)Biochem.Soc.Trans.28(6)651-654)。
其它優選地啟動子為在果實中特別有活性的啟動子。這些包括，例如多聚半乳糖醛酸酶基因的啟動子(例如馬鈴薯的)(Nicholass等人(1995)Plant Mol.Biol.28423-435)、ACC氧化酶的啟動子(例如蘋果的)(Atkinson等人(1998)Plant Mol.Biol.38449-460)或馬鈴薯的2A11啟動子(vanHaaren等人(1991)Plant Mol.Biol.17615-630)。
還優選葉肉特異性啟動子，如稻或番茄的rbcs啟動子(Kyozuka等人(1993)Plant Physiol.102(3)991-1000)、玉米的PPCZm1啟動子(Kausch等人(2001)Plant Mol Biol.45(1)1-15)、擬南芥的CAB2啟動子(Thain等人(2002)Plant Physiol.130102-110)、或稻的AldP啟動子(Kagaya等人(1995)Mol Gen Genet.248(6)668-674)。
另外，本領域技術人員能夠用常規方法分離另外適當的啟動子。因此，使用當前的分子生物學方法如雜交實驗或DNA蛋白質結合研究，本領域的技術人員能夠鑑定如另外的表皮特異性調節核酸元件。在此，例如，第一步從所需的生物中分離所需的組織，從所述組織中分離出調節序列、分離出完整的聚(A)+RNA，並且產生cDNA文庫。在第二步中，使用基於聚(A)+RNA分子從另一組織得到cDNA克隆，這些克隆依靠雜交從第一個文庫(bank)中鑑定出來，其相應的聚(A)+RNA分子僅在所希望的組織中積累。之後使用鑑定出的cDNA，將具有組織特異性調節元件的啟動子分離出來。本領域的技術人員還可以使用額外的基於PCR的方法用來分離適當的組織特異性啟動子。
根據本發明的載體作為調節元件，可以另外包含如增強子元件。它們還可以包含抗性基因、複製信號和附加的DNA區域，所述的這些使載體在細菌如大腸桿菌(E.coli)中能增殖。調節元件還包含實現載體在宿主中穩定化的序列。此類調節元件特別包含以下序列，即所述序列促進載體穩定整合到植物的宿主基因組中，或促進載體在植物細胞中自主複製。本領域的技術人員已知此類調節元件。
所稱作的終止序列是確保轉錄或翻譯恰當終止的序列。如果要翻譯所轉移的核酸，那麼終止序列一般為終止密碼子和各自的調節序列；如果轉移的核酸僅被轉錄，那麼它們通常為聚腺苷酸序列。
本文用到的術語「載體」涉及能夠將結合到其上的另一核酸轉運到細胞中的核酸分子。一種載體類型是「質粒」，其表現為附加的DNA區段可以連接到其中的環狀雙鏈DNA環。另一種載體類型是病毒載體，其中附加的DNA區段可以連接到病毒基因組中。某些載體可以在它已經插入的宿主細胞中自主複製(如具有細菌複製原點的細菌載體)。其它載體在插入到宿主細胞中時有利地整合到宿主細胞的基因組中，並且從而和宿主基因組一起複製。而且，某些載體可以調控其功能性連接的基因的表達。這些載體在此稱作「表達載體」。通常，適於DNA重組技術的表達載體是質粒類型的載體。由於質粒是最常用的載體類型，所以在本說明書中「質粒」和「載體」可以互換使用。但是，本發明也意在包含其它類型的表達載體，如完成類似功能的病毒載體。此外，術語「載體」還意在包含本領域技術人員已知的其它載體，如噬菌體、病毒(例如SV40、CMV、TMV)、轉座子、插入序列、噬粒、噬菌粒、黏粒、線性或環狀DNA。
在重組表達載體中，術語「有效連接到其上」意思是將目標核苷酸序列以該核苷酸序列表達可能發生的方式連接到調節序列上，並且兩種序列都以使得序列完成預測的功能的這種方式互相連接。
術語「調節序列」意在包含啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如加A信號)。這些調節序列在如下中進行了描述例如GoeddelGeneExpression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)或在Gruber和Crosby，在Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology，CRC Press，Boca Raton，Florida，publisherGlick和Thompson，第7章，89-108。調節序列包含那些在多種類型的宿主細胞中調節核苷酸序列組成性表達的序列，以及那些只在某些宿主細胞中在某些條件下調節核苷酸序列直接表達的序列。本領域的技術人員已知表達載體的設計決定於一些因素，如要轉化的宿主細胞的選擇、蛋白質表達的所希望的程度等。
用於過氧化物酶表達的重組表達載體在原核細胞和真核細胞中都有活性。這是有利的，因為為了簡單起見，通常將載體構建的中間步驟在微生物中進行。這些克隆載體包含用於各自微生物的複製信號、以及用於選擇成功轉化的細菌細胞的標記基因。本領域的技術人員知道用於在原核生物中表達的適當載體；它們包括例如大腸桿菌pLG338、pACYC184、pBR系如pBR322、pUC系列，如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11、或pBdCl、鏈黴菌pIJ101(Streptomyces pIJ101)、pIJ364、pIJ702、或pIJ361、芽孢桿菌pUB110(Bacillus pUB110)、pC194、或pBD214、棒桿菌pSA77(Corynebacterium pSA77)、或pAJ667。
在另一實施方案中，表達載體代表酵母表達載體或杆狀病毒(bacillovirus)表達載體。
上述提到的載體僅提供了可能適當的載體的少量概括。其它質粒為本領域的技術人員已知並且在例如Cloning Vectors(publisher Pouwels，P.H.等人Elsevier，Amsterdam，New York-Oxford，1985)中描述。對於適合原核細胞和真核細胞的另外的表達系統，參見Sambrook和Russell的第15和16章(見上)。
在本方法的另一實施方案中，過氧化物酶可以在單細胞的植物細胞如藻類中表達，見Falciatore等人，1999，Marine Biotechnology 1(3)239-251和在本文中引用的文獻，也可以在高等植物的植物細胞中表達(例如種子植物，如作物植物)。植物表達載體的實例包括在以下文獻廣泛描述的那些Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.，和Masterson，R.(1992)，Plant Mol.Biol.201195-1197；和Bevan，M.W.(1984)，Nucl.Acids Res.128711-8721；Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，Bd.1，Engineering and Utilization，publisherKung和R.Wu，Academic Press，1993，S.15-38中。
由於植物基因的表達通常並不限於轉錄水平，植物表達盒除了上述的元件還優選地包含其它功能性連接的序列，如翻譯增強子，例如包含菸草花葉病毒的5』非翻譯前導序列的超驅動序列，所述的超驅動序列增加了蛋白質/RNA的比例(Gallie等人(1987)Nucl.Acids Research 158693-8711)。
如上所述，必須將要表達的基因功能性連接到適當的啟動子上，所述啟動子以時間特異性、細胞特異性或組織特異性的方式調節基因表達。已經在上文描述了適當的啟動子。
在基因表達盒的功能性連接中所用的其它優選地序列是在基因產物靶向到各自的細胞隔室中所需的靶序列(見在Kermode(1996)Crit.Rev.Plant Sci.15(4)285-423中的綜述和其中引用的文獻)，例如在進入到液泡、細胞核、所有類型的質體(如造粉體、葉綠體、色質體)、胞外空間、線粒體、內質網、油質體、過氧化物酶體以及植物細胞的其它隔室中所需的靶序列。
有利地，將過氧化物酶序列按照已知的方式擴增和連接以插入到表達載體中。優選地，按照Pfu DNA聚合酶或Pfu/Tag DNA聚合酶混合物的方案進行。根據將要被擴增的序列來選擇引物。有利地，選擇引物要使得擴增產物(amplificate)包含從起始密碼子到終止密碼子的完整編碼的序列。有利地，在擴增後分析擴增產物。例如在凝膠電泳分離後進行關於質量和數量的分析。之後根據標準方案(如Qiagen)將擴增產物純化。之後純化的擴增產物的整分試樣用於隨後的克隆。
本領域的技術人員通常知道適當的克隆載體。這些克隆載體特別包括在微生物系統中可複製的載體，例如尤其是在細菌、酵母或真菌中允許有效克隆以及允許植物的穩定轉化的載體。尤其值得提及的載體是適合於T-DNA介導的轉化的多種二元載體系統和共整合載體系統。通常此類載體系統的特徵在於它們至少包含土壤桿菌介導的轉化所需的毒力基因以及T-DNA限制序列(T-DNA邊界(T-DNA border))。優選地，這些載體系統還包含另外的順式調節區，如啟動子和終止子和/或用於鑑定各自的轉化生物的選擇標記。在共整合載體系統中毒力基因和T-DNA序列排列在同一個載體上，而二元系統則基於至少兩種載體，其一攜帶毒力基因但不攜帶T-DNA，以及另一個攜帶T-DNA而不攜帶毒力基因。因此後一載體相對較小，在大腸桿菌以及土壤桿菌中易於操作和複製。這些二元載體包括載體系列pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen。根據本發明，優選地為Bin19、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA。Hellens等人(2000)Trends inPlant Science 5，446-451提供了二元載體及其應用的綜述。
對於載體製備，可以首先通過限制性內切核酸酶將載體線性化，然後以任何合適的方式進行酶促修飾。之後純化載體並且將整分試樣用於克隆。在克隆期間，通過連接酶將酶切和純化(如果需要)後的擴增產物連接到用相似方法製備的載體片段上。某些核酸構建體、或載體構建體或質粒構建體可以具有一個或甚至幾個編碼的基因區。優選地，將這些構建體中編碼的基因區功能性地連接到調節序列上。調節序列尤其包括植物序列，如上述啟動子和終止子。構建體有利地可以在適當的培養基中在微生物尤其是大腸桿菌和根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中培養，並且在選擇條件下穩定增殖。之後收穫並且裂解細胞並從中提取質粒。這可用於將異源DNA轉移進植物或微生物中。
關於克隆載體的有利的用途，可以將根據本發明的方法中所用的核酸、根據本發明的核酸和核酸構建體插入到生物中，如微生物、或優選地如植物，並且將它們用於植物轉化，如在下面文獻中所公開和引用的PlantMolecular Biology and Biotechnology(CRC Press，Boca Raton，Florida)，第6/7章，第71-119頁(1993)；F.F. White，Vectors for Gene Transfer inHigher Plants；在Transgenic Plants，Bd.1，Engineering and Utilization中，publisherKung和R.Wu，Academic Press，1993，15-38；B.Jenes等人，Techniques for Gene Transfer，在Transgenic Plants，Bd.1，Engineeringand Utilization中，publisherKung等人R.Wu，Academic Press(1993)，128-143；Potrykus(1991)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42205-225。因此在本方法中所用的核酸、根據本發明的核酸和核酸構建體、和/或載體可以用於廣譜生物的遺傳修飾，優選地用於植物的遺傳修飾。
有很多已知的技術可用於將DNA插入植物宿主細胞，並且本領域的技術人員可以不困難的找到每種情況下最適當的方法。這些技術包括應用根瘤土壤桿菌或髮根土壤桿菌(Agrobacterium rguzogenes)作為轉化劑，用T-DNA轉化植物細胞、原生質體融合、分離的DNA到原生質體中的直接基因轉移、DNA的電穿孔、依靠生物射彈方法的DNA插入以及其它可能。穩定轉化和瞬時轉化都可以以這種方式產生。
對於植物中DNA的注射和電穿孔，本質上對於所使用的質粒沒有特殊的要求。類似的對於直接基因轉移也是這樣的。可以使用簡單質粒如pUC衍生物。但是如果要從這種轉化的細胞中再生出完整植株，那麼需要選擇性標記基因的存在。本領域的技術人員已知最常用的選擇性標記，並且對於他來說選擇適當的標記並不存在困難。常用的選擇性標記是使轉化的植物細胞對殺生物劑或對抗生素有抗性的那些選擇性標記，如卡那黴素、G418、博來黴素、潮黴素、氨甲蝶呤、N-膦醯甲基甘氨酸、鏈黴素、磺醯脲、艮他黴素或膦絲菌素等。單獨選擇的標記可以用於選擇轉化細胞(相對於缺少插入DNA的細胞)。為此目的，備選的標記如營養標記或篩選標記(如GFP，綠色螢光蛋白)也是適當的。當然，也可以完全省卻選擇性標記，但是這會極大的增加對篩選的需要。如果需要無標記的轉基因植物，本領域的技術人員也可用允許隨後除去標記基因的方法，如共轉化、或序列特異性重組酶。一旦插入的DNA整合進入植物細胞的基因組中，它通常在那裡是穩定的，並且還將保留在最初轉化細胞的後代中。
如果土壤桿菌用於轉化，如上說明的，必須將要插入的DNA克隆到特定的質粒(居間載體或二元載體)中。由於居間載體中與T-DNA的序列同源的序列，居間載體可以通過同源重組整合到土壤桿菌的Ti或Ri質粒中。質粒還包含T-DNA轉移所必需的致病區(vir region)。居間載體不能在土壤桿菌中複製。可以依靠輔助質粒將居間載體轉移到根瘤土壤桿菌中(接合作用)。二元載體可以在大腸桿菌以及土壤桿菌中複製。它們包含用左右T-DNA邊界區域圍住的選擇性標記基因和接頭或多聚接頭。它們可以直接轉化到土壤桿菌中(Holsters等人(1978)，Molecular and General Genetics163，181-187)。作為宿主細胞起作用的土壤桿菌應當包含攜帶致病區的質粒。致病區對於T-DNA轉移到植物細胞中是必需的。還可以存在T-DNA。以這種方式轉化的土壤桿菌用於植物細胞的轉化。
在EP 120 515中已經廣泛分析和充分描述了T-DNA用於植物細胞轉化的用途。
對於DNA到植物細胞中的轉移，有利地可以用根瘤土壤桿菌或髮根土壤桿菌培養植物外植體。之後在包含用於轉化細胞選擇的抗生素或殺生物劑的適當的培養基中，可以從感染的植物材料(如葉切片、柄節、根，還有原生質體或懸浮培養的植物細胞)中再生完整植株。根據常規的再生方法，應用已知的培養基進行植物的再生。以這種方式得到的植物或植物細胞可以通過已建立的方法如DNA印跡法或PCR來分析插入DNA的存在。
本領域的技術人員已知使用生物射彈方法或原生質體轉化來插入外源DNA的其它可能性(見L.Willmitzer(1993)Transgenic Plants在Biotechnology，A Multi-Volume Comprehensive Treatise中(publisherH.J.Rehm等人)，第2卷，627-659，VCH Weinheim，德國)。
其間，通過Ti質粒載體系統依靠根瘤土壤桿菌不僅很好的建立了雙子葉植物或其細胞的轉化，還建立了單子葉植物或其細胞的轉化(見Chan等人(1993)，Plant Mol.Biol.22，491-506等等)。
單子葉植物或其細胞轉化的備選系統包括依靠生物射彈方法轉化(Wan和Lemaux(1994)Plant Physiol.104，37-48；Vasil等人((1993)Bio/Technology 11，1553-1558；Ritala等人(1994)Plant Mol.Biol.24，317-325；Spencer等人(1990)，Theor.Appl.Genet.79，625-631)、原生質體轉化、部分透化的細胞的電穿孔以及通過玻璃纖維插入DNA。
轉化細胞在植物中以通常方式生長(另外見McCormick等人(1986)，Plant Cell Reports 5，81-84)。得到的植物可以正常培養，或與具有相同的轉化遺傳密碼或不同的遺傳密碼的植物進行品種間雜交。得到的雜種個體具有相應的表型特徵。應當培養2代或更多代以確保表型特徵穩定的保留和傳遞。同樣，應當收穫種子以確保已經將各自的表型或其它特徵保留。
類似的，根據常規方法可以鑑定轉基因系，所述轉基因系對於新的核酸分子是純合的，並且可以分析它們關於病原體反應性的存在或缺乏的表型行為以及將所述的表型行為與半合子系的行為比較。
當然，包含根據本發明的核酸分子的植物細胞還可以另外以細胞培養物的形式(包含原生質體、愈傷組織、懸浮培養物等)培養。
根據本發明的方法可以有利地與賦予病原體抗性(例如針對昆蟲、真菌、細菌、線蟲等的抗性)、脅迫抗性或植物特徵的另一種改進的另外的方法組合。實施例和其它在Dunwell JM(2000)J Exp Bot.51487-496中提及。
根據本發明，術語轉基因植物包含完整的植物以及植物的所有部分，其中根據本發明的植物過氧化物酶蛋白質的表達增加。這包括植物和植物器官的所有部分，例如葉、莖、種子、根、塊莖、花葯、纖維、根毛、柄、胚、愈傷組織、子葉(cotelydons)、葉柄、農作物材料、植物組織、繁殖組織、來自轉基因植物的細胞培養物和/或可以用來產生轉基因植物的部分。
根據所用的載體系統，還可以根據本發明生成轉基因植物，其中要轉移的核酸作為獨立的複製系統包含在植物細胞或植物中。用於植物轉移的載體之後必須具有相應的DNA序列，所述的DNA序列會促進在細胞中用於轉移的質粒的複製。
在植物或植物細胞中的過氧化物酶蛋白質的特異性表達根據本發明可以通過常規的分子生物學和生物化學方法證實和跟蹤。本領域的技術人員知道這些技術並且能容易地選擇適當的檢測方法，如用於檢測過氧化物酶特異性RNA或用於測定過氧化物酶特異性RNA積累的量的RNA印跡分析，或用於檢測編碼過氧化物酶的DNA序列的DNA印跡或PCR分析。用於此目的的探針或引物序列既可以與在SEQ ID No.1或3中給出的序列相同，也可以表現出與這些序列微小的不同。
當然，上述技術還可以用於鑑定由於存在本發明所鑑定的過氧化物酶而具有非宿主抗性的另外的植物。
用於根據本發明的方法的植物原則上可以是任何要使其對病原體侵襲產生抗性的植物。優選地，其為單子葉或雙子葉農業植物、食用植物或飼料植物。
單子葉植物的實例是屬於下列屬的植物燕麥(Avena)、小麥(Triticum)、黑麥(Secale)、大麥(Hordeum)、稻(Oryza)、黍屬(Panicum)、狼尾草(Pennisetum)、Setaria(狗尾草)、高粱(Sorghum(millet))、玉米(Zea)等。
雙子葉農業植物包括棉花、豆科植物(如豆類)，並且特別是苜蓿、大豆、油菜、芸苔、番茄、甜菜、馬鈴薯、向日葵、觀賞植物及樹。另外的農業植物可以包含水果(特別是蘋果、梨、櫻桃、葡萄、柑橘、菠蘿和香蕉)、油椰、茶樹、可可和咖啡樹、菸草、劍麻、以及藥用植物蘿芙木(Rauwolfia)和洋地黃(Digitalis)。特別優選穀類小麥、黑麥、燕麥、大麥、稻、玉米和黍以及雙子葉植物甜菜、芸苔、大豆、番茄、馬鈴薯和菸草。另外的農業植物可以從美國專利號6,137,030中收集。
優選的植物為金盞花、向日葵、擬南芥、菸草、辣椒、大豆、番茄、茄子、胡椒、胡蘿蔔、馬鈴薯、玉米、萵苣和甘藍的類型、穀類、苜蓿、燕麥、大麥、黑麥、小麥、小黑麥、黍、稻、苜蓿、亞麻、棉花、大麻、Brassicacaes如油菜或芸苔、甜菜、甘蔗、堅果和果酒物種(wine species)或樹，如楊樹或紫杉。
本發明的另一個目標涉及根據本發明的轉基因植物以及來自它的細胞、細胞培養物、部分、轉基因繁殖材料用於產生食物和飼料、藥物或精細化學品的用途。
將來自大麥的過氧化物酶鑑定為介導大麥對小麥禾布氏白粉菌隔離群的非宿主抗性的基因及其在轉基因植物或植物細胞中用來介導病原體抗性的用途將分別在下文中解釋。下列實施例應不解釋為限制。在本專利申請中引用的所有文獻、專利申請、專利和公布的專利申請的內容在此引用作為參考。
實施例實施例1常規克隆方法克隆方法如限制性消化、瓊脂糖凝膠電泳，DNA片段的純化、核酸到硝化纖維素膜和尼龍膜的轉移、DNA片段的連接、大腸桿菌細胞的轉化、細菌的培養和重組DNA的序列分析按照在Sambrook等人(2001)(見上)中所描述的進行。
實施例2重組DNA的序列分析根據Sanger(Sanger等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463-5467)的方法使用ABI的雷射螢光DNA序列分析儀進行重組DNA分子的測序。
實施例3通過寡核苷酸指紋圖譜法鑑定大麥的HvBgt1
用寡核苷酸指紋法(Radelof等人(1998)Nucleic Acids Res.26(23)5358-64)鑑定大麥過氧化物酶基因HvBgt1為Bgt誘導的基因。這一方法允許鑑定即使是非常低表達的基因的表達圖式。
在用小麥黴感染的大麥植物的mRNA生成的文庫中鑑定HvBgt1(Bgt；葉組織的收穫時間6、24、48和72 h.p.i)。使用BASF公司開發的軟體HyStac，比較在此文庫中的個體簇的多度和作為參考的兩個另外的大麥文庫(用大麥黴(Bgh)接種的大麥和未接種的大麥)的多度。這一分析表明對於HvBgt1，在大麥+Bgt文庫中多度增加了大約10倍。
實施例4大麥品系的培養和黴感染大麥野生型品系Ingrid MLOBc用於實驗。種子由Dr.PatrickSchweizer，IPK Gatersleben提供。
在將種子放在土壤上後，4℃培育24小時以用於分層的目的。之後將植物在受控制的生長條件下放置在溫室(Agrarzentrum Limburgerhof，BASFAG)中。平均溫度是23℃，溼度在40％到70％之間。晝夜節律分別是10小時和14小時。播種7天後，用Bgh或Bgt接種植物。用於本實驗的病原體大麥禾布氏白粉菌的隔離群FA6h由ETH Zurich at Heckenholz的研究工作站提供。病原體小麥禾布氏白粉菌是在the Agrarzentrum ofBASF AG在小麥變種Kanzler上培養的田間隔離群。對於感染，用Bgh嚴重感染的大麥植物或Bgt嚴重感染的小麥植物分別保持在需要被感染的大麥或擬南芥植物上面，並且將黴抖落使分生孢子轉移到植物上。
實施例5被感染的大麥植物的總RNA的分離在4天的時期後，每隔24小時收穫被感染的大麥材料和未被感染的對照，用鋁箔包住並且在乾冰中深度冷凍。葉子材料儲存在-80℃下。在將葉子材料破碎為小片後，根據製造商的說明藉助於RNeasy Plant Maxi Kit(Qiagen，Hilden，德國)分離總RNA。用2×0.6ml的無RNA酶的水進行純化的RNA的洗脫。用EPPENDORF BioPhotometer 6131確定濃度，並且隨後用2體積的98％的乙醇和1/10體積的醋酸鈉(3M，pH 5.2)沉澱RNA，並將其調整到大約2μg/μl的濃度。
實施例6通過定量PCR分析確定過氧化物酶的表達分離自葉子材料的RNA樣品用於定量PCR。首先，將仍殘餘在RNA樣品中的任何DNA消化。用來自AMBION(Huntingdon，美國)的DNA-freeTM按照下述準備消化RNA 50μl10x DNA酶I緩衝液6μlDNA酶I(2U/μL) 2μlH2O加到60μl2μl將混合物在37℃下溫育30分鐘。之後加入9μl的DNA酶滅活試劑並且充分混合溶液。在室溫下進行2分鐘額外的溫育時間後，將溶液在10,000g下離心1分鐘以沉澱DNA酶滅活試劑。將RNA轉移到新的容器中並且儲存在-20℃下。
在DNA酶消化後，將RNA逆轉錄為cDNA。使用APPLIEDBIOSYSTEMS(Applera Deutschland GmbH，Darmstadt，德國)的TaqMan Reverse Transcription Reagents進行測定RNA6μl25mM MgCl24.4μldNTP-Mix(10mM) 4μl50μM隨機六聚體1μl10x RT緩衝液 2μlRNA酶抑制劑0.4μlMultiscribe RT(50U/μL)1.5μl無核酸酶的H2O 0.7μl混合物在25℃下溫育10分鐘，之後在37℃下溫育60分鐘。最後，在95℃下將混合物熱滅活5分鐘。
轉錄的DNA用20μl的H2O稀釋並且將其中的2.5μl用於定量PCR。將18S rRNA確定為內標。對所有樣品進行重複三次測定。將混合物移液到96孔板中。首先單獨移液cDNA，之後單獨向SYBR GreenMaster Mix中添加引物和相應量的水，並且將溶液混合。
cDNA 2.5μl2x SYBR GreenMaster Mix 12.5μl正向引物，Gip162，200nM0.09μl反向引物，Gip163，200nM0.14μl無核酸酶的H2O添加到25μl 9.77μlGip162CGAGGCCCTTGTGACATACATGip163ACTTAGGTGTCGTTACTTGGACCAT感染前各自的對照值作為參考樣品(0小時)。對Bgh感染後24小時、48小時和72小時取得的樣品進行轉錄量的測定。
18S rRNA的準備cDNA 2.5μl2x SYBR GreenMaster Mix 12.5μl正向引物，Gip63，200nM 0.12μl反向引物，Gip64，200nM 0.13μl無核酸酶H2O9.75μlGip63CGTCCCTGCCCTTTGTACACGip64AACACTTCACCGGACCATTCA平板在室溫和2,500轉/分鐘(rpm)下離心1分鐘並且將樣品在來自APPLIED BIOSYSTEMS(Applera Deutschland GmbH，Darmstadt，德國)的ABI PRISM 7000裝置中直接測量。使用APPLIED BIOSYSTEMS公司的ABI PRISM 7000 SDS程序進行評估。
在表5和
圖1中說明了使用定量PCR測定的表達數據。測量進行了2次並且對單獨的測量值重複三次測定。所顯示的是各自的平均值以及相關的標準差。
表5在非宿主相互作用(大麥和Bgt)和宿主相互作用(大麥和Bgh)中HvBgt1的表達的時間進程的說明對於每種相互作用測量的0小時值作為比較值或校準物。
結果顯示了三種系統對照、非宿主相互作用和宿主相互作用之間HvBgt1表達的顯著性差異。記錄到對照中測量起始後直到48小時，轉錄量顯著增加了大約28倍，之後直到72小時的時間後這種增加幾乎保持恆定。另一方面，在非宿主相互作用(大麥Bgt)中，24小時後察覺到幾乎110倍的增加，之後這種增加在72小時後緩慢下降到10倍量。相比，在宿主相互作用(大麥Bgh)中，全部時間內只察覺到了最大僅為3倍的轉錄量的增加。
實施例7通過RACE-PCR對大麥HvBgt1的全長序列的分離將從感染的葉子材料中分離的RNA用於RACE-PCR。根據製造商的說明用Invitrogen(Karlsruhe，德國)的GeneRacerTM-Kit產生RACE cDNA文庫。作為基因特異性的引物(GSP)，引物M207用作5』RACE引物，並且引物M208用作嵌套引物。
M207GCTTATTCAGCAGCCAACAAAGTAACM208CTGTTTCACAAGTTTATGGTCCAAGTAA樣品PCR的準備10x聚合酶緩衝液 5μldNTP Mix(10mM)，INVITROGEN1.5μl模板(Hv-RACE文庫) 1μlGSP，M 207(10pmol)4μlGeneRacer X′Primer(10pmol) 4.5μl聚合酶(5U/μl)1μLH2O 33μlPCR程序 樣品嵌套PCR的準備10x聚合酶緩衝液 5μldNTP Mix(10mM)，INVITROGEN1.5μl模板(PCR準備) 5μlGSP，M207(10pmol) 4μl
GeneRacer X′nested primer，M 208(10pmol) 4.5μl聚合酶(5U/μl) 1μlH2O33μlPCR程序 基因HvBgt1的全長序列在一些部分步驟中擴增，隨後測序，並且之後在計算機晶片上彙編。由於序列的一部分通過3』RACE用聚腺苷酸延伸擴增並且序列的另一部分通過5』RACE來擴增，所以新的序列可以通過重疊群(contig)與原始序列連接。完整序列大約是1,000bp。序列所有可能的ORF依靠電腦程式ContigExpress(INFORMAX，Maryland，美國)顯示。發現了一個延伸945bp長的ORF。在起始的上遊搜索另外的終止密碼子以檢驗該基因是否是完整的。在5』方向的3個三聯體後發現了終止密碼子。
為了得到作為全長克隆的基因，選擇允許完整基因擴增(末端-末端PCR)的引物。之後將PCR片段從瓊脂糖凝膠中純化出來並且克隆到pCR4-TOPO載體中。HvBgt1的全長核酸序列在SEQ ID No.1中說明，並且胺基酸序列在SEQ ID No.2中說明。
實施例8在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中與HvBgt1同源的基因的鑑定和克隆在得到大麥過氧化物酶(HvBgt1)的全長序列後，用此序列進行擬南芥基因組的BLAST搜索。鑑定了2種同源基因AtBgt1-1和AtBgt1-2。將這兩種基因用來自擬南芥cDNA的適當引物通過PCR擴增，並且克隆到植物表達載體pCambia中，所述載體具有組成啟動子以促進在擬南芥中過表達。
首先，使用Superscript First Strand Synthesis System forRT-PCR(INVITROGEN，Karlsruhe，德國)將總RNA轉錄成cDNA，所述總RNA來自未被感染的擬南芥植物和用鏈格孢和芸苔生鏈格孢(Alternaria brassicola)感染的擬南芥植物的混合物。
為了用鉑Pfx聚合酶(INVITROGEN，Karlsruhe，德國)通過PCR從cDNA中擴增出基因的全長序列，根據AtBgt1-1或AtBgt1-2序列設計引物。AtBgt1-2要被擴增的片段大小應當是1015bp。根據下列方案用兩種引物Fra335和Fra336進行AtBgt1-2序列的擴增10x聚合酶緩衝液，STRATAGENE(La Jolla，美國) 5μldNTP Mix(10mM)，INVITROGEN(Karlsruhe，德國) 1μlcDNA1μlFra335(20pmol) 1μlFra336(20pmol) 1μlTaq聚合酶(5U/μl) 1μlH2O 40μlFra335AGAAGTATGTTAAAGGTGGTGTTGTTGFra336TGACGAAGAGGTGATTATTGAGCPCR程序
在PCR片段從凝膠中純化後，將此序列亞克隆到pCRBlunt-II-TOPO載體(INVITROGEN，Karlsruhe，德國)中，並且轉化到TOP10大腸桿菌細胞中。通過藍白篩選選擇出包含構建體的菌落。從這些菌落中接種微量培養物以分離質粒DNA。每種片段用三個克隆進行了測序(DNA Laboratory，BASF AG，Ludwigshafen，德國)。克隆顯示為100％匹配序列，並且將片段用EcoRI從TOPO載體上切下並用凝膠電泳分離。將片段從凝膠中純化出來並且連接到用EcoRI切開的載體pCambia中。
實施例9大麥細胞的瞬時轉化、真菌病原體發育的過表達和評估用HvBgt1-DNA與GFP表達載體一起轉化大麥cv Pallas的葉節。之後用Bgh接種葉子並且依靠光學顯微術和螢光顯微術在48小時後分析結果。GFP表達細胞的侵入依靠檢測活細胞中的吸器和通過評估在這些相同的細胞中真菌的發育來估計。在所有6個實驗中，與用外源對照DNA(人甲狀腺激素受體，TR)轟擊的細胞相比，用HvBgt1轟擊大麥cv Pallas使得Bgh成功侵入的細胞量減少。
對於大麥細胞的瞬時轉化，使用了已經描述的關於在大麥葉的表皮細胞中生物射彈插入DNA的方法(Schweizer P等人(1999)Mol PlantMicrobe Interact 12647-54)。用HvBgt1-DNA和作為轉化標記的載體pGFP的質粒DNA(GFP被pUBI啟動子調控)一起來包被直徑為1.1μm的鎢顆粒(顆粒密度25mg/ml)。每次噴射使用下列量的DNA或報導基因質粒用於包被1μgpGFP和2μg DNA。
對於微載體的製備，55mg的鎢顆粒(M17，直徑1.1μm；Bio-Rad，Munich，德國)用1ml高壓滅菌的蒸餾水洗滌兩次並用1ml無水乙醇洗滌一次，乾燥並且重懸浮在1ml 50％的甘油中(大約50mg/ml的貯存液)。將此溶液用50％的甘油稀釋到25mg/ml，使用前充分混合併且懸浮在超聲浴中。對於微載體的包被，將(每次噴射)1μg質粒，2μgHvBgt1 DNA(1μL)，12.5μl鎢顆粒懸液(25mg/ml)，12.5μl 1M Ca(NO3)2溶液(pH 10)滴加到一起，同時持續攪拌，允許室溫下放置10分鐘，迅速離心並且從上清中移出20μl。包含鎢顆粒的剩餘物重懸浮在超聲浴中並且在實驗中使用。
對於轉化，使用長度約4cm的大麥初生葉節。將組織放在培養皿(6.5直徑)中的0.5％phytagar(GibcoBRLTMLife TechnologiesTM，Karlsruhe，Germany)和20μg/ml的苯並咪唑上，並且在顆粒轟擊前在邊緣用具有尺寸為2.2cm×2.3cm的矩形剪切塊的模板直接覆蓋。將培養皿一個接一個放在真空室的底部(chweizer P等人(1999)Mol Plant Microbe Interact12647-54)，穿過真空泵在穿孔板上(底部上面5cm，巨載體下11cm，見下)插入作為擴散器(diffusor)的尼龍網眼(網眼寬度0.2mm，Millipore，Eschborn)以分散任何的顆粒團並且減緩顆粒流。粘貼在頂部的巨載體(塑料無菌濾器附件，13mm，Gelman Sciences，Swinney，英國)用每次噴射5.8μl的DNA包被的鎢顆粒(微載體，見下)裝填。通過膜真空泵(Vacuubrand，Wertheim，德國)將室中的壓力減少至0.9巴，並且用9巴的氦氣壓將鎢顆粒噴射到植物組織的表面。之後立即向室中通風。對於轉化細胞的標記，用質粒pGFP(基於pUC18的載體，具有插入的GFP基因的CaMV 35S啟動子/終止子盒；Schweizer P等人(1999)Mol Plant MicrobeInteract 12647-54；Dr.P.Schweizer(Institute for Plant Genetics(IPK)，Gatersleben，德國)提供)噴射葉子。在每次噴射另一質粒前，用水徹底清洗巨載體。轟擊後，在培養皿輕微開啟、室溫和日光照射下培育4小時的時間後，用100個分生孢子/mm2的白粉病真菌(大麥禾布氏白粉菌，品種A6)接種葉子，並且在進行感染跡象分析前在同樣的條件下培育額外的36到48小時。
用螢光顯微術和光學顯微術測定結果(例如侵入效率，定義為顯示出成熟吸器和二級延伸菌絲的被攻擊細胞的百分比)。用100個分生孢子/mm2接種導致轉化的細胞大約為50％的感染頻率。對於每個單獨實驗，要估計最少100個相互作用區域。當用藍光刺激時鑑定轉化(GFP表達)的細胞。鑑定了三類不同的轉化細胞1.包含大麥可識別吸器的被侵入的細胞。具有多於一個吸器的細胞按一個細胞評估。
2.已經被真菌附著器攻擊卻不含吸器的細胞。被Bgh重複攻擊但是不含吸器的細胞按一個細胞評估。
3.未被Bgh攻擊的細胞。
本評估排除了氣孔細胞和氣孔次級細胞。依靠光學顯微術，或用0.1％的calcofluor(w/v在水中)將真菌螢光染色30秒來分析Bgh的表面結構。在用calcofluor染色後，依靠螢光顯微術可以容易地評估真菌的發育。儘管在HvBGt1-DNA轉化的細胞中真菌發育了初級和附著芽管，但是它沒有發育吸器。吸器發育是次級菌絲形成的先決條件。
相對侵入效率(RPE)計算為用HvBgt1轉化的細胞中侵入效率和用對照DNA轉化的細胞中的侵入效率之間的比。百分比RPE(％-RPE)計算為RPE減去1並乘以100。
％-RPE＝100×(RPE-1)％-RPE值(與對照的平均侵入效率的偏差)用來測定用HvBgt1 DNA轉染的細胞的易感性。
在5個獨立的實驗中，關於Bgh侵入效率，在用對照DNA轉染和水轉染之間沒有觀察到差異。
為了排除HvBgt1 DNA影響感染細胞的轉化率和生存率的可能性，對比了對照實驗和HvBgt1 DNA實驗間GFP表達細胞的數量。有趣的是，HvBgt1的過表達對總數目或受感染的GFP表達細胞的數目沒有影響。
實施例10用HvBgt1對擬南芥的轉化，以及真菌抗性分析在Bechtold等人的真空滲入法(Bechtold N等人(1993)CR Acad SciParis，Life Sciences 3161194-1199)的改良方法(Steve Clough和AndrewBent(1998)Plant J 16(6)735-743)的基礎上，用根瘤土壤桿菌菌株(EHA105)轉化野生型的擬南芥植物(Columbia)。使用適用於根瘤土壤桿菌轉化的二元表達載體如pCambia。
土壤桿菌轉化的初級轉化體的種子根據卡那黴素抗性進行篩選。將抗生素抗性的幼苗種植在土壤中，並且用作完全發育的植物用於生物化學分析。
為了分析轉基因擬南芥植物對病原體真菌的抗性，用活體營養的真菌寄生霜黴和二孢白粉菌進行接種。
a)寄生霜黴用分生孢子孢子懸液(大約106個孢子/ml)噴霧5到8周齡的植物。將接種的植物用塑膠袋覆蓋並且在大約16℃下冰箱中保持黑暗和潮溼過夜。第二天，輕輕打開塑膠袋，並且隨後完全移除。接種6天後，再次用塑膠袋覆蓋過夜，這能誘導孢子形成。在第二天，檢測葉子分生孢子梗的出現。在後面的幾天中，真菌的細胞間生長導致在葉子中引起較輕的缺綠症直到強壞死。將這些症狀定量並且測試了顯著性。
b)二孢白粉菌在擬南芥植物上培養活體營養的黴真菌。對於4周齡的表述轉基因HvBgt1的擬南芥植物的感染，用細小的刷子將分生孢子載體從葉子表面除去，並且刷到轉基因植物的葉子上。植物在20℃下培育7天。接種7天後，分生孢子載體在葉子上可見，並且在隨後的幾天後出現缺綠症和壞死。將這些症狀定量並且測試顯著性。
c)結果相比非轉基因野生型植物，表達HvBgt有義序列的轉基因擬南芥植物在大多數情況下表現出對寄生霜黴和對二孢白粉菌顯著增加的抗性。
相比非轉基因野生型植物，表達AtBgt1或HvBgt1反義序列的轉基因擬南芥植物表現出對寄生霜黴和對二孢白粉菌顯著增加的易感性。
1在非宿主相互作用(大麥(Ingrid)和Bgt)和宿主相互作用(大麥(Ingrid)和Bgh)中HvBgt1表達的時間進程的說明。
在表5中所示的相對表達數據用相關的標準差說明。結果顯示了在分析過程中非宿主相互作用中轉錄物的增加。
序列表110巴斯福植物科學有限公司120通過表達過氧化物酶在轉基因植物中增加病原體抗性的方法130B 766116012170PatentIn版本3.32101211945212DNA213大麥(Hordeum vulgare)4001atggcctcta cttcgtccct atcagtggtg ttgctcttgt gcctggccgt ggcggcgtcg 60gcgcagctgt cgccgacgtt ctaccaaacg acgtgcccga acgctctgtc caccatcaag 120gccgccgtga cggccgccgt gaacaatgag aaccgcatgg gcgcgtcgct gctccggctg 180cacttccacg actgcttcgt ccaaggttgt gacgcgtctg ttctgctgtc tggcatggaa 240caaaacgcgg cgccgaacgt catgtccctg cgaggcttcg aagtcataga cagcatcaag 300gcgaagctcg agaccatgtg caagcagacc gtctcctgcg ccgacatcct caccgtcgct 360gcccgcgatt ccgtcgtcgc cttgggaggg ccatcgtgga cggttccgct aggaaggagg 420gactccacca atgcaaacga agcagcggcg aactccgacc tacctccccc gttcttcgac 480ctcgtcaacc tcacccaatc cttcggcgac aagggcttca ccgtcaccga catggtcgcg 540ctctccggtg cccacaccat cggacaggcg cagtgccaga acttcaggga taggctctac 600aacgagacta acatcaactc cggcttcgcg acgtcgctca aggccaactg cccccggccg 660accggctccg gcgaccgcaa cctggccaat ctggacgtgt ctaccccgta ctcattcgac 720
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權利要求
1.產生分別具有增加的病原體抗性的轉基因植物和植物細胞的方法，其特徵在於將選自由i)包含由SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或這些序列的片段編碼的核苷酸序列的DNA序列，ii)DNA序列，其包含編碼具有在SEQ ID No.2或SEQ ID No.4中給出的胺基酸序列或其片段的蛋白質的核苷酸序列，iii)與在SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所給出的核苷酸序列有至少80％的序列同一性的DNA序列，和/或iv)包含核苷酸序列的DNA序列，所述核苷酸序列在嚴格條件下與i)到iii)的核苷酸序列的互補鏈雜交，構成的組並且編碼具有過氧化物酶活性的蛋白質的DNA序列插入到植物或植物細胞中並且在其中表達。
2.分離的核酸分子，其含有選自由下列DNA序列構成的組的核酸序列i)包含由SEQ ID No.1或此序列的片段編碼的核苷酸序列的DNA序列，ii)包含編碼具有在SEQ ID No.2中所述的胺基酸序列的蛋白質或其片段的核苷酸序列的DNA序列，iii)包含核苷酸序列的DNA序列，所述的核苷酸序列與在SEQ IDNo.1中所給出的核苷酸序列有至少80％的序列同一性，和/或iv)包含核苷酸序列的DNA序列，所述核苷酸序列在嚴格條件下與i)到iii)的核苷酸序列的互補鏈雜交。
3.根據權利要求2的核酸分子，其中所述核酸序列來自大麥。
4.重組過氧化物酶蛋白質，其由在權利要求1中給出的核酸序列編碼。
5.在5』-3』方向上包含下列元件的重組核酸分子-在植物細胞中有活性的啟動子的調節序列，-有效連接到其上的權利要求1給出的DNA序列，-任選地，有效連接到其上的在植物細胞中作為轉錄、終止、和/或加A信號的調節序列。
6.根據權利要求5的重組核酸分子，其特徵在於DNA序列在組成型啟動子，優選在35S CaMV或泛蛋白啟動子的控制下表達。
7.根據權利要求5的重組核酸分子，其特徵在於DNA序列在組織特異性啟動子的控制下表達。
8.根據權利要求7的重組核酸分子，其特徵在於組織特異性啟動子是表皮特異性啟動子、葉肉特異性啟動子或葉特異性啟動子。
9.根據權利要求5的重組核酸分子，其特徵在於DNA序列在誘導型啟動子的控制下表達。
10.根據權利要求9的重組核酸分子，其特徵在於誘導型啟動子是病原體誘導型啟動子或創傷誘導型啟動子。
11.根據權利要求1的產生具有增加的病原體抗性的轉基因植物的方法，其特徵在於該方法包括下列步驟a)產生根據權利要求5到10的任意一項的重組核酸分子，b)將步驟a)的重組核酸分子轉移到植物細胞中，並且任選地整合到植物基因組中，以及c)從轉化的植物細胞中再生植物。
12.轉基因植物細胞，其含有在權利要求1中所描述的核酸序列，或根據權利要求5到10的任意一項的重組核酸分子或通過根據權利要求1或11的方法得到。
13.根據權利要求12的轉基因植物細胞，它比野生型細胞具有增加含量的根據權利要求4的蛋白質。
14.根據權利要求12或13的轉基因植物細胞，它比野生型細胞具有增加的病原體抗性。
15.根據權利要求14的轉基因植物細胞，它對黴、鏽菌和/或殼針孢真菌具有增加的抗性。
16.根據權利要求15的轉基因植物細胞，它對黴的專化型具有增加的抗性。
17.轉基因植物，其含有根據權利要求12到16的任意一項的植物細胞或根據權利要求11產生、以及這些植物的部分、這些植物的轉基因收穫產物和轉基因繁殖材料，如原生質體、植物細胞、愈傷組織、種子、塊莖、插條以及此植物的轉基因後代。
18.根據權利要求17的轉基因植物，其特徵在於轉基因植物是單子葉植物，優選地屬於下列屬燕麥、小麥、黑麥、大麥、稻、黍屬、狼尾草、狗尾草、高粱、玉米等的植物。
19.根據權利要求17的轉基因植物，其特徵在於轉基因植物是雙子葉植物，優選地是棉花、豆科植物如豆類並且特別是苜蓿、大豆、油菜、芸苔、番茄、甜菜、馬鈴薯、觀賞植物、向日葵、菸草及樹。
20.在權利要求1中給出的DNA序列用於產生具有增加的病原體抗性的轉基因植物和植物細胞的用途。
21.權利要求1中給出的DNA序列用於鑑定對病原體表現出非宿主抗性的植物的用途。
22權利要求1中給出的DNA序列用作穀類中非宿主抗性標記的用途。
全文摘要
本發明涉及產生具有增加的病原體抗性的轉基因植物和/或植物細胞的方法，其特徵在於將編碼具有過氧化物酶活性的蛋白質的DNA序列插入植物中並且在其中表達。本發明還涉及編碼過氧化物酶的核酸在產生具有增加的病原體抗性的轉基因植物或植物細胞中的用途。本發明還涉及來自大麥的編碼過氧化物酶的核酸序列。
文檔編號A01H5/02GK1973045SQ200580020556
公開日2007年5月30日 申請日期2005年6月14日 優先權日2004年6月24日
發明者M·弗蘭克, R－M·史密特, S·施託伊德 申請人:巴斯福植物科學有限公司