鑑別含有核酸的對象物的方法
2023-05-20 14:55:56 2
鑑別含有核酸的對象物的方法
【專利摘要】本發明涉及鑑別含有核酸的對象物的方法，更確切而言，涉及包括如下步驟的鑑別含有核酸的對象物的方法：（1）製備含有核酸的對象物，所述核酸具有與RNA-雙探針的核苷酸序列互補的核苷酸序列；（2）使所述對象物中含有的核酸與含有所述RNA-雙探針和RNase的緩衝液進行反應，所述RNA-雙探針分別綴合有報告子和淬滅子；以及（3）對由所述報告子產生的螢光進行檢測。本發明的鑑別對象物的方法提供了相對於使用測序或螢光物質標記的傳統方法而言高達100倍的標記靈敏度，並具有如下優點：分析時間更短；便於根據螢光物質在大量產品上進行不同標記；以及通過差異化各寡核苷酸的核苷酸序列使得在現實生產過程中能夠實現按產品組和產品批次進行的無限產品管理。
【專利說明】鑑別含有核酸的對象物的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及鑑別含有核酸的對象物(object)的方法，更確切地說，涉及使用螢光來容易地鑑別含有核酸的對象物的方法，所述核酸具有被核糖核酸酶(RNase)識別的核苷酸序列。
【背景技術】
[0002]即使在樣品中所含的濃度極低，通過PCR (聚合酶鏈式反應)也能夠大規模擴增核酸(例如寡核苷酸)。並且，此類以非常少的量被包含的核酸可以通過分析核苷酸序列進行鑑別。因此，通過向目標對象物或產品(包括油製品如油或塗料、火藥和有價值的藝術作品等)中添加最低量的核酸，可以精確跟蹤對象物或產品的來源和運輸路徑，還可以對真品(genuine product)進行精確鑑定。已有的報導過使用此類寡核苷酸來研究產品的運輸路徑的文章如下:
[0003]美國專利號5，665，538描述了用於在水溶液中對石油類移動進行監測的方法。在該說明書中清楚地闡述了如下過程:將DNA作為微示蹤添加劑(microtrace additive)添加入石油類，然後在石油類移動後對含有DNA微示蹤添加劑的石油類進行採樣，隨後用PCR對DNA微示蹤添加劑進行檢測。美國專利號5，451，505描述了用於對暴露於自然UV中的對象物進行監測的方法。確切地說，為了確認目標對象物，收集核酸，隨後用PCR對該核酸進行擴増。同吋，EP1171633描述了用於對核酸進行定量檢測的方法，所述方法使用引物和螢光標記的探針作為核酸標籤通過實時PCR進行。然而，這些傳統方法的缺點在於，例如，它們不便於對濃度非常低的樣品進行定量分析；很難對樣品進行差異化的標記；存在被操作人員汙染或操縱(例如，消除)等的風險；以及因為對這樣的核酸進行檢測用時很長，因而很難商業化。
[0004]為了克服現有技術的局限，開發出了在親脂性溶劑中具有改善的溶解度的寡核苷酸和使用該寡核苷酸對目標對象 物進行檢測的方法(韓國專利號0851764);還開發出了寡核苷酸標記物和使用該寡核苷酸標記物對交通工具進行檢測的方法(韓國專利號0851765),所述寡核苷酸標記物在加入機動車的塗料膜(paint film)時,適於用作交通エ具的識別標籤或標記物。根據該方法，對以低濃度溶解於塗料中的寡核苷酸進行提取和回收，然後用PCR對核苷酸序列進行擴増。通過對該核苷酸序列進行測序，可以對目標對象進行跟蹤和確認。然而，在這種方法中，序列信息是編碼的，因此需要對編碼序列進行解碼這ー過程。此外，就測序而言，這ー過程的成本、精確度、處理時間以及複雜性這些問題也都是使得商業化難以進行的問題。也就是說，該方法在快速簡單地判別真品方面以及確認編碼信息(批號、製造商的獨特識別號等)方面存在問題。根據近來油製品供應多樣化的趨勢，篡改油等級及經銷非法汽油已經成為社會問題。因此，為了製造商品牌形象的管理和經銷秩序的建立，需要開發出更加快速且更加簡單有效的方法來對市場上油製品的種類和質量進行鑑別和識別。
【發明內容】
[0005]技術問題
[0006]本發明被設計為用以改善使用核酸識別對象物的傳統方法的問題。因此，本發明的目的是提供一種通過使用從核酸標記的對象物中回收的核酸而快速地鑑別所標記的核酸標記物的方法。
[0007]技術方案
[0008]所述鑑別含有核酸的對象物的方法包括下列步驟:
[0009](I)製備含有核酸的對象物，所述核酸具有與RNA-雙探針(RNA-dual probe)的核苷酸序列互補的核苷酸序列；
[0010](2)使所述對象物中含有的核酸與含有所述RNA-雙探針和RNase的緩衝液進行反應，所述RNA-雙探針分別綴合有報告子和淬滅子；以及
[0011](3)對由所述報告子產生的螢光進行檢測。
[0012]在本說明書中，術語「RNA-雙探針」是指雙標記的RNA探針，在所述RNA探針的結構中，報告子和淬滅子分別與RNA探針結合。報告子和淬滅子可綴合於所述RNA探針的任意位點，但更優選可綴合於所述RNA的兩端。
[0013]在步驟(I)中，核酸可為任何單鏈或雙鏈的DNA、RNA或DNA/RNA雜合體(DNA/RNA hybrid)，更優選可為單鏈DNA，但並不總限於此。本文中的含有核酸的對象物優選是液態的，例如石油類(如汽油、煤油和柴油)、用於機動車塗層的塗料(paint forautomobile coating)、漆(lacquer)、用於交通道指示的塗料、塗料稀釋劑(paintdiluent)、稀料(thinner).、火藥(gunpowder)、天然油(natural oil)、建築塗料(paint forconstruction)、有機溶劑、膠(glue)、染料、肉類以及海產食品,但並不總限於此。核酸優選為具有5-1，000個核苷酸、更優選為具有10-100個核苷酸的寡核苷酸，但不總限於此。RNA相對容易降解。因此，當對象物含有DNA吋，穩定性増加，這是更優選的。
[0014]在本發明的優選實施方式中，核酸可以與季銨鹽化合物或陽離子表面活性劑綴合，所述季銨鹽化合物或陽離子表面活性劑為陽離子相轉移劑。在本發明中，所述陽離子相轉移劑為燒基季銨離子(quaternary alkyl ammonium ion),例如四丁基氫氧化銨Ctetrabutyl ammonium hydroxide)或十バ燒是三甲塞溴化銨(hexadecyl trimethylammonium bromide)。核酸優選用封閉劑進行封閉，該封閉劑為典型的脂質或磷酸鹽/酷、或者為不具有端基(terminal group)的化學物質。
[0015]在本發明中，所述核酸的氮和氧位點(反應區域)特徵性地與C1-C5tl有機化合物綴合。該C1-C5tl有機化合物例如可為:與氮部分形成醯胺鍵和與氧部分形成酯鍵的羰基化合物、形成O-Si鍵與N-Si的娃燒化合物(silanyl compounds)、形成O-S鍵與N-S的磺醯基化合物、形成O-C鍵與N-C (當用氨進行處理時可斷裂)的飽和烴類、芳香烴類、不飽和烴類、含有雜原子的飽和烴類或不飽和烴類等。
[0016]同時，在用核酸對對象物進行標記或從對象物中回收核酸的方法方面沒有限制，因此可以使用任何常規方法。在本發明的優選實施方式中，可通過在核酸的3'端和/或5/端添加脂質來製備所述核酸。所述脂質可不受限地為C3-C 脂質、優選為C7-C24脂質。在本發明的優選實施方式中，可通過在3'端添加C12脂質、並在5'端添加C18脂質來製備所述核酸。可將所述核酸溶於石油類、優選汽油中，但不總限於此。此時，可在實驗前將陽離子相轉移劑加入核酸中，所述陽離子相轉移劑能通過靜電吸引與所述核酸的陰離子位點結合。在本發明的另ー優選實施方式中，通過加入陰離子相轉移劑(-PTA)使其與陽離子相轉移劑綴合，可以從對象物中回收該核酸，該陰離子相轉移劑可為陽離子相轉移劑(+PTA)的反荷離子(count-1on)。此時，陰離子相轉移劑(-PTA)可為陽離子相轉移劑(+PTA)的反荷離子(所述陽離子相轉移劑通過靜電吸引與有機溶劑中的核酸結合)；或者可不受限地使用可溶解於有機溶劑中的任何試劑。
[0017]在步驟(2)中，報告子和淬滅子可以分別與RNA-雙探針的5'端或3'端綴合。所述報告子優選為TAMRA (羧基四甲基羅丹明)、FAM (6-羧基螢光素)、Cy3、Cy5或Cy5.5 ;而所述淬滅子優選為BHQl (2，5- ニ叔丁基氫醌-1)、BHQ2、TAMRA或DABCYL，但不總限於此，並且實際上可以使用多種螢光物質，或者可以使用它們的任意組合。本文中的緩衝液不受限制，可使用具有合適於核酸擴增或核酸生化反應的常規成分的任何緩衝液。然而，更優選使用含有選自於由如下成分所組成的組中的ー種或多種成分的緩衝液:Tris、KC1、MgCl2,MnCl2和ニ硫蘇糖醇。本文中的緩衝液可選擇性包含RNase抑制劑。
[0018]RNase是降解RNA的酶，其可以分成兩種類型，如內切型(消化核苷酸序列的中間部分)和外切型(切割核苷酸序列的末端)。RNase具有廣泛的底物特異性，並涉及非常複雜的生理活性。在本發明中，RNase可以是能消化綴合物(在該綴合物中，對象物的核酸與RNA-雙探針綴合)中的RNA部分的任意隨機RNase,更優選RNase H。RNase H是ー種只特異性地消化單鏈DNA/單鏈RNA雜合體中的RNA的酶，其最早在1969年由W.H.Stein和 P.Hausen 從小牛胸腺中分離得到(Stein H, Hausen P.，Science, 1969,166 (903)，393-395)。這種酶在多種真核細胞(如動物細胞和酵母)和原核細胞(如大腸桿菌(E.coli))中均存在。RNase H是內切型酶，表現出底物特異性，並且只特定地消化DNA/RNA雜合體中的RNA鏈。這種酶的活化需要ニ價金屬離子，如Mg2+和Mn2+。在本發明的優選實施方式中，RNase H在20°C _90°C的溫度範圍中具有其活性。
[0019]在步驟(3)中，對螢光的檢測通過如下方式進行:使用合適的檢測裝置對由報告子所產生的處於特定波段的熒 光進行檢測。本文中的波長隨報告子的種類而變化，並不局限於特定的波段。
[0020]在本發明的優選實施方式中，將核酸從含有核酸的對象物中回收，然後與含有RNA-雙探針和RNase的緩衝液進行反應。確切而言，本發明的鑑別含有核酸的對象物的方法包括下列步驟:
[0021](I)製備含有核酸的對象物，所述核酸具有與RNA-雙探針的核苷酸序列互補的核苷酸序列；
[0022]( 2 )從所述對象物中回收所述核酸；
[0023](3)使所述對象物中含有的核酸與含有所述RNA-雙探針和RNase的緩衝液進行反應，所述RNA-雙探針分別綴合有報告子和淬滅子；以及
[0024](4)對由所述報告子產生的螢光進行檢測。
[0025]在本發明的優選實施方式中，通過如下過程容易確認目標對象物是否含有核酸:在含有RNA-雙探針和RNase H的反應緩衝液中，使從含有寡核苷酸的溶液中回收的寡核苷酸反應所需時間(優選I分鐘-1小吋、更優選5分鐘-10分鐘)後，測量螢光。根據這一方法，不存在純化DNA的步驟。因此，由細胞或其它基因組DNA的交叉汙染所造成的檢測到錯誤螢光信號的可能性實際上可以被消除。
[0026]在本發明的另ー優選實施方式中，證實本發明的方法通過測量報告子所產生的螢光而有利於查證產品的經銷渠道、產地以及辨別真品。確切而言，為鑑別各自含有不同核酸的產品，使各產品中所含的核酸與RNA-雙探針進行反應(該RNA-雙探針與所述產品的核酸互補結合)，然後進行螢光檢測。結果顯示，可以容易地確定哪種產品含有哪種核酸。
[0027]在本發明的另ー優選實施方式中，通過本發明的方法容易地證實了特定產品(例如油製品)是否為真品。例如，存在類似產品，在該產品中，真品油製品與非法油製品以1:1的比例混合。此時，如果將從真品油製品中測量到的螢光視為100，則類似產品的螢光水平將會為約50。根據這ー原理，油製品的經銷渠道、真假的辨別以及所含真品的比例可以很容易地進行確證。
[0028]發明的有益效果
[0029]根據本發明的方法，即使標記物寡核苷酸以極低的量包含於目標對象物中，仍可在短時間內(例如10分鐘內)以高精確度對其進行鑑定。在本發明中，寡核苷酸的大小或核苷酸序列可以變化，這表明可以進行各種標記，並且標記靈敏度可以隨各種螢光染料的不同組合的數量而增加。此外，本發明的鑑別含有核酸的對象物的方法提供了相對於使用測序或螢光物質標記的傳統方法而言高達100倍的標記靈敏度。另外，本發明方法的特徵為:分析時間更短；便於根據螢光物質在大量產品上進行不同標記；以及通過差異化各寡核苷酸的核苷酸序列使得在現實生產過程中能夠實現按產品組和產品批次進行的無限產品管理。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]參考附圖會最好地理解本發明優選實施方式的應用，其中:
[0031]圖1為說明加入RNase H的實驗組中的發射波長測量的圖。
[0032]圖2為說明發射值隨RNA-雙探針含量増加呈劑量依賴性增長的圖。
[0033]圖3為說明發射值隨RNase H含量增加而增長的圖。
[0034]圖4為說明隨RNase反應在固定溫度下進行而進行的螢光測量的圖。
[0035]圖5為說明對通過RNase反應所生成的螢光進行實時測量的ー組圖(無論螢光物質為何種種類)。在圖5A中，TAMRA和BHQ2分別用作報告子和淬滅子。在圖5B中，FAM和BHQl分別用作報告子和淬滅子。在圖5C中，Cy3和BHQ2分別用作報告子和淬滅子。在圖5D中，Cy5和BHQ2分別用作報告子和淬滅子。圖5E為將圖5A-圖的圖一起示出的圖。
[0036]圖6為說明甚至在小於10分鐘的測量時間內對由RNase活性所產生的突光進行測量的圖。
【具體實施方式】
[0037]如下列實施例所示，本發明的操作實施方式和目前優選的實施方式為說明性的。
[0038]然而，將理解的是，本發明技術人員在考慮到本公開的基礎上，可以在本發明的精神和保護範圍內做出修改和改進。
[0039]實施例
[0040]實施例1:含有核酸的對象物的製備，所述核酸具有與RNA-雙探針互補結合的核苷酸序列
[0041]〈1-1>寡核苷酸的製備
[0042]使用自動測序儀，在用於寡核苷酸合成的固定化載體(CPG)的表面上合成具有由SEQ.1D.NO:1所示的核苷酸序列的寡核苷酸(相當於IOmer模板DNA)。
[0043]5' -ACCGTGACGT-3' , MW=3027.96 (SEQ.1D.NO:1)
[0044]在用作模板的、具有由SEQ.1D.NO:1所示的核苷酸序列的寡核苷酸的合成中，可在其兩端都添加脂質。在本實施例中，向3'端添加C12脂質、井向5'端添加C18脂質，從而製備出本發明的寡核苷酸。
[0045]5' -C18-ACCGTGACGT-C12-3'
[0046]使用氨水(氨濃度:28%)從固定化載體(CPG)回收合成的寡核苷酸。具體而言，向氣密密封的固定化載體(CPGlOmg)中加入ImL的28被％氨水，然後在65°C下反應3小吋。然後，通過回收氨水來獲得處於溶液中的寡核苷酸。用寡核苷酸純化方法BioRP(Bioneer)對所述寡核苷酸進行純化。通過測量UV吸收(260nm)對溶液中的寡核苷酸進行定量。
[0047]〈1-2>含有寡核苷酸的汽油的製備
[0048]將實施例1中通過在3'端添加C12脂質、在5'端添加C18脂質而製得的寡核苷酸溶於蒸餾水中。將濃度調節至500D/mL。將溶於蒸餾水中的寡核苷酸以1000D的濃度加樣於15mL錐管(Corning)中。作為相轉移劑(PTA)，將陽離子相轉移劑(+PTA)十六烷基三甲基溴化銨(MW=364.5)在蒸餾水中稀釋至濃度為1.3mM，所述陽離子相轉移劑可能通過靜電吸引連接至寡核苷酸的陰離子位點。將其加入寡核苷酸中使總體積為3mL。向其中加入等體積的汽油(SK Oil Ref inery C0.)。將混合物用漩渦振蕩器充分混合至少I分鐘，在這個過程中，溶液中寡核苷酸的極性位點由於靜電吸引而結合至相轉移劑。結果顯示，寡核苷酸被中和，並溶解於汽油中。
[0049]〈1-3>從對象物中回收核酸
[0050]由於寡核苷酸穩定溶解於汽油中，很難簡單地通過加氨水後煮沸或與水混合使其溶於水層中。因此，向其中加入作為陽離子相轉移劑(+PTA)的反荷離子的陰離子相轉移劑(-PTA)，使得反荷離子與陽離子相轉移劑綴合、而不是與寡核苷酸綴合。結果顯示，可以用水萃取寡核苷酸。具體而言，將以0.5M的濃度溶於滅菌水中的HDEHP (雙(2-こ基己基)磷酸酷，M.W:322.42)加入實施例〈1-2>中製備的寡核苷酸/汽油混合物。將混合物在3，OOOrpm下離心10分鐘以使水層和有機溶劑層分離。取出在下部的水溶液，測量UV吸收。然後，回收存留在水層中的寡核苷酸。
[0051]實施例2:由RNase H引起的光發射
[0052]對從實施例〈1-3>中回收的寡核苷酸和RNA-雙探針中是否能觀察到由RNase H引起的光發射進行了研究。合成實施例〈1-3>中回收的具有由SEQ.1D.NO:1所示的核苷酸序列的寡核苷酸(3'端添加有C12脂質、5'端添加有C18脂質)以及具有由SEQ.1D.NO:2所示的核苷酸序列(與寡核苷酸序列互補)的RNA-雙探針(見表I)。本發明中使用的RNA-雙探針的長度為lOmer，其5'端標記有螢光物質報告子TAMRA、3'端標記有淬滅子BHQ2。
[0053]通過下列步驟證實了由RNase H引起的螢光發射。在特定溫度下，使用基因擴增儀(MyGenie96 ;Bioneer)證實了 RNase H與核苷酸/RNA-雙探針綴合物的反應。並且,還通過使用螢光分光光度計(SHIMADZU)證實了由RNase H引起的螢光發射。此時，將不含有RNase H的樣品用作對照。
[0054](I)如表2所示，製備總共20 ii L的樣品。
[0055](2)在基因擴增儀(MyGenie96)中，通過以0.5V /sec的升溫速率從20°C升溫至90°C來誘發反應。
[0056](3)反應完成後，將反應混合物與1，980mL的IM Tris-HCl混合，然後用螢光分光光度計(SHIMADZU)測量螢光波長。
[0057]表I
[0058]
【權利要求】
1.一種鑑別含有核酸的對象物的方法，所述方法包括如下步驟: (1)製備含有核酸的對象物，所述核酸具有與RNA-雙探針的核苷酸序列互補的核苷酸序列； (2)使所述對象物中含有的核酸與含有所述RNA-雙探針和RNase的緩衝液進行反應，所述RNA-雙探針分別綴合有報告子和淬滅子；以及 (3)對由所述報告子產生的螢光進行檢測。
2.如權利要求1所述的方法，其中，所述核酸選自於由DNA、RNA和DNA-RNA雜合體所組成的組。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述核酸是單鏈DNA。
4.如權利要求1或2所述的方法，其中，所述核酸在3'端和/或5'端添加有脂質。
5.如權利要求4所述的方法，其中，所述脂質是C7-C24脂質。
6.如權利要求1所述的方法，其中，所述含有核酸的對象物是液態對象物。
7.如權利要求1所述的方法，其中，所述含有核酸的對象物選自於由如下對象物所組成的組:汽油、煤油、柴油·、用於機動車塗層的塗料、漆、用於交通道指示的塗料、塗料稀釋齊U、稀料、火藥、天然油、建築塗料、有機溶劑、膠、染料、肉類以及海產食品。
8.如權利要求1所述的方法，其中，所述核酸具有包含5-1，OOO個核苷酸的核苷酸序列。
9.如權利要求1所述的方法,其中,所述RNase是RNaseH。
10.如權利要求1或9所述的方法，其中，所述RNaseH在20°C _90°C的溫度範圍中具有活性。
11.如權利要求1所述的方法，其中，所述報告子和所述淬滅子與所述RNA-雙探針的5/端或3'端綴合。
12.如權利要求11所述的方法，其中，所述報告子選自於由TAMRA(羧基四甲基羅丹明)、FAM (6-羧基螢光素)、Cy3、Cy5和Cy5.5所組成的組。
13.如權利要求11所述的方法，其中，所述淬滅子選自於由BHQl(2，5_ ニ叔丁基氫醌-1 )、BHQ2、TAMRA和DABCYL所組成的組。
14.如權利要求1所述的方法，其中，所述緩衝液包含選自於由Tris、KCl、MgCl2、MnCl2和ニ硫蘇糖醇所組成的組中的ー種或多種組分。
15.如權利要求1或14所述的方法，其中，所述緩衝液還含有RNase抑制劑。
16.—種鑑別含有核酸的對象物的方法，所述方法包括如下步驟: (1)製備含有核酸的對象物，所述核酸具有與RNA-雙探針的核苷酸序列互補的核苷酸序列； (2)從所述對象物中回收所述核酸； (3)使所述對象物中含有的核酸與含有所述RNA-雙探針和RNase的緩衝液進行反應，所述RNA-雙探針分別綴合有報告子和淬滅子；以及 (4)對由所述報告子產生的螢光進行檢測。
17.一種確認含有核酸的對象物是否為真的方法，所述方法包括如下步驟: (I)製備含有核酸的對象物，所述核酸具有與RNA-雙探針的核苷酸序列互補的核苷酸序列；(2)使所述對象物中含有的核酸與含有所述RNA-雙探針和RNase的緩衝液進行反應，所述RNA-雙探針分別綴合有報告子和淬滅子；以及 (3)對由所述報告子產生的螢光進行檢測。
18.如權利要求17所述的方法，其中，所述含有核酸的對象物選自於由如下對象物所組成的組:汽油、煤油、柴油、用於機動車塗層的塗料、漆、用於交通道指示的塗料、塗料稀釋齊U、稀料、火藥、天然油 、建築塗料、有機溶劑、膠、染料、肉類以及海產食品。
【文檔編號】G01N33/52GK103429758SQ201280013351
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2012年3月13日 優先權日:2011年3月14日
【發明者】樸翰浯, 崔正榮, 韓殷洙, 宋邱永, 蔣沅錫 申請人:株式會社百奧尼