一種高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉含量的方法
2023-05-21 09:34:31 1
一種高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉含量的方法
【專利摘要】本發明涉及生物醫療【技術領域】，提供了一種高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉含量的方法，包括配製37.6μg/ml的丙戊酸鈉標準溶液、多種濃度丙戊酸鈉工作液、配製50.2μg/ml的環己烷羧酸內標溶液、空白標樣、正常人血液標樣、病人血液標樣，放入色譜儀裡繪製色譜圖，根據色譜圖判斷病人血液裡面是否含有丙戊酸鈉；然後色譜儀根據正常人血液標樣色譜圖繪製丙戊酸鈉標準曲線，再根據病人血液標樣色譜圖的丙戊酸鈉峰值、環己烷羧酸內標溶液的峰值、丙戊酸鈉標準曲線計算出病人血液中丙戊酸鈉的含量。本發明有效解決了色譜圖中雜峰多、靈敏度低、精確度低、成本高、不能繪製出丙戊酸鈉標準曲線的問題。
【專利說明】一種高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉含量的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物醫療【技術領域】，特別涉及一種高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉含量的方法。
【背景技術】
[0002]丙戊酸鈉是臨床常用的廣譜抗癲癇、治療情感性精神障礙的藥物，尤其對單純失神發作、全身性強直、陳攣發作、肌陳攣發作療效顯著，對單純部分性發作、複雜部分性發作具有顯著療效，有效血藥濃度範圍為50-100 ii g/mlo但丙戊酸鈉體內過程和療效個體差異大，劑量與血藥濃度的相關性不穩定，且血藥濃度過高易引起噁心、嘔吐及肝功能損害等不良反應，因而通過檢測血藥濃度來調整劑量，是確保療效和用藥安全的必要手段。
[0003]目前，測定體內丙戊酸鈉血藥濃度最常用的方法為螢光偏振免疫法，需要採用專用的試劑盒，價格昂貴，也不能分離和排除丙戊酸鈉代謝產物和內源性雜質的幹擾，造成測量精度低的問題。
[0004]因此，生物醫療【技術領域】急需一種雜峰少、靈敏度高、精確度高、成本低廉、能夠繪製出丙戊酸鈉標準曲線的高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉含量的方法。
【發明內容】
[0005]為了克服現有技術測定丙戊酸鈉血藥濃度價格貴、精度低的缺陷，本發明提供一種高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉含量的方法，技術方案如下:
[0006]一種高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉含量的方法，其特徵在於，包含以下步驟:
[0007]第一步，配製37.6 u g/ml的的丙戊酸鈉標準溶液；
[0008]首先，稱取分析純丙戊酸鈉37.6mg，放入50mL容量瓶中，然後將0.2mol/l的分析純氨水倒入裝有丙戊酸鈉的容量瓶中，稀釋至50ml刻度為止，搖勻；
[0009]第二步，稀釋丙戊酸鈉標準溶液，製成丙戊酸鈉工作液；
[0010]從第一步中的50ml丙戊酸鈉標準溶液容量瓶中，分別取出200 裝入8個容量瓶中，向這8個容量瓶中倒入0.2mol/l的分析純氨水，將丙戊酸鈉標準溶液分別稀釋成濃度為 18.80,37.60,56.40,75.20,94.00,112.80,127.84、150.40 u g/ml 的丙戊酸鈉工作液備用;
[0011]第三步，配製50.2 y g/ml的的環己烷羧酸內標溶液；
[0012]首先，稱取分析純環己烷羧酸37.6mg，放入50mL容量瓶中，然後將0.2mol/l的分析純氨水倒入裝有環己烷羧酸的容量瓶中，稀釋至50ml刻度為止，搖勻；
[0013]第四步，配製5.016mg/ml衍生化試劑，並放置於冰箱中貯存；
[0014]首先，稱取分析純W-溴苯乙酮125.4mg，放入25mL容量瓶中，然後將色譜純乙腈倒入裝有W-溴苯乙酮的容量瓶中，稀釋至25ml刻度為止，搖勻，放置於冰箱中貯存；
[0015]第五步，配製IOOOml流動相；[0016]首先將750ml分析純甲醇倒入IOOOml的容量瓶中，然後向裝有甲醇的容量瓶中倒入250ml去離子水，搖勻；
[0017]第六步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，作為空白標樣；
[0018]第七步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然後量取30 μ I環己烷羧酸內標溶液，倒入裝有正常人血清的具塞抽提管中，作為標樣I ;
[0019]第八步，取200μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然後量取200 μ I丙戊酸鈉標準溶液，倒入裝有正常人血清的具塞抽提管中，作為標樣2 ；
[0020]第九步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然後量取30 μ I環己烷羧酸內標溶液和200 μ I丙戊酸鈉標準溶液,依次倒入裝有正常人血清的具塞抽提管中，作為標樣3 ；
[0021]第十步，分別取200 μ I正常人的血清加入8支IOml具塞抽提管中，然後這8支具塞抽提管中分別加入30 μ I環己烷羧酸內標溶液和200 μ I的18.80,37.60,56.40,75.20、94.00,112.80,127.84、150.40 μ g/ml 的丙戊酸鈉工作液，作為標樣 4、5、6、7、8、9、10、11 ；
[0022]第十一步，取200 μ I病人的血清加入IOml具塞抽提管中，然後量取30 μ I環己烷羧酸內標溶液，倒入裝有病人血清的具塞抽提管中，作為標樣12 ；
[0023]第十二步，首先分別向空白標樣、標樣1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12中加入200 μ I的lmol/1硫酸，搖勻後再分別加入4ml色譜純正己烷，都漩渦混勻5分鐘，靜置5分鐘後，分別進行3000r/min的離心運動10分鐘；
[0024]第十三步，分別從離心後的空白標樣、標樣1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12中移取
2ml上清液至13支潔淨的IOml具塞抽提管中，分別向13支具塞抽提管中加入40 μ I衍生化試劑、20 μ I分析純三乙胺，漩渦混勻後，放置於63°C水浴衍生10分鐘，然後在氮氣流下
蒸發至完全乾燥；
[0025]第十四步，首先將取出的殘留物分別用300μ I流動相漩渦混勻、溶解，然後將溶解物分別吸入13支尖底離心管中，進行4000r/min離心運動10分鐘；
[0026]第十五步，分別從13支尖底離心管中取出15 μ 1，放入13支試管中，再將13支試管放入色譜儀中進行光譜測量，得出13張色譜圖；
[0027]第十六步，根據空白標樣、標樣1、標樣2、標樣3的比較可以判斷出環己烷羧酸內標溶液的峰，丙戊酸鈉標準溶液的峰；進一步地，根據標樣3的色譜圖可以判斷出標樣12中是否含有丙戊酸鈉產生的峰，隨即判斷出病人血液中是否含有丙戊酸鈉；進一步地，色譜儀根據標樣4、5、6、7、8、9、10、11的色譜圖，繪製出丙戊酸鈉標準曲線，色譜儀根據標樣12的丙戊酸鈉峰值、環己烷羧酸峰值與丙戊酸鈉標準曲線，可以計算出病人血液內的丙戊酸鈉含量。
[0028]進一步地，一種高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉的方法，其中，空白標樣的色譜圖為一條接近於平滑的直線。
[0029]進一步地，一種高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉的方法，其中，丙戊酸鈉的出峰時間為10.67±0.55分。
[0030]進一步地，一種高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉的方法，其中，丙戊酸鈉標準曲線的斜率為0.9994 ± 0.0005。
[0031]本發明的有益效果是:[0032]1.本發明能夠繪製出丙戊酸鈉標準曲線，與病人的丙戊酸鈉色譜圖相比較，可以計算出病人血液中丙戊酸鈉的含量。
[0033]2.本發明使用的實驗儀器少、操作簡單、靈敏度高、精確度高。
[0034]3.本發明採用色譜儀生成的色譜圖雜峰少，具有更好的辨識度。
[0035]4.本發明檢測成本低廉，提高了經濟效益。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0036]下面結合附圖和【具體實施方式】來詳細說明本發明:
[0037]圖1是本發明的空白標樣產生的色譜圖。
[0038]圖2是本發明的標樣I產生的色譜圖。
[0039]圖3是本發明的標樣2產生的色譜圖。
[0040]圖4是本發明的標樣3產生的色譜圖。
[0041]圖5是本發明的標樣12產生的色譜圖。
[0042]圖6是本發明根據標樣4、5、6、7、8、9、10、11繪製出的丙戊酸鈉標準曲線。
【具體實施方式】
[0043]為了使本發明的技術手段、創作特徵、達成目的與功效易於明白了解，下面結合具體圖示，進一步闡述本發明。
[0044]本發明的具體實施步驟如下:
[0045]第一步，配製37.6 μ g/ml的的丙戊酸鈉標準溶液；
[0046]首先，稱取分析純丙戊酸鈉37.6mg，放入50mL容量瓶中，然後將0.2mol/l的分析純氨水倒入裝有丙戊酸鈉的容量瓶中，稀釋至50ml刻度為止，搖勻；
[0047]第二步，稀釋丙戊酸鈉標準溶液，製成丙戊酸鈉工作液；
[0048]從第一步中的50ml丙戊酸鈉標準溶液容量瓶中，分別取出200 μ I裝入8個容量瓶中，向這8個容量瓶中倒入0.2mol/l的分析純氨水，將丙戊酸鈉標準溶液分別稀釋成濃度為 18.80,37.60,56.40,75.20,94.00,112.80,127.84、150.40 μ g/ml 的丙戊酸鈉工作液備用;
[0049]第三步，配製50.2 μ g/ml的的環己烷羧酸內標溶液；
[0050]首先，稱取分析純環己烷羧酸37.6mg，放入50mL容量瓶中，然後將0.2mol/l的分析純氨水倒入裝有環己烷羧酸的容量瓶中，稀釋至50ml刻度為止，搖勻；
[0051]第四步，配製5.016mg/ml衍生化試劑，並放置於冰箱中貯存；
[0052]首先，稱取分析純W-溴苯乙酮125.4mg，放入25mL容量瓶中，然後將色譜純乙腈倒入裝有W-溴苯乙酮的容量瓶中，稀釋至25ml刻度為止，搖勻，放置於冰箱中貯存；
[0053]第五步,配製IOOOml流動相；
[0054]首先將750ml分析純甲醇倒入IOOOml的容量瓶中，然後向裝有甲醇的容量瓶中倒入250ml去離子水，搖勻；
[0055]第六步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，作為空白標樣；
[0056]第七步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然後量取30 μ I環己烷羧酸內標溶液，倒入裝有正常人血清的具塞抽提管中，作為標樣I ;[0057]第八步，取200iU正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然後量取200 丙戊酸鈉標準溶液，倒入裝有正常人血清的具塞抽提管中，作為標樣2 ；
[0058]第九步，取200 U I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然後量取30 μl環己烷羧酸內標溶液和200 ii I丙戊酸鈉標準溶液,依次倒入裝有正常人血清的具塞抽提管中，作為標樣3 ；
[0059]第十步，分別取200 ill正常人的血清加入8支IOml具塞抽提管中，然後這8支具塞抽提管中分別加入30 u I環己烷羧酸內標溶液和200 u I的18.80,37.60,56.40,75.20、94.00,112.80,127.84、150.40 u g/ml 的丙戊酸鈉工作液，作為標樣 4、5、6、7、8、9、10、11 ；
[0060]第十一步，取200 ill病人的血清加入IOml具塞抽提管中，然後量取30 ill環己烷羧酸內標溶液，倒入裝有病人血清的具塞抽提管中，作為標樣12 ；
[0061]第十二步，首先分別向空白標樣、標樣1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12中加入200 u I的lmol/1硫酸，搖勻後再分別加入4ml色譜純正己烷，都漩渦混勻5分鐘，靜置5分鐘後，分別進行3000r/min的離心運動10分鐘；
[0062]第十三步，分別從離心後的空白標樣、標樣1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12中移取
2ml上清液至13支潔淨的IOml具塞抽提管中，分別向13支具塞抽提管中加入40 U I衍生化試劑、20 Ul分析純三乙胺，漩渦混勻後，放置於63°C水浴衍生10分鐘，然後在氮氣流下
蒸發至完全乾燥；
[0063]第十四步，首先將取出的殘留物分別用300iU流動相漩渦混勻、溶解，然後將溶解物分別吸入13支尖底離心管中，進行4000r/min離心運動10分鐘；
[0064]第十五步，分別從13支尖底離心管中取出15 iil，放入13支試管中，再將13支試管放入色譜儀中進行光譜測量，得出13張色譜圖；
[0065]第十六步，根據空白標樣、標樣1、標樣2、標樣3的比較可以判斷出環己烷羧酸內標溶液的峰值，丙戊酸鈉標準溶液的峰值；進一步地，根據標樣3的色譜圖可以判斷出標樣12中是否含有丙戊酸鈉；圖1是本發明的空白標樣產生的色譜圖，為一條空白的直線；圖2是本發明的標樣I產生的色譜圖，101為環己烷羧酸內標溶液產生的峰；圖3是本發明的標樣2產生的色譜圖，102為丙戊酸鈉標準溶液產生的峰；圖4是本發明的標樣3產生的色譜圖，既含有101環己烷羧酸內標溶液產生的峰，又含有102丙戊酸鈉溶液產生的峰；進一步地，根據標樣3的色譜圖可以判斷出標樣12中是否含有丙戊酸鈉產生的峰，隨即判斷出病人血液中是否含有丙戊酸鈉；進一步地，色譜儀根據標樣4、5、6、7、8、9、10、11的色譜圖，繪製出圖6，圖6是本發明的丙戊酸鈉標準曲線，圖5是本發明的標樣12產生的色譜圖，色譜儀根據根據圖5中標樣12的丙戊酸鈉峰值、環己烷羧酸峰值與圖6中丙戊酸鈉標準曲線，可以計算出病人血液內的丙戊酸鈉含量。
[0066]圖1中空白標樣的色譜圖為一條接近於平滑的直線。
[0067]丙戍酸鈉的出峰時間為10.67 ±0.55分。
[0068]丙戊酸鈉標準曲線的斜率為0.9994 ±0.0005。
[0069]下面舉例幾組具體實施例，說明病人血液內的丙戊酸鈉含量的測試:
[0070]實施例一:在以吸光度為縱坐標，時間為橫坐標的色譜圖上得出環己烷羧酸內標溶液在保留時間為5.749時的峰以及病人血液內的丙戊酸鈉在保留時間為10.639時的峰，根據圖6中丙戊酸鈉的標準曲線，儀器自動計算出病人血液內的丙戊酸鈉含量為39.23637ng/ul。
[0071]實施例二:在以吸光度為縱坐標，時間為橫坐標的色譜圖上得出環己烷羧酸內標溶液在保留時間為5.743時的峰以及病人血液內的丙戊酸鈉在保留時間為10.671時的峰，根據圖6中丙戊酸鈉的標準曲線，儀器自動計算出病人血液內的丙戊酸鈉含量為64.77381ng/ul。
[0072]實施例三:在以吸光度為縱坐標，時間為橫坐標的色譜圖上得出環己烷羧酸內標溶液在保留時間為5.752時的峰以及病人血液內的丙戊酸鈉在保留時間為10.658時的峰，根據圖6中丙戊酸鈉的標準曲線，儀器自動計算出病人血液內的丙戊酸鈉含量為118.66935ng/ul。
[0073]以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等同物界定。
【權利要求】
1.本發明的一種高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉含量的方法，其特徵在於，包含以下步驟: 第一步，配製37.6 μ g/ml的的丙戊酸鈉標準溶液； 首先，稱取分析純丙戊酸鈉37.6mg，放入50mL容量瓶中，然後將0.2mol/l的分析純氨水倒入裝有丙戊酸鈉的容量瓶中，稀釋至50ml刻度為止，搖勻； 第二步，稀釋丙戊酸鈉標準溶液，製成丙戊酸鈉工作液； 從第一步中的50ml丙戊酸鈉標準溶液容量瓶中，分別取出200 μ I裝入8個容量瓶中，向這8個容量瓶中倒入0.2mol/l的分析純氨水，將丙戊酸鈉標準溶液分別稀釋成濃度為 18.80,37.60,56.40,75.20,94.00,112.80,127.84、150.40 μ g/ml 的丙戊酸鈉工作液備用； 第三步，配製50.2 μ g/ml的的環己烷羧酸內標溶液； 首先，稱取分析純環己烷羧酸37.6mg，放入50mL容量瓶中，然後將0.2mol/l的分析純氨水倒入裝有環己烷羧酸的容量瓶中，稀釋至50ml刻度為止，搖勻； 第四步，配製5.016mg/ml衍生化試劑，並放置於冰箱中貯存； 首先，稱取分析純W-溴苯乙酮125.4mg，放入25mL容量瓶中，然後將色譜純乙腈倒入裝有W-溴苯乙酮的容量瓶中，稀釋至25ml刻度為止，搖勻，放置於冰箱中貯存； 第五步，配製IOOOml流動相； 首先將750ml分析純甲醇倒入IOOOml的容量瓶中，然後向裝有甲醇的容量瓶中倒入.250ml去離子水，搖勻； 第六步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，作為空白標樣； 第七步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然後量取30 μ I環己烷羧酸內標溶液，倒入裝有正常人血清的具塞抽提管中，作為標樣I ; 第八步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然後量取200 μ I丙戊酸鈉標準溶液，倒入裝有正常人血清的具塞抽提管中，作為標樣2 ； 第九步，取200 μ I正常人的血清加入IOml具塞抽提管中，然後量取30 μ I環己烷羧酸內標溶液和200 μ I丙戊酸鈉標準溶液,依次倒入裝有正常人血清的具塞抽提管中，作為標樣3 ；第十步，分別取200 μ I正常人的血清加入8支IOml具塞抽提管中，然後這8支具塞抽提管中分別加入30 μ I環己烷羧酸內標溶液和200 μ I的18.80,37.60,56.40,75.20、.94.00,112.80,127.84,150.40 μ g/ml 的丙戊酸鈉工作液，作為標樣 4、5、6、7、8、9、10、11 ；第十一步，取200 μ I病人的血清加入IOml具塞抽提管中，然後量取30 μ I環己烷羧酸內標溶液，倒入裝有病人血清的具塞抽提管中，作為標樣12 ； 第十二步，首先分別向空白標樣、標樣1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12中加入200μ I的lmol/1硫酸，搖勻後再分別加入4ml色譜純正己烷，都漩渦混勻5分鐘，靜置5分鐘後，分別進行3000r/min的離心運動10分鐘； 第十三步，分別從離心後的空白標樣、標樣1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12中移取2ml上清液至13支潔淨的IOml具塞抽提管中，分別向13支具塞抽提管中加入40 μ I衍生化試齊!Κ20μ I分析純三乙胺，漩渦混勻後，放置於63°C水浴衍生10分鐘，然後在氮氣流下蒸發至完全乾燥；第十四步，首先將取出的殘留物分別用300μ I流動相漩渦混勻、溶解，然後將溶解物分別吸入13支尖底離心管中，進行4000r/min離心運動10分鐘； 第十五步，分別從13支尖底離心管中取出15 μ 1，放入13支試管中，再將13支試管放入色譜儀中進行光譜測量，得出13張色譜圖； 第十六步，根據空白標樣、標樣1、標樣2、標樣3的比較可以判斷出環己烷羧酸內標溶液的峰值，丙戊酸鈉標準溶液的峰值；進一步地，根據標樣3的色譜圖可以判斷出標樣12中是否含有丙戊酸鈉產生的峰，隨即判斷出病人血液中是否含有丙戊酸鈉；進一步地，色譜儀根據標樣4、5、6、7、8、9、10、11的色譜圖，繪製出丙戊酸鈉標準曲線，色譜儀根據標樣12的丙戊酸鈉峰值、環己烷羧酸峰值與丙戊酸鈉標準曲線，可以計算出病人血液內的丙戊酸鈉含量。
2.如權利要求1所述的一種高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉的方法，其特徵在於，該空白標樣的色譜圖為一條接近於平滑的直線。
3.如權利要求1所述的一種高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉的方法，其特徵在於，丙戊酸鈉的出峰時間為?ο.67±0. 55分。
4.如權利要求1所述的一種高效液相色譜檢測血液中丙戊酸鈉的方法，其特徵在於，丙戊酸鈉標準曲線的斜率為0.9994±0.0005。
【文檔編號】G01N30/88GK103454369SQ201310407728
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月9日 優先權日:2013年9月9日
【發明者】馮娟, 甄燕 申請人:上海蘭衛臨床檢驗有限公司